Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

A liberação de ETs de neutrófilos foi identificada pela primeira vez como uma resposta imune inata desencadeada pela infecção bacteriana^1. Eles consistem em uma espinha dorsal de DNA para que várias proteínas de grânulo com propriedades antibacterianas estão ligadas, incluindo elastase neutrófilo e mieloperoxidase². O principal papel dos ETs neutrófilos (NETs) é capturar patógenos e facilitar a sua eliminação³. No entanto, além do papel protetor dos ETs na defesa imunológica, um número crescente de estudos também descobriu um papel na patogênese da doença, particularmente durante o desenvolvimento de doenças transmitidas por inflamação (ou seja, artrite reumatóide e aterosclerose^4). A liberação de ETs pode ser desencadeada por várias citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina 8 (IL-8) e fator de necrose tumoral alfa (TNFα)^5,6, e o acúmulo localizado de ETs pode aumentar os danos nos tecidos e evocar um resposta pró-inflamatória⁷. Por exemplo, os ETs têm sido implicados como desempenhando um papel causal no desenvolvimento da aterosclerose^8,promovendo a trombose^9,e prevendo o risco cardiovascular¹⁰.

Agora é reconhecido que, além de neutrófilos, outras células imunes (ou seja, células de mastro, eosinófilos e macrófagos) também podem liberar ETs na exposição à estimulação microbiana ou pró-inflamatória^11,12. Isso pode ser particularmente significativo no caso dos macrófagos, considerando seu papel fundamental no desenvolvimento, regulação e resolução de doenças inflamatórias crônicas. Portanto, é importante obter uma maior compreensão da relação potencial entre a liberação de ET de macrófagos e desenvolvimento de doenças relacionadas à inflamação. Estudos recentes têm mostrado a presença de METs e NETs em placas ateroscleróticas humanas intactas e^trombo13organizado. Da mesma forma, mets têm sido implicados na condução de lesões renais através da regulação de respostas inflamatórias¹⁴. No entanto, em contraste com os neutrófilos, existem dados limitados sobre os mecanismos de formação met de macrófagos. Estudos recentes usando modelos in vitro humanos de formação MET mostram algumas diferenças nas vias envolvidas em cada tipo de célula (ou seja, em relação à ausência de citrulização histona com macrófagos)⁶. No entanto, alguns mostraram que a liberação net também pode ocorrer na ausência de histona ciitrullination¹⁵.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método simples e direto para avaliar a liberação do MET em um modelo de macrófago clinicamente relevante. Existem uma série de diferentes modelos de células de macrófagos in vitro que têm sido usados para estudar METs (ou seja, a linha de células monócito humana THP-1 e várias linhas de células de^macrófagosmurine) 16 . Existem algumas limitações associadas a esses modelos. Por exemplo, a diferenciação de monócitos THP-1 para macrófagos geralmente requer um passo de preparação, como a adição de acetato phorbol myristate (PMA), que por si só ativa proteína kinase C (PKC) vias dependentes. Este processo é conhecido por desencadear a liberação de ET⁴ e resulta em uma liberação baixo basal MET de células THP-1. Outros estudos destacaram algumas diferenças na bioatividade e respostas inflamatórias montadas por macrófagos in vivo em comparação com as células THP-1 tratadas com PMA¹⁷.

Da mesma forma, o comportamento e as respostas inflamatórias de diferentes linhas celulares semelhantes a macrófagos de urina não representam completamente o espectro de resposta dos macrófagos humanos primários¹⁸. Portanto, com a finalidade de investigar a formação de ET de macrófagos no ambiente clínico, acredita-se que os macrófagos humanos primários derivados de monócito (HMDMs) sejam um modelo mais relevante do que linhas celulares monocíticas ou murina semelhantes a macrófagos.

