Caracterização funcional do RING-Tipo E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

A grande maioria das ligas de ubiquitina E3 pertence ao RING(Really interesting New Gene) proteínas do tipo. O domínio ring-finger foi originalmente identificado por Freemont et al. ¹ e funcionalmente descrito como um domínio mediador interação proteína-proteína². O dedo anelar canônico é um tipo especial de domínio coordenador de zinco definido como uma seqüência de consenso de oito Cs conservados (C) e Seu (H) espaçados especificamente por outros resíduos de aminoácidos (X), C-X₂-C-X_9-39-C-X_1-3-H-X_2-3-C/H-X_{2-C-X 48}-C-X₂-C. Dois íons Zn²⁺ são estabilizados pelos resíduos c e h do núcleo através da topologia única "cross-brace" com C₁/C₂ e C/H_5/C6 coordenando o primeiro íon Zn^2+, enquanto C₃/H₄ e C₇/C₈ ligam o segundo (Figura 1A)^3,4. Dependendo da presença de C ou H no quinto zn²⁺-local de coordenação, duas subclasses canônicas de proteínas ring-finger foram definidas: C3HC4 e C3H2C3 (RING-HC e RING-H2, respectivamente). Como o domínio RING da ligase ubiquitina E3 media a interação entre enzimas conjugantes E2 e substratos, a mutação desses resíduos essenciais de C e H tem sido mostrada para interromper a atividade da ligase⁵. Foram descritas mais cinco subclasses menos comuns de ligases RING E3 (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T e RING-G)⁶. As ligases de ubiquitina ring-tipo E3 podem ser ainda mais subdivididas em enzimas E3 simples e complexas. As ligases RING E3 da subunidade simples contêm o site de reconhecimento de substratos e o domínio RING de ligação e2. Em contrapartida, o complexo multisubunidade RING-tipo E3 recruta o substrato ou media a ligação do intermediário E2-ubiquitin ao complexo E3. O domínio RING Lys resíduos (s) que serve como um site de fixação de ubiquitina primário (s) para a auto-ubiquitinação também pode ser importante para a atividade da ligase E3.

Nem todas as proteínas contendo ANEL funcionam como ligases E3. Assim, a previsão bioinformática do domínio do dedo ANEL e a capacidade de ubiquitinação proteica dependente de E2 devem ser bioquimicamente validadas e ligadas ao papel biológico da proteína testada. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo descrevendo como detectar e caracterizar funcionalmente a atividade enzimática das ligases de ubiquitina ring-tipo E3, tanto in vitro quanto na planta, através de uma abordagem mutagênese dirigida pelo local. Os resultados representativos deste gasoduto são mostrados para o RING-tipo E3 ligase RHA1B. Rha1B é uma proteína efetora produzida pelo cisto parasita da planta nematode Globodera pallida para suprimir a imunidade vegetal e manipular a morfologia das células de raiz de plantas. Para se protegerem de patógenos/parasitárias, as plantas evoluíram receptores imunológicos do tipo de repetição de nucleotídeos e leucina (NB-LRR) que detectam a presença de um patógeno ou parasita e, como conseqüência, desenvolvem a resposta hipersensível (FC), que é uma forma de morte celular rápida e localizada ocorrendo no local da infecção para deter a colonização de patógenos. Um desses receptores imunológicos é a proteína Gpa2 de batata que confere resistência a alguns isolados de G. pallida (populações de campo D383 e D372)⁷.

Usando os protocolos apresentados, verificou-se recentemente que o RHA1B interfere com a sinalização imune às plantas de forma dependente da E3, visando o imunoreceptor gpa2 da planta para ubiquitinação e degradação⁸.

