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Artigo de método

Fusão célula-célula de linhas celulares editados do genoma para perturbação da estrutura celular e função

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DOI:

10.3791/60550

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7 de dezembro de 2019

 , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2The Medical Research Council Cancer Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge, 3Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é fundir dois tipos de células diferentes para criar células híbridas. A análise da microscopia da fluorescência de pilhas fundidas é usada para seguir a pilha da origem de organelas celulares. Este ensaio pode ser usado para explorar como a estrutura celular e função responder à perturbação por fusão celular.

Resumo

A vida é espacialmente divisória dentro das membranas lipídicas para permitir a formação isolada de estados moleculares distintos dentro de células e organelas. A fusão celular é a fusão de duas ou mais células para formar uma única célula. Aqui nós fornecemos um protocolo para a fusão celular de dois tipos de células diferentes. As células híbridas fundidas são enriquecidas pela classificação baseada em citometria de fluxo, seguida supérpia de fluorescência da estrutura e função das células híbridas. As proteínas fluorescentemente marcadas geradas pela edição do genoma são imagemdas dentro de células fundidas, permitindo que estruturas celulares sejam identificadas com base na emissão de fluorescência e referenciadas de volta ao tipo de origem celular. Este método robusto e geral pode ser aplicado a diferentes tipos de células ou organelas de interesse, para compreender a estrutura celular e função em uma série de questões biológicas fundamentais.

Introdução

A manutenção homeostática da estrutura celular é fundamental para a vida. As células têm morfologias características, números de organelasubcelulares e composição bioquímica interna. Compreender como essas propriedades fundamentais são geradas e como elas dão errado durante a doença requer ferramentas de laboratório para perturbá-las.

A fusão celular é a fusão de duas ou mais células separadas. A fusão celular pode ter sido fundamental para o surgimento da vida eucariótica1. No corpo humano, a fusão celular é relativamente rara, ocorrendo durante circunstâncias de desenvolvimento restritas e tipos de tecido, como durante a fertilização ou a formação de músculo, osso e a placenta2. Este protocolo descreve a indução da fusão celular-célula em linhas celulares da cultura do tecido com organelas diferencialmente rotuladas fluorescentemente, como uma ferramenta para entender os mecanismos que controlam a estrutura e a função celular.

A fusão celular induzida in vitro é central para a produção de anticorpos monoclonais3,uma ferramenta importante para pesquisa biológica e tratamento de doenças. A fusão celular também tem sido usada para fazer muitas perguntas biológicas de células fundamentais diferentes sobre a dominância do ciclo celular4,aneuploide5,6,reprogramação celular7,8,o reparo dos neurônios danificados9,proliferação viral10, apoptose11, tumorigênese12,dinâmica citosquelética13,e fusão de membrana14,15. Métodos baseados em laboratório para induzir a fusão celular-célula16,17,18,19 induzir a coalescência da membrana lipídica através da fusão física de dois bilayers em um. A fusão celular pode ser induzida pela eletricidade18,métodos baseados em virais17,aquecimento termoplósma20,expressão transgênica19,e produtos químicos, incluindo polietileno glicol (PEG)16,21,22.

Os centros são centros organizadores de microtúbulos que controlam a forma celular, a motilidade, a polarização e a divisão23. Raízes centrosomal são estruturas fibrosas que se estendem de centrossomes contendo a raiz de proteína24 (codificada pelo gene CROCC). Recentemente usamos a fusão celular-célula para entender como a posição e o número centrosome variam dentro dos heterokaryons em relação às células parentais24. A lógica por trás do uso deste método é rastrear a célula de origem das raízes dentro de um heterokaryon após a fusão de células parentais diferencialmente fluorescentes marcadas e, portanto, a fusão e fissão de organela de imagem. As proteínas fluorescentemente marcadas rootletin-meGFP ou rootletin-mScarlet-I são criados pela edição do genoma em linhas celulares separadas que são então fundidos pela fusão celular peg-mediada. Descrevemos o uso de corantes celulares(Tabela de Materiais)para identificar células fundidas por citometria de fluxo e subsequente identificação de microscopia de fluorescência da célula de origem e morfologia centrosome (Figura 1). Esta abordagem é um método robusto e único para estudar como as principais mudanças no estado celular, incluindo o número organela impinge sobre a homeostase celular.