A liberação de ET de HMDMs polarizados M1 foi demonstrada após a exposição dessas células a uma série de diferentes estímulos inflamatórios, incluindo o ácido ocorrecloloso oxidante derivado da mieloperoxidase (HOCl), PMA, TNFα e IL-8⁶. Descrito aqui é um protocolo para polarizar HMDMs ao fenótipo M1 e visualizar a liberação met subseqüente após a exposição a esses estímulos inflamatórios. Pma é usado como um estímulo de liberação MET para facilitar comparações com estudos anteriores que usaram neutrófilos. Importante, HOCl, IL-8, e TNFα são usados igualmente para estimular a liberação MET, que são acreditadas para ser melhores modelos do ambiente inflamatório in vivo. O método microscópico para visualização da liberação de ET envolve a coloração do DNA extracelular em culturas de células vivas usando o verde SYTOX, uma mancha de ácido nucleico verde fluorescente impermeável que tem sido aplicada com sucesso em estudos anteriores de neutrófilos. Este método permite uma avaliação rápida e qualitativa da liberação de ET, mas não é apropriado como um método autônomo para a quantificação da extensão de liberação de ET. Metodologia alternativa deve ser usada se a quantificação for necessária para comparar a extensão da liberação de ET resultante de diferentes condições ou intervenções de tratamento.

O HMDM foi isolado das preparações humanas do revestimento do buffy fornecidas pelo banco de sangue com aprovação das éticas do distrito de saúde local de Sydney.

1. Hmdm Cultura

1. Isolar os monócitos de preparações de casaco sinuoso preparado a partir do sangue periférico de doadores humanos saudáveis usando uma preparação comercialmente disponível para isolar linfócitos, seguido por elutriação centrífuga contracorrente^{19, 20.}
2. Confirme a presença de monócitos por citofidiae e coloração com mancha de Giemsa modificada para caracterização de monócito^19.
3. Em condições estéreis, ajuste a densidade de monócitos para 1 x 10⁶ células/mL usando mídia RPMI-1640 sem soro. Adicione 1 mL desta suspensão celular para cada poço de uma placa de cultura de tecido 12 poço. Cultura em uma incubadora celular a 37 °C na presença de 5% de CO₂ para 2 h para promover a adesão à placa de cultura de tecidos.
4. Em condições estéreis, remova a mídia celular e substitua por mídia cultural RPMI-1640 completa contendo 10% (v/v) soro humano agrupado e 20 mM L-glutamina.
5. Cultura as células a 37 °C na presença de 5% DE CO₂ em uma incubadora de células por 8 dias, mudando a mídia a cada 2 dias.

2. Polarização de HMDM

1. Em condições estéreis, prepare a mídia m1 priming adicionando interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) e lipopolissaccharide (LPS; 1 μg/mL) para a completa RPMI-1640 mídia cultural. Prepare a mídia m2 priming adicionando interleucina 4 (IL-4; 20 ng/mL) para a mídia completa da cultura RPMI-1640.
2. condições estéreis, os meios de comunicação das placas de cultura de tecidos que contêm o HMDM, que foram semeados e cultivados como descrito na seção 1.
3. Lave cuidadosamente os poços que contêm as células 3x com PBS estéril (pré-aquecido a 37 °C), usando 1 mL alíquotas de PBS.
4. Adicione 1 mL da m1 ou m2 priming mídia para cada poço contendo o HMDM (o que for apropriado para o experimento).
5. Incubar as células por 48 h a 37 °C na presença de 5% de CO₂ em uma incubadora celular.

