Artigo de método

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

DOI:

10.3791/60503

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18 de dezembro de 2019

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1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a microdissecção da captação do laser para a isolação da cartilagem e do osso das seções congeladas frescas do embrião do rato. Cartilagem e osso podem ser rapidamente visualizados por manchas violetas cresyl e coletados precisamente para produzir RNA de alta qualidade para análise transcriptômica.

Resumo

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A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos específicos de células ou regiões de interesse de tecidos heterogêneos. A complexidade celular e molecular de elementos esqueléticos aumenta com o desenvolvimento. A heterogeneidade tecidual, como na interface de elementos cartilaginosos e osseos uns com os outros ou com tecidos circundantes, é um obstáculo para o estudo do desenvolvimento de cartilagem e osso. Nosso protocolo fornece um método rápido de processamento de tecidos e isolamento de cartilagem e osso que produz RNA de alta qualidade para análise de expressão gênica. Os tecidos congelados frescos de embriões do rato são seccionados e a mancha violeta breve do cresyl é usada para visualizar a cartilagem e o osso com as cores distintas dos tecidos circunvizinhos. Slides são então rapidamente desidratados, e cartilagem e osso são isolados posteriormente por LCM. A minimização da exposição a soluções aquosas durante este processo mantém a integridade do RNA. A cartilagem e osso mandibular do rato Meckel na E16.5 foram coletados com sucesso e a análise da expressão gênica mostrou expressão diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteócitos, osteoclastos e condrocitos. O RNA de alta qualidade também foi isolado de uma variedade de tecidos e idades embrionárias. Este protocolo detalha a preparação da amostra para LCM que inclui o cryoembedding, seção, coloração e desidratação de tecidos congelados frescos, e a isolação precisa da cartilagem e do osso por LCM tendo por resultado o RNA de alta qualidade para a análise transcriptomic.

Introdução

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O sistema musculoesquelético é um sistema multicomponente composto de músculo, tecido conjuntivo, tendão, ligamento, cartilagem e osso, interno e vascularizado pelos vasos sanguíneos1. Os tecidos esqueléticos desenvolvem-se com o aumento da heterogeneidade celular e complexidade estrutural. Cartilagem e osso se desenvolvem a partir da mesma linhagem osteochondroprogenitor e são altamente relacionados. Cartilagem embrionária e osso se desenvolvem em associação com músculos, nervos, vasos sanguíneos e mesenchyme indiferenciado. A cartilagem também pode ser cercada por ossos, como a cartilagem de Meckel e cartilagem condylar dentro do osso mandibular. Estes tecidos são anatomicamente associados e interagem uns com os outros através de sinais extracelulares durante o desenvolvimento. No estudo da expressão gênica no desenvolvimento de cartilagem e osso, um obstáculo é a heterogeneidade de estruturas esqueléticas compostas por múltiplos tipos de tecido. O isolamento preciso do tecido específico de interesse é fundamental para uma análise transcricional bem-sucedida.

A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos de células ou regiões de interesse dentro de tecidos heterogêneos, e é reproduzível e é sensível ao nível de célula única2. Ele pode precisamente alvo e capturar células de interesse para uma ampla gama de ensaios a jusante em transcriptômica, genômica e proteômica3,4. A qualidade do RNA, DNA ou proteína isolado pode ser avaliada com um bioanalisador ou plataforma equivalente. Por exemplo, a qualidade do RNA é indicada pelo número de integridade do RNA (RIN)5.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para a coloração rápida e isolamento da cartilagem e osso por LCM de tecidos congelados frescos. Usamos o embrião do camundongo para demonstrar que este protocolo produz RNA de alta qualidade para análise transcriptômica subsequente, como sequenciamento de RNA (RNA-seq).

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Protocolo

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Tecidos de camundongos foram obtidos de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, e protocolos de estudo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Icahn School of Medicine no Monte Sinai.

1. Preparação de espécime congelado fresco

  1. Dissecar o embrião ou tecido de interesse. Incorporar a amostra em um molde de incorporação descartável com temperatura de corte ideal (OCT) composto. Ajuste a orientação do espécime com uma ponta ou agulha.
  2. Congele rapidamente as amostras em um banho seco de gelo/metil-2-butano. Continue para o próximo passo ou armazenar a -80 °C.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Criossecagem para Microdissese de Captura a Laser