1. Mutagênese dirigida pelo local (Figura 1)

1. Identifique os cis e seus aminoácidos conservados no domínio RING(Figura 1A)e primers de design carregando o codon de substituição de interesse ladeado por 15 pares de base em ambos os lados do local da mutação (Figura 1B).
2. Introduzir a mutação desejada pela amplificação baseada em PCR do plasmídeo que abriga o gene do interesse usando primers mutagênicos e polimererase de DNA de alta fidelidade contendo Pfu em 50 μL do volume total de reação pcr como mostrado na Tabela 1 e Tabela 2 de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Dime o DNA metilado e semimetilado de Escherichia coli, derivado da escherichia,adicionando 3 μL de enzima de restrição DpnI diretamente à reação do PCR (passo 1.2) e incubando a 37 °C por 2 h.
   NOTA: A metilação é uma modificação de proteína pós-transcricional que é adicionada ao plasmídeo produzido e isolado das bactérias. Novas cópias de plasmídeo gerada por PCR carecem de metilação, portanto, as novas cópias permanecerão intactas durante o tratamento com DpnI.
4. Purifique os plasmídeos mutagenizados usando um kit de extração de DNA comercial baseado na tecnologia de coluna de spin e elute o DNA com 50 μL de água.
5. Transforme células dh5α E. coli quimicamente competentes com 0,5 μL do DNA de plasmídeo mutagenizado recuperado de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, incubar células competentes com DNA no gelo por 30 min, em seguida, choque-calor-los para 20 s em 42 ° C, e coloque tubos novamente no gelo por 2 min. Células incubadas com 500 μL de mídia LB em 37 ° C para 1 h em 250 rpm e depois espalhá-los em pates seletivos.
6. Verifique a mutação desejada por Sanger sequenciando os plasmídeos de DNA isolados de E. coli.

2. Purificação de proteína recombinante e ensaio de ubiquitização in vitro

1. Clonar o tipo selvagem RING e genes ring mutantes de interesse no vetor pMAL-c2 (siga o protocolo do fabricante; Tabela 3) para fundir esses genes com a marca epitope MBP que permite a purificação de um passo usando resina de amillose. Introduzir as construções resultantes na cepa E. coli BL21, conforme descrito no passo 1.5.
2. Crescer a cepa E. coli BL21 que abriga a construção desejada em 50 mL LB médio líquido em 37 ° C para 2-3 h até atingir a fase logarítica (OD₆₀₀ de 0,4-0,6).
3. Adicione o IPTG a uma concentração final de 0,1-1 mM para induzir a expressão de proteína recombinante de interesse marcada por MBP e incubar a cultura E. coli por 2-3 h a 28 °C. Coloque a cultura no gelo após a incubação.
   NOTA: Executar etapas 2.4-2.13 no gelo para proteger as proteínas da degradação.
4. Para verificar a eficiência da indução, colete 1,5 mL de células induzidas, g-los a 13.000 x g por 2 min, remover o supernatant, e resuspender as células em 20 μL de 2x SDS-PAGE buffer de carregamento (24 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,8% SDS, 10% (v/ v) glicerol, 4 mM DTT, 0,04% (w/ v) bromehenol azul).
5. Ferva as amostras por 5 min e executá-los em um gel 10% SDS-PAGE. Para avaliar visualmente o acúmulo de proteína de fusão MBP (peso molecular da proteína de interesse + 42,5 kDa MBP), manchar o gel por 20 min agitando com tampão de coloração Coomassie (50% metanol, 10% ácido acético, 0,1% azul Coomassie) e destaining durante a noite com o amortecedor destaining (20% metanol, ácido acético de 10%).
6. Colher as células e. coli restantes por centrífuga a 1.350 x g por 6 min, descartar o supernatant, e resuspender a pelota celular com 5 mL de buffer de coluna (20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, inibidor protease bacteriano).
   NOTA: Este é um bom lugar para parar o protocolo durante a noite. As células congeladas podem ser armazenadas até 1 semana a -20 °C.
7. Quebrar as células De E. coli, colocando o tubo contendo as bactérias em um banho de água gelada e aplicando 10 ciclos de sonication: 10 ssonication em 30% amp seguido por 20 s quebras.
8. Amostra de centrífuga a 13.000 x g a 4 °C por 10 min e salvar o supernatant (extrato bruto).
9. Prepare 500 μL de resina de amillose em um tubo de 15 mL. Lave a resina adicionando 10 mL de buffer de coluna fria e centrífuga em 1.800 x g,4 °C por 5 min. Faça isso 2x.
10. Adicione 5 mL de extrato de petróleo bruto para o tubo com a resina de amillose e incubar durante a noite em 4 °C.
11. Centrífuga a 1.800 x g a 4 °C por 5 min e descartar o supernatant.
12. Adicione 10 mL de buffer de coluna para a pelota de resina e incubar por 20 min. Em seguida, centrífuga em 1.800 x g a 4 °C para 5 min. Repita este passo 2x.
13. Elute a proteína da fusão com 0.5 mL do amortecedor da coluna que contem o maltose de 10 mM incubando uma amostra para 2 h em 4 °C. Centrífuga a 1.800 x g a 4 °C por 5 min e coletar a proteína eluted. Repita este passo 2x.
14. Diálise 1 mL da fração de proteína contra o PBS frio. Aliquot proteína em tubos de uso único (10-20 μL) para evitar o congelamento de descongelamento e armazenar a -80 °C até necessário.
15. Medir a concentração de proteína usando o ensaio Bradford⁹.
16. Configure a reação de ubiquitinação in vitro em um volume total de 30 μL, misturando 40 ng de E1 (por exemplo, AtUBA1), 100 ng de E2 (por exemplo, AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 μg MBP-RING tipo proteína, e 2 μg FLAG-Ub (ou HA-Ub) no buffer de ubiquitinação (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 30 mM creatine fosfato, 50 μg/mL creatina fosfosfosse). Incubar a mistura a 30 °C por 2 h.
    NOTA: Pré-fazer 20x ubiquitinação buffer e armazená-lo até 6 meses em -20 ° C em pequenos alíquos para um único uso. A fosfoquinase creatina perde facilmente sua atividade enzimática quando o amortecedor é descongelado e congelado repetidamente.
17. Encerre a reação misturando as amostras de 30 μL com 7,5 μL de buffer de carregamento 5x SDS-PAGE (60 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 25% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0.1% (w/v) bromehenol azul) e ebulição por 5 min.
18. Separe as proteínas com eletroforese de gel sds-poliacrilamida de 7,5% (SDS-PAGE), em seguida, transfira para a membrana PDVF e detecte ubiquitinação por borrão ocidental usando o anti-FLAG (ou anti-HA).
19. Manchar a membrana PVDF com azul Coomassie para verificar o carregamento igual de proteína testada do tipo MBP-RING.

