Summary
Presenteras här är ett protokoll för isolering av mus hepatocyter från vuxna mus lever med hjälp av en modifierad kollagenase perfusion teknik. Beskrivs också är den långsiktiga kulturen av hepatocyter i en 3D Collagen Sandwich inställning samt immunolabeling av cytoskeletala komponenter för att studera galla canaliculära bildandet och dess svar på behandling.
Abstract
Hepatocyter är de centrala cellerna i levern som ansvarar för dess metaboliska funktion. Som sådan, de bildar ett unikt polariserat epitel, där två eller fler hepatocyter bidra apikala membran att bilda en galla canaliculära nätverk genom vilken galla utsöndras. Hepatocyte polarisering är viktigt för korrekt canaliculära bildandet och beror på samspelet mellan hepatocyte cytoskeleton, cell-Cellkontakter, och den extracellulära matrisen. In vitro-studier av hepatocyte cytoskelettet inblandning i canaliculi formation och dess svar på patologiska situationer är handikappade av bristen på cellkultur, som skulle nära likna Canaliculi nätverksstruktur in vivo. Beskrivs här är ett protokoll för isolering av mus hepatocyter från vuxna mus levern med hjälp av en modifierad kollagenase perfusion teknik. Också beskrivs är produktionen av kulturen i en 3D Collagen Sandwich inställning, som används för immunolabeling av cytoskeletala komponenter för att studera galla kanalikulär formation och dess svar på behandlingar in vitro-. Det visas att hepatocyte 3D Collagen Sandwich kulturer reagera på behandlingar med toxiner (etanol) eller aktin cytoskelettet förändra droger (t. ex., blebbistatin) och fungera som ett värdefullt verktyg för in vitro-studier av galla Canaliculi formation och funktion.
Introduction
Hepatocyter, den centrala cellulära strukturer i levern som är ansvariga för dess metaboliska funktioner, är unikt polariserade epitelceller. Deras polarisering, som förekommer i däggdjur strax efter födseln, resulterar i bildandet av gallvägarna canaliculära nätverk och är viktigt för korrekt galla sekretion. Apikala membran av hepatocyter kollektivt bildar galla Canaliculi, medan basalmembran kvar i kontakt med endotel av sinusoids. Förlusten av hepatocyte polarisering leder till omfördelning av galla transportörer och resulterar i patologiska processer i samband med galla retention i levern (i.e., kolestas).
Etablering och underhåll av hepatocyte polarisering och utvecklingen av galla Canaliculi medför komplexa mekanismer. De bakomliggande processerna är beroende av ett kollektivt samspel mellan hepatocyternas cytoskelett, cell cells kontakter och interaktioner med den extracellulära matrisen1. Den hepatocyte cytoskelettet består av alla tre filament nätverk, den aktin cytoskelettet, microtubules, och mellanliggande glödtrådar, som ger strukturellt stöd för kanalikulär formation. Den differentiella roll cytoskelett komponenter i förnyelse och underhåll av galla canaliculära nätverk har tidigare illustrerats in vitro i 3D kollagen-Sandwich hepatocyte kulturer2.
Actin Microfilaments och mikrotubuli är viktiga under de inledande stadierna av hepatocyte membran polarisering vid platserna för canaliculus generation2. Den aktin cytoskelettet etablerar struktur och funktion av galla Canaliculi, bildar membran-associerade microfilament och omkretsriktningen ringen, vilket stöder canaliculära arkitektur och sätta in aktin cytoskelettet i snäva och anhängare korsningar3. Ringen av keratin mellanliggande glödtrådar utanför aktin cytoskelettet ytterligare stabiliserar canaliculära struktur3.
Vikten av proteiner i hepatocyte av komplex i organisationen av galla Canaliculi arkitektur har varit väldokumenterade i flera knock-out musmodeller, som visar förvrängd Canaliculi hos möss som saknar både snäva och/eller anhängare av proteiner4,5,6. Strykningen av adherens Junction protein α-catenin har visat sig leda till oordning av hepatocyte aktin cytoskeleton, dilatation av galla canaliculära lumen, läckande snäva korsningar, och effektivt till en kolestatisk fenotyp4. Dessutom, in vitro-studier har visat vikten av adherens knutpunkt komponenter E-cadherin och β-catenin i remodeling av hepatocellulära apikala lumen och protein trafficking7.