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Protocolo

1. Rotulagem de células fluorescentes diferenciais

  1. Marcação de genes com CRISPR Cas9
    1. Use crispr cas9 genoma edição para tag rootletin (ou outros genes de interesse) com as proteínas fluorescentes meGFP ou mScarlet-I em linhas de células cancerosas humanas.
      Nota: Protocolos detalhados para edição do genoma são cobertos em outros lugares24,25,26.
  2. Rotulagem de corante fluorescente
    1. Crescer cal51 células cancerosas humanas no meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) complementada com 10% de soro bovino fetal (FBS), L-glutamina e 100 μg/mL penicilina/estreptomicina a 37 °C e 5% DECO 2 em uma incubadora umidificada.
      Nota: É importante garantir que as células sejam regularmente verificadas quanto à ausência de contaminação por micoplasma e à identidade da linha celular. Não use células que tenham sido extensivamente passagens na cultura (>15 passagens). As células devem ser saudáveis e crescer exponencialmente. Evite a sub-confluência ou a confluência excessiva.
    2. Semente cada tipo de célula (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I e células Cal51 não escalonadas parentais) de modo que ~ 6 x 106 células estão presentes no dia seguinte para cada amostra, em uma confluência de 70-90%.
      Nota: Este é aproximadamente um frasco da cultura do tecido T75 ou um prato de 10 cm por tipo da pilha. As células parentais não escalonadas são necessárias como um controle negativo mais tarde no protocolo. Este protocolo permite a produção de ~ 20.000 células fundidas, mas este número pode ser aumentado através da ampliação do protocolo com um aumento do número de lotes.
    3. No dia seguinte, pré-enxame DMEM, trippsina e 1x fosfato tampão soro soro (PBS), colocando-os em um banho de água em 37 °C.
    4. Lave as células rootletin-meGFP e rootletin-mScarlet-I 2x na PBS derramando ou aspirando do meio e substituindo por 10 mL de PBS.
    5. Etiqueta Cal51 raiz-meGFP pilhas adicionando 500 nM tina de célula violeta(tabela dos materiais)em PBS para 1 min na temperatura ambiente (RT).
    6. Rótulo Cal51 rootletin-mScarlet-I células, adicionando 200 nM corantes de célula sfar vermelho(Tabela de Materiais)em PBS por 1 min em RT.
      Nota: Mantenha amostras protegidas da luz sempre que possível após a coloração fluorescente, para evitar o photobleaching da fluorescência.
    7. Pare as reações de rotulagem de tinuosos adicionando 10 mL de DMEM por 5 min.
    8. Retire as células Cal51 parentais não rotuladas da incubadora (do passo 1.2.2).
      Nota: Essas células serão usadas mais tarde como controles negativos não rotulados (passo 3.3.2).
    9. Lave todas as células uma vez derramando fora do meio de crescimento e substituindo por 10 mL de PBS.
    10. Despeje pbs e incubar por 5 min em condições de cultura com 1 mL de pré-aquecido 1x trypsin.
    11. Transfira as células para um tubo cônico de plástico de 15 mL e centrífuga a 1000 x g por 5 min.
    12. Retire cuidadosamente e descarte a triptina da pelota celular com uma pipeta.
    13. Gentilmente resuspender a violeta e muito vermelho pelotas de células rotulados em 1 mL de PBS.
    14. Resuspende delicadamente a pelota de célula parental (não fluorescente) em 1 mL de DMEM e retorne à incubadora.
      Nota: Esta amostra não será submetida à fusão celular-célula, mas será usada mais tarde durante a citometria de fluxo.