3. Expressão de proteína transitória mediada pela agrobacteriumem folhas de Nicotiana benthamiana e no ensaio de ubiquitinação da planta

1. Raia apropriada Agrobacterium tumefaciens cepas carregando o gene de interesse epitráutopo -marcado (por exemplo, HA-RHA1B, HA-RHA1B^C135S, HA-RHA1B^K146R, HA-Ub) e vetor vazio como um controle sobre o LB médio contendo os antibióticos de seleção apropriados.
2. Após 2 dias de crescimento a 28 °C, pegue colônias individuais e cultivá-las em lb líquido médio com os antibióticos adequados em 28 °C/250 rpm para outro 24 h.
3. Transfira 100 μL de cultura agrobacteriana para 3 mL LB fresco com os antibióticos apropriados e incubar a cultura para um adicional de 4-6 h em 28 °C com rotação (250 rpm) para a fase de crescimento exponencial tardio.
4. Despine as células agrobacterianas a 1.800 x g por 6 min, descarte o supernatant e resuspenda as células com 3 mL de tampão de lavagem (50 mM MES pH 5.6, 28 mM glicose, 2 mM NaH₂PO_4). Repita este passo 2x.
5. Após a segunda lavagem, suspender as células no buffer de indução (50 mM MES pH 5.6, 28 mM glicose, 2 mM NaH₂PO_4, 200 μM acetosyringone, 37 mM NH₄Cl, 5 mMgSO₄.7H₂O, 4 mM KCl, 18 μM FeSO₄.7H₂O, 2 mM_{CaCl 2Cl 2.} Incubar as células com buffer de indução para um adicional de 10-12 h a 28 °C.
   NOTA: Acetosyringone induz transferência de T-DNA.
6. Centrífugaas as células a 1.800 x g por 6 min, descartam o supernatant e resuspendem as células com 2 mL de buffer de infiltração (10 mM MES pH 5.5, 200 μM acetosyringone).
   NOTA: Se aagrobactérias agregar após a incubação com buffer de indução, deixe as células agregadas afundar para o fundo do tubo, deixando-o no banco por alguns minutos, e transferir a suspensão agrobacterium claro para um novo tubo antes de prosseguir com a etapa 3.6.
7. Medir a concentração de bactérias usando o valor od₆₀₀ (a densidade óptica na absorção de 600 nm). Ajuste os valores do OD₆₀₀ aos desejados.
   NOTA: Normalmente, um valor OD₆₀₀ entre 0,2-0,4 funciona melhor para uma única expressão mancha agrobacteriana. Se uma combinação de diferentes cepas agrobacterianas for aplicada, o total de₆₀₀ valores de OD de cepas agrobacterianas não deve exceder 1.
8. Agroinfiltrado de 4 semanas de idade N. bethamiana sai gentilmente picando-os com uma agulha, seguido por agrobacterium injetando à mão com uma seringa sem a agulha. Circule a área de folha infiltrada com o marcador (geralmente 1-2 cm de diâmetro).
9. Recolher os tecidos de folha infiltrados 36 h pós-infiltração. Moer o tecido para um pó fino com nitrogênio líquido.
10. Pó de tecido resuspendido com 300 μL de tampão de extração de proteína (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glicerol, 1% polivinilpolipirrolido, 1 mM PMSF, planta protease inibidor cocktail) e centrífuga em 15,000 x g para 15 min em 4 °C.
11. Transfira o supernatant para um novo tubo. Adicione 5x SDS-PAGE buffer de carregamento para uma concentração final de 1x e deixe ferver por 5 min.
12. Separe as proteínas brutas em géis 10% SDS-PAGE, transfira para membranas PVDF e sonda com anti-HA para detectar na ubiquitinação da planta.