  1. Descongele o criostat e limpe superfícies internas com 70% de etanol. Trate a placa anti-rolo e um par de fórceps com agente de descontaminação RNase. Defina o criostat a temperatura de corte desejada (-18 a -22 °C). Prepare um recipiente com tampa com gelo seco, colocando uma folha de alumínio no gelo seco para armazenamento temporário das lâminas de amostra seccionadas durante a criossecção.
    CUIDADO: O gelo seco é extremamente frio. Sempre lidar com gelo seco com cuidado e usar luvas isoladas sempre manuseá-lo.
  2. Transfira o espécime congelado fresco em um balde de gelo seco. Coloque uma camada de composto OCT em um suporte de espécime criostat e coloque imediatamente o espécime em cima do OCT com pressão suave. Quando oct está completamente congelado, aperte o suporte com o espécime no braço de corte criostat.
  3. Deixe a amostra no criostat por 15 min para equilibrar a temperatura de corte.
  4. Seção o tecido e recolher as fatias de polietileno naftalato (PEN) desliza membrana em uma espessura de 12 μm. Alinhar seções consecutivas na membrana. Uma vez que um slide é concluído, permitir que as seções secar por alguns minutos e transferir o slide para a folha no recipiente de gelo seco até que todos os slides necessários são coletados.
  5. Guarde os slides a -80 °C em uma caixa de slides.
    Nota: A espessura da seção é escolhida para maximizar a quantidade de tecido coletado ao permitir o corte eficiente do tecido, e pode variar dependendo do tecido do interesse. O protocolo pode ser pausado aqui. Mantenha os slides livres da contaminação por RNase. Evite mudanças de temperatura. Embora os RINs de RNA de slides armazenados por até 6 meses ainda possam indicar alta qualidade do RNA, recomendamos o uso de slides o mais rápido possível.

3. Preparação da amostra para a microdissecção da captação do laser

  1. Prepare soluções para coloração e desidratação.
    1. Coloque 45 mL de 80% de etanol em cada um dos três tubos de centrífuga de 50 mL no gelo. Rotulá-los como #1, #2 e #3. Diluir etanol com água livre de RNase/DNase.
    2. Coloque 45 mL de 95% de etanol em um tubo de centrífuga de 50 mL no gelo.
    3. Coloque 45 mL de 100% de etanol em um tubo de centrífuga de 50 mL no gelo.
    4. Coloque 45 mL de xileno em um tubo de centrífuga de 50 mL à temperatura ambiente.
      CUIDADO: Xileno deve ser usado em um capô de fumaça.
  2. Descongele uma membrana PEN deslize brevemente, colocando-a contra uma mão enluvada, em seguida, lave duas vezes por 30 s cada em 45 mL de 80% de etanol (#1 e #2) com agitação em tubos de centrífuga de 50 mL para remover o OCT.
    Nota: É importante remover oct antes da coloração, para evitar OCT solto durante a coloração de obscurecer as seções. Fórceps podem ser usados para facilitar a remoção de OCT que não é lavado pela agitação.
  3. Coloque a lâmina em uma folha de alumínio. Pipette 0,8 mL de 0,1% violeta cresyl em 50% de etanol no escorregador e mancha por 30 s. Lave o slide em 45 mL de 80% de etanol (#3) para 30 s, e depois desidratar por passagem para 30 s cada através de 45 mL de 95% de etanol, 100% etanol, e xylene em tubos de 50 mL centrífuga.
  4. Suporte slides em um limpador de tarefas delicada spor 5 min para drenar seções de xileno e seca.
    Nota: Os slides devem ser completamente secos antes do LCM.

4. Microdissese de captura a laser

Nota: Use luvas de nitrilo sem pó durante a execução de LCM.

  1. Ligue o microscópio LCM, laser e computador. Faça login no computador e inicie o software. Ligue a chave para a posição "On" para iniciar o laser. Quando a luz verde (Laser) estiver acesa, pressione o botão vermelho para ativar o laser e, em seguida, a luz (Laser) fica vermelha indicando que o laser está pronto para uso.
    Nota: O laser precisa de aproximadamente 10 min para aquecer.
  2. Configure os tubos de coleta.
    1. Insira a tampa de um tubo de reação em cadeia de polimerase de 0,5 mL (PCR) no coletor.
      Nota: Escolha o coletor correspondente para os tubos PCR desejados (0,2 ou 0,5 mL).
    2. Pipette 50 μL de buffer de extração (fornecido pelo kit de isolamento RNA listado na Tabela de Materiais) na tampa do tubo de coleta de 0,5 mL.
    3. Insira o dispositivo de coleta no microscópio.
    4. Na janela do dispositivo de coletor de mudança, clique no botão Move to Reference Point para mover o coletor para o ponto de referência (RP). Ajuste o foco para ver claramente o RP. Clique nas setas para mover o RP para o centro da vista.
  3. Carregar slides de espécimes.
    1. Clique no botão de descarga esquerdo na barra de ferramentas para baixar o suporte de slides.
    2. Coloque o slide no suporte, com a seção de tecido voltada para baixo.
      Nota: Esta orientação garante que as seções de tecido capturados caiam na tampa do tubo de coleta por gravidade.
    3. Insira o suporte de volta ao palco.
  4. Configure os parâmetros a laser.
    1. Selecione a opção controle do menu Laser ou clique no ícone Laser.
    2. Ajuste esses parâmetros como desejado: Poder,o poder do laser; Abertura,a largura do laser; e Velocidade,a velocidade de corte no modo Draw and Cut.
      Nota: Teste o laser em uma área fora do interesse. Maior potência ou abertura maior torna mais fácil de cortar, mas causa mais danos às células. Ajuste a combinação de potência, abertura e velocidade para obter corte eficiente e danos mínimos do tecido. Por exemplo, Power = 40, Aperture = 5, e Velocidade = 7 para o tecido da cartilagem em uma seção de 12 μm.
  5. Selecione e corte áreas de interesse.
    1. Comece com 5x objetivo e encontrar as áreas de interesse, e depois mudar para o objetivo (5x, 10x, ou 40x) que melhor mostra a área de interesse.
      Nota: Após a coloração violeta cresyl, cartilagens são manchadas magenta e tecidos mineralizados parecem marrom ou preto, distinguível de outros tecidos. As imagens podem ser salvas usando salvar a imagem como do menu arquivo.
    2. Escolha o tubo para coleta (A, B, C, D) clicando na marca no coletor.
    3. Escolha Mover e cortar ou desenhar e cortar. No modo Move and Cut, o espécime é cortado manualmente, usando o mouse ou a caneta touch-screen para desenhar formas à mão livre. No modo Draw and Cut, as formas podem ser desenhadas à mão livre com o mouse ou a caneta touch-screen para o corte subsequente. Clique no botão Iniciar o Corte para iniciar o corte a laser.
    4. Uma vez que o corte é terminado, o tecido do alvo com membrana da PENA cai no tampão do tubo da coleção pela gravidade. Repita 4,5 para reunir várias áreas de interesse, se necessário.
      Nota: Repetir cortes ou aumentar o poder ou a abertura pode ser necessário se o tecido não deixar cair no tampão do tubo da coleção devido ao corte incompleto. Osso mineralizado (marrom ou preto) não pode ser cortado diretamente por laser.
  6. Descarregue o coletor e feche cuidadosamente o tubo PCR. Coloque os tecidos microdissecados em gelo seco. Continue para o próximo passo ou armazenar a -80 °C.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Repita 4,2 a 4,6 para a próxima amostra.