3. Estimulação de HMDM para induzir a liberação MET

1. Em condições estéreis, prepare os meios de cultura contendo diferentes estimuladores de liberação MET (o que for apropriado para o experimento) para a mídia Completa RPMI-1640: PMA (25 nM), tnfα recombinante humano (25 ng/mL), ou recombinante humano IL-8 (50 ng/mL ).
2. Para experimentos com estimulação hocl, prepare HOCl (200 μM) em HBSS (pré-aquecido a 37 °C), imediatamente antes da adição às células. Certifique-se de que o HOCl não esteja preparado em completa mídia celular.
   Nota: A concentração da solução de estoque de HOCl é quantificada medindo a absorção UV da solução em 292 nm e pH = 11⁶ e usando um coeficiente de extinção de 350 M^-1cm^-121.
3. Após o tratamento de polarização descrito na seção 2, aspirar a mídia celular de cada poço e lavar cuidadosamente as células 3x com 1 mL alíquotas de qualquer um: PBS estéril (para PMA, TNFα e IL-8) ou HBSS (para HOCl), que foram pré-aquecidos a 37 °C.
4. Para experimentos com PMA, TNFα ou IL-8: adicione 1 mL da mídia completa contendo PMA, TNFα ou IL-8 após a remoção do PBS na etapa final de lavagem.
5. Para experimentos com TNFα, incubar as células para 6 h a 37 °C na presença de 5% CO₂ em uma incubadora celular. Para experimentos com PMA e IL-8, incubar as células por 24 h a 37 °C na presença de 5% de CO₂ em uma incubadora celular.
6. Para experimentos com HOCl, adicione 1 mL de HOCl em HBSS após a remoção do HBSS na etapa final de lavagem. Em seguida, incubar as células por 15 min a 37 °C na presença de 5% de CO₂ em uma incubadora celular.
   1. Cuidadosamente aspirar o supernatant célula e lavar as células 3x com 1 mL alíquotas de HBSS como descrito no passo 3.3.
   2. Após a remoção do HBSS da etapa final da lavagem, adicione 1 mL de meios completos da cultura RPMI-1640. Em seguida, incubar as células por 24 h a 37 °C na presença de 5% de CO₂ em uma incubadora celular.

4. Visualização do MET na Cultura de Células Ao Vivo

1. Prepare o tinmodo verde SYTOX em HBSS a uma concentração de 40 μM.
2. No final dos tratamentos descritos na seção 3 para induzir a liberação do MET, adicionar diretamente 25 μL de 40 μM do tinuino a cada poço contendo HMDM.
3. Incubate células à temperatura ambiente (RT) para 5 min no escuro.
4. Coloque o HMDM em poços de cultura de tecidos no estágio do microscópio de um microscópio fluorescente invertido para imagens.
5. Procedimentos de microscópio
   1. Ligue uma fonte de luz fluorescente de amplo espectro, fonte de luz de campo brilhante e microscópio invertido instalado com uma câmera digital colorida de alta resolução (veja Tabela de Materiais).
   2. Gire a roda de filtro para a posição "número 2" para fluorescência verde (excitação = 504 nm, emissão = 523 nm) para imagens das amostras manchadas de verde contidas nos poços de cultura de tecido.
   3. Usando o objetivo 5x, concentre a imagem com o foco grosseiro, em seguida, os botões de foco fino no microscópio, até que a imagem pareça nítida, clara e focada quando vista através da ocular do microscópio.
   4. Mude o microscópio para o modo da câmera.
   5. Iniciar o software associado.
   6. Selecione a guia Capture no software.
   7. Clique no botão Play para visualizar a imagem e ajustar o botão de foco fino no microscópio até que a imagem pareça nítida, clara e focada na janela de visualização do software.
   8. Clique no botão captura.
      Nota: A imagem capturada será exibida automaticamente no software que o acompanha.
   9. Dentro do software, clique em Arquivo | Economize como o tipo de arquivo de imagem necessário.
   10. No microscópio, gire a roda de filtro para a posição "número 5" para imagens de campo brilhante e repita os passos 4,5,2-4,5,9 para obter a imagem de campo brilhante correspondente.
   11. Repita os passos 4.5.2-4.5.10 como necessário para a aquisição de imagem subseqüente.

Imagens de Brightfield mostrando as mudanças morfológicas do HMDM em resposta a estímulos para diferenciação celular são mostradas na Figura 1. M1 polarizado macrófagos de experimentos com HMDM expostos a IFNγ e LPS mostrou uma forma de célula alongada e fuso- como, como indicado pelas setas pretas na Figura 1 (painel médio). Para comparação, a morfologia dos macrófagos polarizados M2 após a exposição de HMDM a IL-4 para 48 h era tipicamente redonda e lisa, como indicado pelas setas pretas na figura 1 (painel direito distante).