Slående, ablation av cytoskelettet crosslinking protein plectin, som är den stora keratin arrangören, har avslöjat fenotyper jämförbara med dem som är kopplade till aktin cytoskelettet8. Detta tyder på en kritisk roll keratin mellanliggande glödtrådar i stöd av canaliculära struktur. In vitro-studier som utnyttjar 3D hepatocyte kollagen smörgåsar har också visat vikten av amp-aktiverat proteinkinas och dess uppströms Activator LKB1 i galla canaliculära nätverk formation9. Dessa fynd bekräftades sedan ytterligare genom efterföljande in vivo-studier10,11. Sålunda, det har blivit klart att in vitro-studier är nödvändiga för att främja förståelsen av signalering processer som deltar i inrättandet av hepatocyte polarisering, ordentlig canaliculära nätverk bildas, och galla sekretion.
En stor utmaning i att studera processer i samband med galla kanalikulär formation och dess svar på patologiska situationer in vitro använder en cell odlingsförhållanden som liknar situationen i vivo12. Nyligen isolerade primära hepatocyter är inte polariserade; Sålunda, de förlorar sin funktion, morfologi, och funktionella galla Canaliculi i 2D odlingsförhållanden (t. ex., förändringar i genreglering, polarisering, och de-differentiering13,14,15). Trots detta faktum, nyligen isolerade hepatocyter närmast återspeglar arten av levern in vivo, till skillnad från leverframställda cellinjer16. Även om de har använts i det förflutna, förevigade cellinjer inte utövar epitelial-liknande karakteristiska morfologi av hepatocyter, och galla canaliculära lumen bildas av dessa celler likna levern Canaliculi dåligt7. Nyligen, 3D-kulturer av primära hepatocyter, från både möss och råttor, har blivit ett användbart verktyg för att undersöka processer som deltar i galla canaliculära nätverk bildas in vitro-9. Primära hepatocyter odlade mellan två skikt av kollagen (kallad en 3D Collagen Sandwich kultur) kan repolarisera i flera dagar. På grund av höga tekniska krav som krävs när odla mus hepatocyter i 3D kollagen smörgåsar, här presenterar vi ett komplext protokoll för att isolera, att odla, och att immunolabel mus hepatocyter inbäddade i 3D kollagen smörgåsar för att karakterisera medverkan av cytoskeletala komponenter under galla kanalikulär formation.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Europadirektiv 2010/63/EU och de godkändes av den tjeckiska Central kommissionen för djurskydd.
1. material
- Husdjur under särskilda patogen-fria villkor enligt riktlinjerna från federationen för laboratoriedjur vetenskaps föreningar med fri tillgång till regelbunden Chow och dricksvatten. Husdjur under en 12 h/12 h mörk/ljus cykel. För hepatocyte isolering och kultur, Använd 8 – 12 veckor gamla djur.
- Stamlösningar A och B
- Bered stamlösning A och stamlösning B enligt tabell 1 respektive tabell 2i förväg. Lös upp alla komponenter i 1 L destillerat H2o (DH2o).
- Justera pH-värdet för lösningarna till 7,2 och filtrera lösningarna genom ett 0,2 μm filter. Båda lösningarna kan förvaras vid 4 ° c i upp till 6 månader.
- Stamlösning C
- Bered lösning C på dagen för primär hepatocyte isolering.
- Lägg till alla komponenter enligt tabell 3, Fyll till en total volym på 50 ml med DH2O och lös upp. Justera pH till 7,3.
- Alikvot 50 mL av lösningen i 50 mL-rör. Använd ett rör per djur. Placera alla nödvändiga alikvoter i ett förvärmad vattenbad (37 ° c).
- Stamlösning D
- Bered lösning D på dagen för primär hepatocyte isolering.
- Lägg till alla komponenter enligt tabell 4, fyll till en total volym på 30 ml med DH2O och lös upp. Justera pH till 7,3.
- Alikvot 30 mL av lösningen i 50 mL-rör. Tillsätt kollagenas I (5 mg/30 mL) i lösning D. Använd en alikvot per djur. Placera alla alikvoter i ett förvärmt vattenbad (37 ° c).
- Stamlösning E
- Bered lösning E på dagen för primär hepatocyte isolering.
- Lägg till alla komponenter enligt tabell 5, Fyll till en total volym på 50 ml med DH2O och lös upp. Justera pH till 7,3.