5. Lysis de tecidos microdissecados e isolamento de RNA

  1. Descongele os tecidos microdissecados à temperatura ambiente. Centrífuga brevemente e incubar as amostras por 30 min a 42 °C.
  2. Após a incubação, gire o amortecedor da lyse para baixo no tubo de PCR de 0.5 mL. Realize o tratamento de DNase e a extração de RNA usando um kit de isolamento de RNA (veja a Tabela de Materiais)seguindo as instruções do fabricante.

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Resultados

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As seções coronais de tecidos frescos do rato congelado em E16.5 foram usadas para demonstrar a isolação e a coleção da cartilagem de Meckel (MC), da cartilagem condylar, e do osso mandibular por LCM. Embriões de camundongos na E16.5 foram dissecados e embutidos em moldes criogênicos com composto OCT. As amostras nos moldes foram congeladas ràpida em um gelo seco e em um banho metil-2-butano e armazenadas em -80 °C.

Para demonstrar a coloração violeta do cresyl da cartilagem e do osso, a crioç...

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Discussão

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O LCM permite o isolamento de populações de células enriquecidas ou homogêneas de tecidos heterogêneos. Suas vantagens incluem a captura rápida e precisa de células em seu contexto in vivo, enquanto as desvantagens potenciais incluem que seja demorado, caro e limitado pela necessidade de o usuário reconhecer subpopulações distintas dentro de uma amostra especificada30. Este protocolo fornece detalhes de LCM da cartilagem embrionária do rato e do osso, destacando o uso da mancha violeta do...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (R01DE022988) e pelo Instituto Nacional eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (P01HD078233). Os autores agradecem ao Núcleo de Biorepositório e Patologia pelo acesso à plataforma Leica LMD 6500 na Escola de Medicina Icahn, no Monte Sinai.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-MetilbutanoThermoFisher ScientificO3551-4
BioanalisadorAgilentG2939BA
Tubo de centrífugaThermoFisher Scientific339653Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno, 50 mL
Acetato violeta CresylSigma-AldrichC5042
CriostatoLeica BiosystemsCM3050 S
Limpador de tarefa delicadaThermoFisher Scientific06-666
Molde de incorporação descartávelThermoFisher Scientific1220
Água destiladaInvitrogen10977-015Etanol livre de DNase/RNase
, absoluto (200 provas)ThermoFisher ScientificBP2818
de membrana de CANETA de vidro de grau de biologia molecularLeica Microsystems11505158
sistema LCMLeica Microsystems LeicaLMD6500
Vidro de cobertura do microscópioThermoFisher Scientific12-545FP
Lâminas de microscópioThermoFisher Scientific12-550-15
OCT compostoElectron Microscopy Sciences102094-106
Tubo PCR com tampa plana, 0,5 mLTubos de coletaAxygenPCR-05-C
Meio de montagem permanenteVector LaboratoriesH-5000
Kit de isolamento de RNAThermoFisher ScientificKIT0204
Agente de descontaminação RNaseSigma-AldrichR2020Agente de descontaminação RNase para limpeza de superfícies
XilenoSigma-Aldrich214736
Lâmina LCM

Referências

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