A capacidade de fenótipos de HMDM diferenciados para liberar METs foi visualizada por imagens de fluorescência de células vivas com verde SYTOX, conforme apresentado na Figura 2. A Figura 2A mostra os dados de controle obtidos de cada fenótipo hmdm incubado por 24 h na ausência de quaisquer estímulos pró-inflamatórios. Neste caso, havia uma coloração verde muito limitada, como era esperado, dado a natureza impermeant da pilha desta mancha. A figura 2B mostrou a coloração positiva para METs, resultando da exposição de HMDMs M1 a HOCl, a PMA, a IL-8, ou a TNFα. Os METs são indicados pelas setas brancas, mostradas como estrias verdes, resultantes das cadeias de DNA extracelular. Com HOCl, além de manchar o DNA extracelular, havia alguma coloração verde aparente nas células. Esta coloração celular também foi observada em certa medida com os outros estímulos e acredita-se refletir a perda de integridade da membrana resultante da morte celular independente do ET como resultado das condições de tratamento.

A Figura 2B também mostra os experimentos correspondentes realizados com HMDMs M2, que foram expostos ao IL-4. Neste caso, não houve liberação de DNA das células, como indicado pela ausência das cadeias/estrias de DNA extracelular; no entanto, houve alguma captação celular de corante fluorescente verde com o HOCl e TNFα. Para fins comparativos, a Figura 3 mostra dados representativos indicando a liberação do MET dos macrófagos THP-1 expostos ao TNFα (50 ng/mL) por 4 h. Neste caso, note-se que uma população não polarizada de células foi utilizada, e os monócitos THP-1 foram diferenciados aos macrófagos por pré-tratamento com PMA (50 ng/mL por 72 h), conforme descrito anteriormente22.

Figura 1: Mudanças morfológicas de HMDMs diferencialpolarizados. Imagens representativas de campos brilhantes de HMDMs não diferenciados e diferenciados (n ≥5). Os HMDMs foram cultivados com meios completos contendo soro humano e glutamina por 8 dias antes de se prepararem para o fenótipo M1 ou M2 após a exposição a IFNγ e LPS ou IL-4, respectivamente, para 48 h. Barra de escala = 200 μm. As setas indicam exemplos de células que mostram características morfológicas de HmDMs M1 ou M2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: METs produzidos por M1 HMDMs após a estimulação HOCl, PMA, IL-8 e TNFα. Imagens representativas de HMDMs manchados de verde SYTOX de(A)M1 e M2 HMDMs não estimulados incubados por 24 h na ausência de quaisquer estímulos inflamatórios foram usados como controle, demonstrando a ausência de liberação do MET. (B) M1 e M2 HMDMs foram tratados com 1) HOCl (200 μM, 15 min), PMA (25 nM), ou IL-8 (50 ng/mL) com incubação para 24 h ou 2) TNFα (25 ng/mL) com incubação para 6 h para induzir a liberação met. Os METs foram visualizados pela adição de sytox verde, como indicado por setas brancas no painel superior de M1 HMDMs. Nenhum METS foi visto nos experimentos correspondentes com HMDMs M2. Os dados são representativos de replicar poços culturais de n ≥3 doadores individuais. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: METs produzidos por macrófagos THP-1 não polarizados após a estimulação tnfα. Imagens representativas dos macrófagos TNP-1 manchados de verde sYTOX, que foram diferenciados por pré-tratamento com PMA (50 ng/mL por 72 h) antes de mais incubação de 4 h na ausência ou presença de TNFα (50 ng/mL) para induzir a liberação do MET. Os METs foram visualizados pela adição de sytox verde. Os dados são representativos dos poços de cultura de replicar de experimentos n ≥ 3. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Os autores não têm nada a divulgar.