- Alikvot 50 mL av lösningen i 50 mL-rör. Tillsätt albumin V (0,65 g/50 mL) i lösning E. Använd en alikvot per djur. Placera alla alikvoter i ett förvärmt vattenbad (37 ° c).
2. beredning av kollagen smörgåsar
- En dag före primär hepatocyte isolering, förbereda det första lagret av kollagen I Sandwich.
Obs: arbeta på is och använda pre-kylda lösningar, tips, tallrikar och rör för att minimera oönskad gelering av kollagen I. - Neutralisera erforderlig mängd kollagen I (från råtta svans) enligt tillverkarens protokoll. En volym på 100 μL neutraliserat kollagen (1,5 mg/mL) per experimentellt prov (3,5 cm i skålen) krävs. För att bereda 1 mL neutraliserat kollagen (1,5 mg/mL), tillsätt 100 μL av 10X DMEM, 1,5 μL av 1M NaOH och 48,5 μL dH2O i 500 μl kollagen (lager koncentration = 3 mg/ml). Kontrollera pH av neutraliserat kollagen med lackmuspapper (pH bör vara ~ 7,5).
- Skingra 100 μL neutraliserad kollagen lösning jämnt med en pre-kyld 200 μL spets över ytan av en 3,5 cm skålen på isen.
- Inkubera över natten under standard odlingsförhållanden (inkubator med 5% CO2 vid 37 ° c). På dagen för primär hepatocyte isolering, tillsätt 1 mL förvärmda (37 ° c) PBS till det första kollagen skiktet. Låt kollagen att rehydrera för 2-3 h vid 37 ° c.
3. utrustning som inrättats
- Förbered all utrustning som anges i tabell över material och Ställ in som visas i figur 1.
4. kirurgiskt ingrepp
- Anesthetize musen genom intramuskulär injektion av Tiletamin (60 mg/kg kroppsvikt), Zolazepam (60 mg/kg), och xylazin (4,5 mg/kg). Efter flera minuter, bekräfta ordentlig anestetization av tå nypa. Om djuret inte reagerar på smärtan, Fortsätt till 4,2.
- Placera den sövda musen på en dissektion matta och tejpa de nedre och övre extremiteterna för att fixa musen i en ryggläge. Svabb buken med 70% etanol och öppna buken med en V-form snitt från blygdområdet till frambenen. Vik huden över bröstet för att avslöja bukhålan. Placera den dissekterande mattan under ett dissekera Mikroskop.
- Böj en insulinspruta nål (30 G) till en 45 ° vinkel. Exponera den sämre Vena Cava (IVC) genom att flytta tarmen och tjocktarmen i caudal riktning.
- Fyll 2,5 mL förvärmda (37 ° c) lösning C i en 2 mL spruta med kanyl. Se till att det inte finns några luftbubblor i kanyl eller spruta.
- Innan kanylering av IVC, flytta levern loberna genom att trycka dem upp till membranet med en våt (PBS) bomullspinne. Placera en sidensutur runt IVC strax under levern (figur 2a, B).
- Injicera 10 μL heparin (5000 U/mL) i Portal venen med en insulinspruta med en 30 G nål böjd i en 45 ° vinkel (figur 2C).
- Att kanylera levern, göra ett litet snitt med mikrokirurgisk sax till IVC direkt bredvid levern (under suturen; Figur 2D) som är tillräckligt stor för att sätta in kanyl. Fäst kanylerna i positionen med suturer och två kirurgiska knutar (figur 2E).
- Skär Portal ven (figur 2F) för att tillåta perfusion buffertar att flöda ut från levern för att förhindra expansion av levern.
- Manuellt parfymera levern med 1,5 mL förvärmda lösning C genom att långsamt trycka på sprutan ansluten till kanyl (detta bör ta ~ 15 s). Avlägsnande av blod från levern genom missfärgning av levern kan nu observeras.
- Pre-Fill en Peristaltisk pump med pre-warmed (37 ° c) lösning C. Kontrollera perfusion apparaten och se till att det inte finns några luftbubblor i systemet.
- Koppla försiktigt kanylen från sprutan och Anslut den till slangen i den peristaltiska pumpen som löper med en flödeshastighet på 2,5 mL/min. arbeta snabbt men noggrant och se till att kanylen förblir i position och att inga bubblor in i slangen eller kanyl.