2. Fusão celular

  1. Misture 3 x 106 células com rótulo violeta com 3 x 106 células com rótulo vermelho distante em um tubo de 15 mL, tubulação suavemente juntos 0,5 mL de cada tipo de célula usando uma pipeta de 1 mL.
  2. Centrífuga as células restantes não misturadas do passo 2.1 a 1.000 x g para 5 min, em seguida, derramar PBS, resuspender a pelota em 1 mL de DMEM e retornar à incubadora.
    Nota: Estas amostras não misturadas restantes de marca ção única serão usadas mais tarde como controles negativos e de compensação na seção 3 do protocolo.
  3. Centrífuga as células mistas do passo 2.1 a 1.000 x g para 5 min e cuidadosamente aspirar PBS usando uma pipeta de 1 mL.
  4. Adicione 0,7 mL de 50% 1450 PEG solução de uma forma dropwise para a pelota celular (passo 2,3) usando uma pipeta de 1 mL durante um período de 30 s.
  5. Deixe por 3,5 min no RT.
    Nota: O tempo de incubação com PEG pode ser otimizado dependendo do tipo celular, embora note que o tempo de incubação mais longo aumenta a toxicidade celular.
  6. Adicione 10 mL de DMEM sem soro dropwise para 30 s e deixe na incubadora por 10 min.
  7. Desça a 1.000 x g por 5 min, descarte o supernatant e resuspenda suavemente em 1 mL de meio completo (DMEM contendo FBS).
    Nota: Vá diretamente para a seção 3. Há toxicidade associada à exposição PEG seguida de citometria e imagem de fluxo, de modo a manter as células em condições de cultura, tanto quanto possível, procedendo rapidamente entre as etapas.

3. Triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para enriquecer células fundidas

  1. Prepare todas as células para citometria de fluxo, tubulação suavemente cada amostra separadamente através de um filtro de 70 μm em um tubo FACS.
    Nota: São necessárias quatro amostras: células fundidas, células vermelhas distantes com rótulo único, células violetas com rótulo único, células parentais não rotuladas. Uma vez removido do capô da cultura do tecido estéril, as células têm a capacidade de se infectar, então minimize o tempo de exposição das amostras para um ambiente não estéril a partir daqui. As células são classificadas em meio DMEM completo.
  2. Use um citometro capaz de classificar uma única célula.
    1. Configure o classificador de células para um tipo asséptico. Executar o controle de qualidade do instrumento de acordo com a recomendação do fabricante.
    2. Desenhe um lote da dispersão para diante contra a dispersão lateral e um lote da discriminação do doublet.
  3. Criar portões para identificar células fundidas.
    1. Excite os corantes fluorescentes em comprimentos de onda de 405 nm e 635 nm. Detectar em 450 nm e 660 nm (violeta e comprimentos de onda vermelhos distantes, respectivamente). Enredo muito vermelho versus violeta comprimentos de onda.
    2. Executar células parentais não rotuladas através do citometro e registrar a intensidade da fluorescência.
      Nota: Valores acima desta linha de base definem positividade para coloração de tinuosidade.
    3. Executar únicas células violetas rotulados através do citometro. Confirme que não há transbordamento de violeta no canal vermelho distante.
    4. Executar única rotulada células vermelhas distantes através do citometro e confirmar que não há transbordamento de vermelho distante no canal violeta.
      Nota: Para os dados representativos mostrados, as células foram classificadas em 20 psi em um classificador equipado com um bico de 100 μm.
    5. Executar brevemente a amostra de fusão para confirmar que as células fundidas são visíveis com os portões criados na etapa 3.3.
  4. Alinhe o fluxo de classificação centralmente em um prato de imagem de 8 poços.
  5. Facs classificar células fundidas, presente como violeta dupla mente positiva e muito vermelho células rotuladas diretamente em um prato de imagem de 8 poços contendo 100 μL de médio de crescimento.
    Nota: O número máximo recomendado de células é de ~ 50.000 por prato de 8 poços. Garantir a saúde celular durante a triagem. A confluência celular pode influenciar a saúde celular para manter as células entre 20 a 90% de confluência pós-triagem, classificando um número adequado de células para o prato de imagem. Cada gota classificada contém aproximadamente 3 nL de fluido de bainha. Certifique-se de que o fluido de bainha não dilui significativamente o meio de crescimento durante a triagem.
  6. Logo após a triagem, leve as células de volta para a incubadora e deixe para >2 h ou durante a noite.
    Nota: As células aderentes irão gradualmente readerir ao deslizamento de cobertura durante este período, a partir da triagem em diante, e, portanto, sua morfologia mudará ao longo do tempo se levado diretamente para o microscópio.

