Este protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a costainização imunofluorescente de IBA1 e TMEM119, além da análise da densidade microglial, distribuição e morfologia, bem como infiltração periférica de células mieloides no tecido cerebral do rato.
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Artigo de método
Imunofluorescência Manchausando IBA1 e TMEM119 para densidade microglial, morfologia e análise periférica de infiltração de células mieloides no cérebro do rato
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Este é um protocolo para a visualização dupla de microglia e infiltração de macrófagos no tecido cerebral do rato. TMEM119 (que rotula microglia seletivamente), quando combinado com IBA1 (que fornece uma visualização excepcional de sua morfologia), permite a investigação de mudanças na densidade, distribuição e morfologia. Quantificar esses parâmetros é importante para fornecer insights sobre os papéis exercidos pela microglia, os macrófagos residentes do cérebro. Em condições fisiológicas normais, a microglia é regularmente distribuída em um padrão semelhante ao mosaico e apresenta uma pequena soma com processos ramificados. No entanto, como resposta a fatores ambientais (ou seja, trauma, infecção, doença ou lesão), densidade microglial, distribuição e morfologia são alterados de várias maneiras, dependendo do insulto. Além disso, o método de coloração dupla descrito permite a visualização de macrófagos infiltrados no cérebro com base em sua expressão de IBA1 e sem colocalização com TMEM119. Esta abordagem permite assim a discriminação entre microglia e macrófagos infiltrados, que é necessário para fornecer insights funcionais sobre o seu envolvimento distinto na homeostase cerebral em vários contextos de saúde e doença. Este protocolo integra os resultados os mais atrasados na neuroimunologia que pertence à identificação de marcadores seletivos. Ele também serve como uma ferramenta útil para neuroimunologistas experientes e pesquisadores que procuram integrar a neuroimunologia em projetos.
Introdução
Se aguda ou crônica, neuroinflamação é fortemente influenciada pela microglia, os macrófagos residentes do cérebro. Visualizar a microglia através da imunocoloração é valioso para o estudo da neuroinflamação com o uso de microscopia de luz, uma técnica altamente acessível. Em condições homeostáticas, a microglia é normalmente distribuída em um padrão não sobreposto, semelhante a um mosaico. Eles exibem pequenas somas que estendem os processos ramificados1, que às vezes entram em contato uns com os outros2. Os processos microgliais ramified examinam dinamicamente o parenchyma do cérebro, interagindo com os neurônios, outr....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes dos comitês institucionais de Ética Animal, em conformidade com o Conselho Canadense de Cuidados Com Animais e o Comitê de Cuidados Com Animais da Université Laval.
1. Imunomanchas
- Selecione três seções cerebrais de camundongos contendo a região de interesse (ROI) (ou seja, o hipocampo) com a ajuda de um atlas cerebral. Coloque as seções em uma placa de plástico multi-poço e cubra-os com 350 μL de soro soro direito de fosfato (PBS) (Tabela 1).
NOTA: Para obter resultados ideais, os cérebros devem ser perfundidos com paraformaldeíd....
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Resultados
A figura 1 mostra a co-rotulagem da microglia usando IBA1 e TMEM119 em uma seção coronal do hipocampo dorsal imaged em 20x pela microscopia da fluorescência. Uma coloração bem sucedida revela corpos de células microgliais e seus processos finos (Figura 1A-C). Esta coloração permite a determinação da densidade microglial e distribuição e identificação de aglomerados microgliais(Figura 1
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Discussão
Este protocolo pode ser dividido em duas partes críticas: qualidade da coloração e análise. Se a coloração não for ideal, ela não representará adequadamente as células microgliais, afetando assim as medições de densidade, distribuição e morfologia. Além disso, a proporção de células mieloides periféricas de infiltração pode ser subestimada. Esta é uma versão otimizada do protocolo de coloração, mas existem vários fatores que podem resultar em imagens abaixo do ideal. Mesmo que a perfusão do animal não esteja incluída nes.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Somos gratos a Nathalie Vernoux por sua orientação e assistência com os experimentos. Gostaríamos também de agradecer aos Drs. Emmanuel Planel e Serge Rivest pelo uso de sua fluorescência e microscópios confocais, respectivamente. Este trabalho foi parcialmente financiado por bolsas de estudo do Conselho Mexicano de Ciência e Tecnologia (CONACYT; a F.G.I), Fondation Famille-Choquette e Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (a M.B.), e Shastri Indo-Canadian Institute (a K.B.), bem como uma concessão discovery do Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) para M.E.T. M.E.T. detém um....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 burro anti-rato | Invitrogen / Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 cabra anti-coelho | Invitrogen / Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Poços multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Soro bovino albumina | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Mancha de ácido nuceleico | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| arte | de pincel fino | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatina de pele de peixe de água fria | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Tampa de vidro do microscópio | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides carregados positivamente | VWR | 48311-703 | |
| Camundongo monoclonal Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4· H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Soro de burro normal (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Soro de cabra normal (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Coelho monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Banho de agitação recíproca modelo 25 | Pipeta | ||
| TRS002/TRS004 | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
Referências
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.
The name was corrected from:
Maude Bordelau
to:
Maude Bordeleau