- Perfuse levern med lösning C för 2 min (5 mL lösning C). Byt till lösning D och fortsätt perfusionen i ytterligare 10 min (25 mL lösning D).
- När levern har varit parfymerna, ta bort den från bukhålan. Levern kommer nu att vara mycket bräcklig och blek i färgen (figur 3).
5. isolering av primära hepatocyter
- Ta bort levern från musen. Kanylen kommer fortfarande att knytas till levern, så Använd tång för att lyfta kanyl med levern, och försiktigt skära av alla fascia anslutningar. Överför levern till en 50 mL tub innehållande 20 mL förvärmd lösning E.
- Håll kanyl med levern med hjälp av tång och avassociera vävnaden genom att gnugga levern runt väggen av röret för att överföra isolerade hepatocyter i buffert. Håll isolerade celler på is.
Obs: isolerade primära hepatocyter är livskraftiga i flera timmar medan hålls på is. Användare kan upprepa steg 4,1 genom 5,2 isolera primära hepatocyter från en annan givare mus, om det behövs, eller gå vidare till nästa steg. - Placera en 70 μm nylon cell SIL ovanpå en 50 mL rör och filtrera de isolerade cellerna.
- Centrifugera röret vid 50 x g och 4 ° c i 5 min. aspirera på supernatanten. För att ta bort döda celler och öka andelen livskraftiga celler, Omsuspendera pelleten i 20 mL 40% percol i DMEM.
- Centrifugera röret vid 50 x g och 4 ° c i 5 min. aspirera på supernatanten som innehåller döda celler och Omsuspendera pelleten i 20 ml lösning E.
- Centrifugera rören vid 50 x g och 4 ° c i 5 min. Aspirera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 10 ml lösning E.
- Kontrollera den primära hepatocyte avkastning och lönsamhet med trypan Blåfärgning. Räkna cellnumret med hjälp av en Neubauer cell räknings kammare och justera cellkoncentrationen till 3,75 x 105 livskraftiga celler/ml. Håll cellerna på isen.
6. odling av primära hepatocyter i 3D kollagen smörgåsar
- Förbered hepatocyte odlingssubstrat (HCM). Tillsätt 15 μL glukagon (1 mg/mL), 15 μL hydrokortison (50 mg/mL) och 40 μL insulin (10 mg/mL) till 50 mL av hela mediet (DMEM, hög glukos, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin).
- Jämnt skingra 2 mL (5 x 105 celler/ml) av livskraftiga primära hepatocyter i en pre-coated 3,5 cm skålen. Inkubera cellerna med 5% CO2 vid 37 ° c i 3 h. viktigt: fördela cellerna jämnt genom att luta skålen i alla riktningar precis innan du sätter skålen i inkubator.
- Förbered neutraliserat kollagen I (100 μL/3.5 cm skålen, dvs en tillräcklig volym för alla rätter som beskrivs ovan [steg 2,1]). Håll på is till användning.
- Efter 3 h, ta försiktigt bort medium och ej anslutna celler och tillsätt 100 μL neutraliserat kollagen I till varje 3,5 cm skålen för att bilda det översta lagret av kollagen smörgås på celler. Inkubera kollagen smörgås under standard cell-odlingsförhållanden (5% CO2 vid 37 ° c) för 1 h. Efter en 1 h inkubering, tillsätt försiktigt 2 mL HCM.
- Efter 24 h kultur, ändra HCM medium för en ny.
- Kultur för 3 – 8 dagar, beroende på bildandet av galla Canaliculi. Kontrollera kulturen varje dag i Mikroskop (figur 4). Ändra HCM varannan dag.
7. immunolabeling av primära hepatocyter i 3D kollagen smörgåsar
- Ta bort media från hepatocyte smörgåsar, tvätta sedan försiktigt med förvärmda PBS. Fixera sandwichkulturer med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 30 min vid rumstemperatur (RT).
- Efter fixering, tvätta smörgåsar 3x för 10 min i 2 mL PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T).
- Permeabilize celler med 1 mL 0,1 M glycin, 0,2% Triton X-100 i PBS vid RT för 1 h. Tvätta 3x för 10 min i PBS-T.
- Störa försiktigt det översta lagret av kollagen med hjälp av en 10 μL laddnings spets som är ansluten till en vakuum aspiration för att säkerställa tillräcklig antikropps inträngning.
