Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Annekatrin Holzhey; Svenja Sonntag; Johannes Rendenbach; Justus  S. Ernesti; Vinodh Kakkassery; Salvatore Grisanti; Fred Reinholz; Sebastian Freidank; Alfred Vogel; Mahdy Ranjbar

doi:10.3791/60542

Artigo de método

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

DOI:

10.3791/60542

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24 de abril de 2020

Annekatrin Holzhey^*¹ , Svenja Sonntag^*² , Johannes Rendenbach¹ , Justus S. Ernesti¹ , Vinodh Kakkassery² , Salvatore Grisanti² , Fred Reinholz³ , Sebastian Freidank³ , Alfred Vogel³ , Mahdy Ranjbar¹^,²

¹Laboratory for Angiogenesis and Ocular Cell Transplantation, University of Lübeck, ²Department of Ophthalmology, University of Lübeck, ³Institute of Biomedical Optics, University of Lübeck

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Resumo

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Os lasers Nd:YAG têm sido usados para realizar cirurgias intraoculares não invasivas, como a capsulotomia há várias décadas. O efeito incisivo depende da quebra óptica no foco do laser. Ondas de choque acústicas e bolhas de cavitação são geradas, causando ruptura tecidual. Os tamanhos das bolhas e as amplitudes de pressão variam com a energia do pulso e a posição do ponto focal. Neste estudo, os olhos de porco enucleados foram posicionados em frente a um laser Nd:YAG comercialmente disponível. Foram testadas energias de pulso variáveis, bem como diferentes posições dos pontos focais posteriores à córnea. As lesões resultantes foram avaliadas por microscopia e histologia de dois fótons para determinar os melhores parâmetros para um descolamento exclusivo de células endoteliais córneas (CEC) com dano colateral mínimo. As vantagens deste método são a ablação precisa da CEC, redução dos danos colaterais e, sobretudo, o tratamento sem contato.

Introdução

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A transparência da córnea é essencial para a transmissão da luz para a retina e seus fotorreceptores¹. Nesse sentido, um estado relativo de desidratação é fundamental para manter as fibras de colágeno dentro do estroma da córnea corretamente alinhadas. Esta homeostase é mantida por células endoteliais córneas (CEC) localizadas na membrana de Descemet (DM)². O endotélio é a camada córnea mais interna. Possui uma importante função de barreira e bomba, que é crucial para a transparência da córnea³. Em contraste com o epitélio, o endotélio não é capaz de se auto-renovar⁴. Porta....

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo tecido animal seguem as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidado Animal local.

1. Preparação da cultura de órgãos e tratamento a laser

Obtenha olhos suínos recém-enucleados do matadouro local. Mantenha-os frios (4 °C) no meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com alta glicose, suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina (1%) e soro suíno (10%), a partir de agora referido neste artigo como meio completo.
Remova os tecidos extracelulares com uma tesoura e mergulhe os olhos em uma solução oftalmológica de 5% de povidone-iodo por 5 minutos antes de ....

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Resultados

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Utilizando o procedimento aqui apresentado, tratamos os olhos com um laser Nd:YAG, avaliando diferentes energias de pulso (1,0-4,6 mJ) e posições de pontos focais (distância da superfície posterior da córnea: 0,0−0,2 mm) para encontrar os parâmetros ideais. Foram avaliadas múltiplas réplicas (n = 3) para cada constelação dos parâmetros do laser (12 x 21).

Além do protocolo acima mencionado, a amostra foi analisada com um microscópio de dois fótons antes da fixação e coloração de H&E. O mic.......

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Discussão

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Os resultados deste estudo piloto indicam que um laser Nd:YAG pode ser usado para abmar seletivamente células endoteliais da córnea quando forem escolhidos parâmetros apropriados para dose de energia e posição de ponto de foco.

Como a função endotelial é importante para a transparência da córnea e para a salvaguarda da córnea a partir de edema estromo, os modelos de disfunção endotelial desempenham um papel importante no desenvolvimento de medicamentos anti-edematosos ou procedimentos cirúrgic.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Christine Örün e Jan A. M. Sochurek pela ajuda com métodos experimentais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo
BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Criostato	Leica	CM 3050S
Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio - alto teor de glicose	PAA	E-15009
Eye holder	Auto	N/A
Microscópio Invertido	Leica	DMI 6000 B
KH₂PO₄	Merck	529568
Na₂HPO₄	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II mais
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	10010056
Soro suíno	Sigma-Aldrich	12736C
Tomógrafo de coerência óptica de domínio espectral	Placa de cultura de tecidos Heidelberg Engineering	Spectralis
Microscópio de dois fótons
Viscoelastic	OmniVision	Methocel

de 833921 Sarstedt de 12 poços JenLab DermaInspect

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative ....

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Etiquetas

Abla o a Laser Nd YAG Cirurgia Intraocular N o Invasiva Modelo de Olho Porcino Microscopia de Dois F tons An lise Histol gica Abla o Celular Seletiva Otimiza o de Par metros do Laser Protocolo de Fixa o de Tecidos Corte em Criostato

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