4. Estabelecer a ligação entre a atividade enzimática e a função na planta

NOTA: Por exemplo, rha1b promove a degradação da proteína resistente Gpa2 para suprimir a morte de células de RH. Esta etapa mostra como verificar se essas atividades virulentas do RHA1B são dependentes da E3.

1. Raia apropriada Agrobacterium tumefaciens cepas carregando genes marcados de interesse (neste exemplo HA-RHA1B, HA-RHA1B^C135S, HA-RHA1B^K146R, myc-Gpa2, RBP1) e vetor vazio como um controle. Siga os passos 3.1-3.8 para a preparação agrobacterium e injeção em folhas de N. bethamiana.
2. Para a degradação da proteína de substrato dependente da E3, siga os passos 3,9-3,12 e execute a mancha ocidental usando anticorpos apropriados para detectar o acúmulo de proteínas nas células vegetais (por exemplo, anti-HA e anti-MYC).
3. Para a resposta hipersensível dependente da E3 (RH) mediando a inibição da morte celular, monitore as folhas agroinfiltradas para os sintomas de morte de células de RH 2-4 dias após a infiltração.

Nesta seção, os resultados representativos são fornecidos para o protocolo utilizado para exame de uma única subunidade E3 ubiquitin ligase RHA1B que tem um domínio do tipo RING-H2 prosite previsto (132-176 aminoácidos)10. Como mostrado na Figura 1,a fim de obter uma proteína mutante deficiente em E3, pelo menos um dos oito Cs ou Hs conservados no domínio RING (Figura 1A)precisa ser mutagenizado ( Figura1B). Assim, como primeiro passo, duas versões mutantes do RHA1B, RHA1BC135S (uma substituição de Cys by Ser no cconservado 3 do domínio RING) e RHA1BK146R (uma substituição de Lys por Arg no único Lys presente no RHA1B) foram geradas. Embora a única subunidade e3 ligases mediar a transferência de ubiquitina da ubiquitina que abriga E2 para o substrato, em vez de interagir diretamente com a ubiquitina, a auto-ubiquitinação da E3 em Lys pode ser necessária para sua atividade enzimática máxima.

Os resultados de borrão ocidental na Figura 2A mostram um resultado típico positivo de ensaio de onipresença in vitro, com uma mancha multibanding começando com o peso molecular da proteína testada (por exemplo, RHA1B k1B k1B kDa com fusão de MPB) e progredindo para cima. O anticorpo anti-HA reconheceu ub marcado pela HA incorporado na cadeia de poli-onipresença de diferentes comprimentos, criando essa típica mancha de escada associada à ubiquitina. Para validar os resultados positivos, a Figura 2A também apresenta todos os controles negativos importantes que faltam componentes individuais (E1, E2, Ub ou MBP-RHA1B) ou usando o MBP como controle e sem o sinal de ubiquitização manchada. Além disso, a coloração azul Coomassie da membrana PVDF apresentou carregamento igual de MBP-RHA1B ou MBP em todos os controles.