- Block med 1 mL 5% BSA i PBS-T (dvs blockerande lösning) för 2 h. Inkubera med primära antikroppar utspädda i blockerande lösning över natten vid 37 ° c. Tvätta 3x för 15 min i PBS-T.
- Efter tvättning, inkubera med sekundär antikropp vid 37 ° c i 5 h. Tvätta 3x för 15 min i PBS-T följt av 1x tvätta med destillerat H2O.
- Montera med anti-Fade monteringsmaterial (se tabell över material) för mikroskopi.
Representative Results
Mus primära hepatocyter isolerades och seedade i 3D kollagen smörgåsar. Galla Canaliculi mellan två angränsande celler började bildas inom flera timmar efter seeding. Celler bildade kluster och självorganiserade i ett ungefär regelbundet nätverk av galla Canaliculi inom 1 dag (figur 4). Inom 3 – 6 dagar observerades vanligtvis kluster med 5 – 10 celler, med fullt polariserade hepatocyter som bildar ett canaliculära nätverk (figur 4).
Behandling av primära mus hepatocyter i 3D kollagen smörgåsar med antingen toxin (etanol) eller cytoskeleton-förändra läkemedel (t. ex., blebbistatin, okadainsyra) resulterade i förändringar i hepatocyte cytoskelettet, Canaliculi bredd, form, och antal galla Canaliculi illustreras av immunolabeling med en antikropp till keratin 8 (den vanligast förekommande keratin i hepatocyter), phalloidin (visualisera F-Actin), och antikropp till tätt knutpunkt protein Auktor occludens-1 (zo-1; Figur 5).
Etanol behandling hade endast en mild effekt på organisationen av keratin 8; emellertid, det ökade tortuosity (sett från F-Actin färgning) och distribution av galla canaliculära bredder (figur 5). Signalintensiteten av ZO-1 färgning minskade i etanol-behandlade galla Canaliculi jämfört med obehandlade kontroller, vilket tyder på en förlust av snäva korsningar efter etanol behandling. Hämningen av aktomyosin kontraktilitet med blebbistatin påverkade signifikant formen och antalet galla Canaliculi. Den vanliga canaliculära nätet omorganiserades, jämfört med obehandlade hepatocyter, till förargelseväckande formad galla Canaliculi med en ökad förekomst av tjocka rundade galla Canaliculi istället för tunna långa (som sett i histogrammet av canaliculära bredder).
Dessutom påverkade behandling med okadainsyra (OA) hämmande fosfataser starkt de fysikaliska egenskaperna hos keratiner, som tidigare visat8,17. OA förändrar lösligheten av keratin glödtrådar; således resulterade behandlingen i djupgående omorganisation av keratin meshwork, som kollapsade i stora perinukleära aggregat. Både F-Actin och tight Junction protein ZO-1 var inte lokaliserade till någon särskild struktur, vilket tyder på nästan fullständigt försvinnande av organiserad galla Canaliculi och en fullständig förlust av hepatocyte polaritet. Den kvarvarande galla Canaliculi var signifikant minskat jämfört med obehandlade kontroller, som visas i canaliculära bredd histogram (figur 5).
För att korrelera mikroskopiska observationer av förändringar i hepatocyte cytoskelettet med hepatocellulära biokemiska svar på behandling, protokollet också uppmätta nivåer av alaninaminotransferas (ALAT) och aspartataminotransferas (ASAT) (två leverenzymer som vanligen används som hepatocellulära skador markörer) i supernatanten från 3D Collagen smörgåsar (figur 6)18. Etanol behandling förhöjda signifikant nivåerna av både ALAT och ASAT, tyder på allvarlig hepatocellulär skada. Blebbistatin behandling ledde inte till några betydande förändringar i både ALAT och ASAT nivåer jämfört med okadainsyra behandling, som utlöste milda biokemiska förändringar med förhöjda nivåer av ALAT, men ingen förändring i nivåer av ASAT. Sålunda, biokemiska markörer för hepatocellulär skada mätt in vitro från hepatocyte supernatanten korrelerar med cytoskeletala förändringar observerats genom immunofärgning.
