Artigo de método

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

DOI:

10.3791/60541

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1 de novembro de 2019

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1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

Neste artigo

Resumo

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Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Resumo

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A liberação de armadilhas extracelulares (ETs) por neutrófilos tem sido identificada como um fator contribuinte para o desenvolvimento de doenças relacionadas à inflamação crônica. ETs neutrófilos (NETs) consistem em uma malha de DNA, proteínas histona e várias proteínas de grânulo (ou seja, mieloperoxidase, elastase e cateterasina G). Outras células imunes, incluindo macrófagos, também podem produzir ETs; no entanto, até que ponto isso ocorre in vivo e se as armadilhas extracelulares de macrófagos (METs) desempenham um papel nos mecanismos patológicos não foi examinada em detalhes. Para entender melhor o papel dos METs em patologias inflamatórias, um protocolo foi desenvolvido para visualizar a liberação met de macrófagos humanos primários in vitro, que também pode ser explorado em experimentos de imunofluorescência. Isso permite uma maior caracterização dessas estruturas e sua comparação com ETs liberados de neutrófilos. Macrófagos derivados de monócito santem (HMDM) produzem METs após a exposição a diferentes estímulos inflamatórios após a diferenciação do fenótipo pró-inflamatório M1. A liberação de METs pode ser visualizada por microscopia usando uma mancha de ácido nucleico fluorescente verde que é imperdestina às células vivas (por exemplo, verde SYTOX). O uso de macrófagos primários recém-isolados, como o HMDM, é vantajoso na modelagem de eventos inflamatórios in vivo que são relevantes para potenciais aplicações clínicas. Este protocolo também pode ser usado para estudar a liberação met de linhas celulares monócitos humanos (por exemplo, THP-1) após a diferenciação em macrófagos com acetato phorbol myristate ou outras linhas celulares de macrófagos (por exemplo, as células J774A.1 murine macrófagos).

Introdução

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A liberação de ETs de neutrófilos foi identificada pela primeira vez como uma resposta imune inata desencadeada pela infecção bacteriana1. Eles consistem em uma espinha dorsal de DNA para que várias proteínas de grânulo com propriedades antibacterianas estão ligadas, incluindo elastase neutrófilo e mieloperoxidase2. O principal papel dos ETs neutrófilos (NETs) é capturar patógenos e facilitar a sua eliminação3. No entanto, além do papel protetor dos ETs na defesa imunológica, um número crescente de estudos também descobriu um papel na patogênese da doença, particularmente durante o desenvolvimento....

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Protocolo

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O HMDM foi isolado das preparações humanas do revestimento do buffy fornecidas pelo banco de sangue com aprovação das éticas do distrito de saúde local de Sydney.

1. Hmdm Cultura

  1. Isolar os monócitos de preparações de casaco sinuoso preparado a partir do sangue periférico de doadores humanos saudáveis usando uma preparação comercialmente disponível para isolar linfócitos, seguido por elutriação centrífuga contracorrente19, 20.
  2. Confirme a presença de monócitos por citofidiae e coloração com mancha de Giemsa modificada para caracterização de monócito

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Resultados

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Imagens de Brightfield mostrando as mudanças morfológicas do HMDM em resposta a estímulos para diferenciação celular são mostradas na Figura 1. M1 polarizado macrófagos de experimentos com HMDM expostos a IFNγ e LPS mostrou uma forma de célula alongada e fuso- como, como indicado pelas setas pretas na Figura 1 (painel médio). Para comparação, a morfologia dos macrófagos polarizados M2 após a exposição de HMDM a IL-4 para 48 h era tipicamente redonda e lisa, como.......

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Discussão

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A geração e visualização da formação MET utilizando HmDMs diferenciados de M1 representa um novo modelo in vitro que pode ser útil para investigar o potencial papel patológico dessas estruturas de macrófagos, particularmente inflamatória crônica Condições. Ele fornece um protocolo robusto para a estimulação de macrófagos humanos primários para liberar METs, que também podem ser utilizados em estudos relacionados com monocyte humano ou linhas de células macrófagos de urina. A implementação bem-sucedida deste protocolo par.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por um Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) e novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ também reconhece o recebimento de um Prêmio de Pós-Graduação Australiana da Universidade de Sydney. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Pat Pisansarakit e à Sra. Morgan Jones pela ajuda com o isolamento monócito e a cultura dos tecidos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fonte de luz fluorescente de amplo espectro 120QEXFO Photonic Solutions, Toronto, Canadásérie x-cite Corning
CellBIND Placa de poços múltiplos (12 poços)Sigma-AldrichCLS3336para cultura de células
Kit de coloração diferencial Quik (Giemsa modificado)Polysciences Inc.24606Caracterização de monócitos
Hanks solução salina balanceada (HBSS)Thermo-Fisher14025050Para etapas de lavagem e tratamento de HOCl
Ácido hipocloroso (HOCl)Sigma-Aldrich320331Para estimulação de MET
Interferon gamaThermo-FisherPMC4031Para M1 priming
Interleucina 4Ciências Integradasrhil-4Para M2 priming
Interleucina 8Miltenyl Biotec130-093-943Para estimulação MET
L-GlutaminaSigma-Aldrich59202CAdicionado ao meio de cultura
LipopolissacarídeoIntegrated Sciencestlrl-eblpsPara M1 priming
LymphoprepAxis-Shield PoC AS1114544Para isolamento de monócitos
Olympus IX71 invertido microscópioOlympus, Tóquio, Japão
Phorbol 12- miristato 13-acetato (PMA)Sigma-AldrichP8139Para estimulação MET
Fosfato tampolado solução salina (PBS)Sigma-AldrichD5652Para etapas de lavagem
RPMI-1640 mídiaSigma-AldrichR8758Para cultura de células
SYTOX verdeLife TechnologiesS7020Para MET fonte
luminosa Olympus do campo claro do visulaization TH4-200, Tóquio, Japãosérie da x-cite da série
necrose paraa estimulação MET
alfa Lonza 300-01A-50 da da

Referências

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  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....

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Polariza o M1Colora o com SYTOX GreenMicroscopia de Fluoresc nciaEstimula o com cido HipoclorosoEstimula o com PMAEstimula o com TNF AlfaEstimula o com Interleucina 8Visualiza o de MET

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