A Figura 2B mostra como os resultados da ubiquitinação in vitro variaram dependendo da combinação específica de E2/E3. Neste exemplo, foram testados 11 E2s diferentes, representando 10 famílias E2 diferentes. A atividade detectada da ubiquitinação variou de nenhum sinal (nenhuma mancha) a uma mancha multibanding que começa em pesos moleculares diferentes, indicando testes padrões diferentes da ubiquitinação.

A Figura 3 mostra os resultados do ensaio de ubiquitinação para versões ring- e k-mutante de proteína testada. A falta de atividade enzimática para rha1bc135s é apoiada por sua incapacidade de gerar uma mancha multibanding in vitro (Figura 3A)ou promover o sinal de poli-ubiquitinação na planta (Figura 3B). É notável que a superexpressão do Ub marcado pela HA na planta por si só deu ubiquitinação de nível basal em todas as amostras testadas, incluindo o controle vetorial, em contraste com o forte sinal de ubiquitinação conferido pela atividade enzimática do tipo selvagem RHA1B. Além disso, a análise do mutante RHA1BK146R sugere que o resíduo K146 também é essencial para a atividade E3 do RHA1B. Embora um sinal marginal de auto-onipresença tenha sido detectado in vitro (Figura 3A),o ensaio na planta determinou que o mutante é deficiente em E3 (Figura 3B,apenas sinal de ubiquitinação de fundo detectado).

Depois de gerar e bioquimicamente validar o mutante deficiente em E3, estudos funcionais podem ser projetados para determinar o papel biológico associado à E3 da ligase ubiquitina RING testada. No caso do RHA1B, este efetor de nematóide suprime a sinalização imune da planta, como manifestado pela supressão da morte desencadeada por células de RH desencadeada pelo Gpa2. Conforme apresentado na Figura 4A,ao contrário do tipo selvagem RHA1B, o mutante RHA1BC135S sem atividade de ligase E3 não interferiu na morte de células de RH. Dado que o resultado mais comum da ubiquitinação proteica é a sua degradação mediada pela proteasome, mutações que residem no domínio RING também podem ser usadas para verificar uma capacidade dependente da E3 de desencadear degradação de seus substratos diretos e/ou indiretos. Assim, significativamente, os resultados de borrão ocidental na Figura 4B confirmam que a Gpa2 não se acumulou na presença do tipo selvagem RHA1B, mas o RHA1BC135S não teve impacto na estabilidade proteica gpa2.

Figura 1: Representação esquemática do princípio e passos envolvidos na mutagênese dirigida pelo local. (A)DOMÍNIO RING-CH/H2 com cis conservados e seus aminoácidos destacados. (B)Um exemplo de design de primers mutagênicos. (C)Passos de mutagênese dirigido pelo local. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Representante in vitro ubiquitinação ensaio. (A)O gel superior mostra o ensaio da ubiquitinação que inclui todos os controles negativos, e o gel inferior mostra o carregamento igual. (B) A gama de resultados esperados, dependendo das enzimas E2. Este número foi modificado a partir de Kud et al8. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Resultados do ensaio da Ubiquitination para RING- e K- mutantes (RHA1BC135S e RHA1BK146R). (A) Resultados de ubiquitização in vitro para RHA1BC135S e RHA1BK146R. (B) Em resultados de ensaio de ubiquitinação de planta para RHA1BC135S e RHA1BK146R. Este número foi modificado a partir de Kud et al8. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Estudo funcional representativo para funções biológicas dependentes de E3. Um exemplo de estudos funcionais mostrando a função biológica dependente de E3. (A)Supressão de morte de células de RH dependente de E3 e(B)degradação de um imunoreceptor de plantas Gpa2. Este número foi modificado a partir de Kud et al8. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Tabela 1: Reação pcr configurada

Tabela 2: Programa de termocicloparador PCR

Tabela 3: Reação de ligação criada para o exemplo RHA1B.

Os autores não têm nada a divulgar.