Figur 1: experimentell uppsättning. (A) mus fast i liggande läge, placeras under en dissekera Mikroskop före operationen. Alla kirurgiska instrument som krävs placeras på ett magasin. (B) perfusion sviten under mus lever perfusion visar Silikonrör som förbinder reservoaren med varm buffert och parfymerade musen. C) schematisk representation av B. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: öppning av bukhålan och kanyleringen av IVC. Buken öppnas med ett V-formade snitt från blygdområdet till frambenen. Huden viks över bröstet för att exponera och förstora bukhålan. För att exponera IVC, tarmarna och tjocktarmen försiktigt flyttas caudally. (a, B) Innan kanylering av IVC, lever lober bör flyttas genom att trycka dem uppåt till membranet med en PBS-fuktade bomullspinne. Den IVC är sedan noggrant separeras från omgivande vävnader, och en sidensutur placeras runt IVC i närheten av levern. Panel B representerar schematik i bukhålan som visas i panel A. Leverloberna, tarmen, sämre Vena Cava (IVC, röd), och suturer indikeras. (C) heparin injiceras i portalen ven (PV, pil) med en insulinspruta (30 G nål böjd vid 45 ° vinkel). (D) för att kanylera levern, den IVC är anskäras direkt bredvid levern (under suturen). Ekanylen skall sättas in och säkras med suturer genom bindning av två kirurgiska knutar. (F) Portal venen är helt skuren för att möjliggöra fri buffert utflöde, förhindra lever expansion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa lever bilder före och efter perfusion. (a, B) Den kanylerade levern var resected och parfymerna för 12 min vid en flödeshastighet av 2,5 mL/min. Notera den signifikant missfärgade levern efter perfusion (B) jämfört med nyligen resected levern (A). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:3D Collagen Sandwich kultur av primär mus hepatocyter. Representativa ljusa fält bilder av mus primära hepatocyter odlade för 1, 2, och 3 dagar i 3D-förhållanden. Det bör noteras att större kluster av välorganiserade celler bildas efter 3 dagar i kulturen. Boxed områden visar ~ 3x förstorade bilder. Pilspetsar indikerar gallan Canaliculi. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: utvärdering av det morfologiska svaret på toxisk stress genom Immunofluorescerande mikroskopi. Primär mus hepatocyter odlade i 3D kollagen smörgåsar behandlades med gifter (etanol, blebbistatin, eller okadasyra syra) på dag 3 av kulturen. Fasta celler färgas för att visualisera cytoskeletala komponenter: keratin 8 (grön), F-Actin (röd), och Auktor occludens-1 (zo-1, magenta) genom immunofluorescens. Den giftiga behandlingen ledde till oordning av visualiserade cytoskeletala komponenter, och det minskade antalet och ökade tortuositeten av galla Canaliculi. Canalicular bredder mättes i både obehandlade och behandlade hepatocyter och avbildas som histogram av bredder fördelning. Pilspetsar indikerar gallan Canaliculi. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: biokemisk analys av svaret från 3D hepatocyte kollagen smörgåsar till toxisk skada in vitro-. ALAT och ASAT, väletablerade markörer för hepatocellulär skada, mättes i supernatanten från 3D hepatocyte kollagen smörgåsar som behandlats med toxiner (etanol, blebbistatin och okadainsyra). ALAT och ASAT var förhöjda i behandlade celler jämfört med obehandlade sådana. Data rapporteras som aritmetiska medel ± SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stamlösning A (10X) | |
| Reagens | Slutkoncentration (g/liter) |
| Nacl | 80 |
| KCl | 4 |
| MgSO4· 7h2O | 1,97 |
| Na2HPO4· 2H2O | 0,598 |
| KH2Po4 | 0,6 |
Tabell 1: stamlösning ett recept.
| Stamlösning B (10X) | |
| Reagens | Slutkoncentration (g/liter) |
| Nacl | 69 |
| KCl | 3,6 |
| KH2Po4 | 1,30 |
| MgSO4· 7h2O | 2,94 |
| CaCl2 | 2,772 |
Tabell 2: stamlösning B recept.
| Lösning C | |
| Reagens | |
| Stamlösning A (10X) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1094 g |
| EGTA | 0,0095 g |
| dH2O | till 50 mL |
Tabell 3: stamlösning C recept.
| Lösning D | |
| Reagens | |
| Stamlösning A (10X) | 3 mL |
| NaHCO3 | 0,065 g |
| CaCl2 | 0,0125 g |
| dH2O | till 30 mL |
Tabell 4: stamlösning D recept.
| Lösning E | |
| Reagens | |
| Stamlösning B (10X) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1 g |
| Glukos | 0,045 g |
| dH2O | till 50 mL |
Tabell 5: stamlösning E recept.
Discussion
Användningen av mus primära hepatocyte kulturer är viktigt för in vitro-studier för att bättre förstå signalering processer som deltar i inrättandet av hepatocyte polarisering, ordentlig canaliculära struktur formation, och galla sekretion. Utmaningarna i isolering och långsiktig kultur av mus primära hepatocyter i 2D-kulturen har drivit uppfinningen av flera tekniska metoder med ökad isolering effektivitet och livslängd av isolerade celler, var och en med flera fördelar och Nackdelar. Det är nu allmänt accepterat att 2D-kulturer av primära hepatocyter härma endast begränsat antal attribut av lever bio logi under en kort tidsperiod. Sålunda, 3D-odling i ett kollagen Sandwich arrangemang är allmänt ersätter 2D villkor, särskilt när fokuserade på funktionen av cytoskelettet i lever bio Logi (t. ex., toxiska effekter på läkemedlet eller rumslig organisation av galla transport).
Sedan 1980-talet har flera protokoll för isolering av mus hepatocyter med olika modifieringar beskrivits. Den tvåstegs kollagenas från perfusion tillvägagångssätt har blivit allmänt används i många laboratorier. Tillsatsen av gradientcentrifugering i isolerings protokollet tillåter avlägsnande av döda celler19,20 och ökar signifikant antalet livskraftiga celler (här, rutinmässigt till ~ 93%). Även om detta steg förlänger hanteringstiden för cellerna och resulterar i reducerade cell nummer21, detta steg ses som nödvändigt i 3D Collagen Sandwich kulturen för korrekt galla canaliculära nätverk bildas. Dessutom är det viktigare att gå vidare snabbt och korrekt under perfusion steg, vilket förkortar tiden som cellerna hanteras.
Andra viktiga faktorer som ökar livskraften hos cellerna och deras förmåga att bilda canaliculära nätverk i 3D är användningen av nyberedda lösningar och undvikande av bubblor under perfusion. Därför, lösningar bör förberedas på dagen för mus hepatocyte isolering, och peristaltiska pumpen och slangar bör kontrolleras vid byte av lösningar. Om protokollet följs noggrant, bör isoleringen av primära hepatocyter vara framgångsrik med en hög avkastning av livskraftiga celler.
En annan kritisk faktor i långsiktig 3D hepatocyte kultur är den initiala källan till primära hepatocyter som används. Det är viktigt att använda djur som är 8 – 12 veckor gamla, som fungerar som optimala givare av hepatocyter. Användningen av hepatocyter från äldre djur var inte lika framgångsrik i långsiktig kultur, eftersom dessa hepatocyter förändrat deras morfologi oftare, depolariserade, och upphörde att bilda canaliculära nätverk. Också, plätering hepatocyter på korrekt neutraliserad kollagen gel bildas från relativt mycket koncentrerad lösning är ett viktigt steg. I de flesta protokoll används koncentrationer på ca 1 mg/mL. Efter många optimeringar, en koncentration av 1,5 mg/mL är optimal för långsiktig hepatocyte odling och ger mycket organiserade hepatocyter med bildade galla Canaliculi.
Detta lätt att följa protokollet tillåter långsiktig odling av primära mus hepatocyter. Representativa resultat visar ett brett spektrum av användning för 3D odlade primära mus hepatocyter när man studerar rollen av cytoskelett komponenter i galla Canaliculi formation.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Tjeckiens bidrags byrå (18-02699S); Bidrags byrån vid Tjeckiens hälsoministerium (17-31538A); den institutionella forskningsprojekt av tjeckiska vetenskapsakademin (RVO 68378050) och MEYS CR projekt (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ. 1.05/2.1.00/19.0395, och OP RDE CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Charles University (personliga stipendium till KK), och ett operativt program Prag-konkurrenskraft projekt (CZ. 2.16/3.1.00/21547). Vi erkänner ljusmikroskopi Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjeckien (stöds MEYS CR projekt LM2015062 och LO1419) för stöd med mikroskopi Imaging presenteras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
- Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
- LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
- Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
- Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835 (2014).
- Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
- Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
- Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
- Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
- Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, Pt 19 3294-3302 (2010).
- Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
- Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
- Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
- Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A.
- Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
- Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