4. Coloração imunofluorescente e imagem de fusões de células celulares

Nota: As células fundidas podem ser imagemdas ao vivo ou após fixação e mais coloração fluorescente (ou ambas), dependendo dos experimentos e medições necessários.

  1. Imagem de células vivas
    1. Substitua o meio de crescimento por meio de imagem sem fenol vermelho(Tabela de Materiais)e prossiga diretamente para a imagem.
  2. Fixação e coloração
    1. Prepare paraformaldeído fresco de 4% (PFA) na PBS.
    2. Corrigir as células, incubando-os em 100 μL de 4% PFA para 15 min em RT. Remover PFA após 15 min.
      CUIDADO: PFA é tóxico quando inalado por isso esta etapa deve ser realizada em um capô de fumaça com equipamentos de proteção individual adequados.
      Nota: Após a fixação, o experimento pode ser pausado e reiniciado mais tarde, se necessário. Guarde a amostra a 4 °C protegida da luz, se necessário.
    3. Lave as células 3x em 200 μL de PBS na RT.
    4. Permeabilize as células por 10 min na RT em 200 μL de 0,1% surfactante nonionic(Tabela de Materiais)e 0,1% detergente nonionic(Tabela de Materiais) diluído em PBS.
    5. Bloco em 200 μL de 3% albumina de soro bovina na PBS por 30 min na RT.
    6. Incubate com anticorpos em 150 μL de PBS contendo 3% albumina de soro bovina e surfactante nonionic de 0,1% e detergente nonionic de 0,05% por 1 h na RT.
      Nota: Os anticorpos primários usados para gerar os resultados representativos são nanobody anti-GFP fluorescentemente conjugados (usado em 1:400 diluição), e fluorescente conjugados anti-mScarlet-I nanobody (usado em 1:500 diluição). Estes realçam o sinal das proteínas já fluorescentes.
    7. Lave 2x por 5 min em 300 μL de PBS e, em seguida, sair em 200 μL de PBS.
      Nota: As amostras são imaged em PBS. As amostras podem ser armazenadas a 4 °C protegidas da luz.
  3. Aquisição de imagem
    1. Adquirir imagens com um microscópio de fluorescência apropriado capaz de imagens de quatro cores (por exemplo, iluminação confocal, widefield, estruturada).
    2. Excite meGFP e mScarlet-I canais com 488 nm e 561 nm lasers de comprimento de onda, respectivamente. Definir detectores para detectar em ~ 505−550 nm e ~590−650 nm. Excite canais de tinuismo violeta e vermelho com 405 nm e 633 lasers nm, respectivamente. Definir detectores para detectar em ~ 430-500 nm e ~ 660-750 nm.
    3. Empiricamente determinar a intensidade do laser de tal forma que o photobleaching significativo não ocorre e que as células permanecem saudáveis (se imagens de células vivas).
    4. Empiricamente determinar o ganho de tal forma que o sinal é obtido sem saturar ou artificialmente recorte de valores de pixel.
    5. Coletar dados z-pilha, de tal forma que as imagens são tridimensionais, cobrindo um intervalo de 20-60 μm com ~ 500 μm tamanho passo.
      Nota: As imagens mostradas em dados representativos foram adquiridas por confocal(Figura 2B),Airyscan(Figura 2C)ou microscopia de iluminação estruturada ( Figura2D). Cada célula é um heterokaryon de boa-fé se contivesse corantes violetas e vermelhos distantes sobrepostos no citoplasma.

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Resultados

Células devidamente rotuladas são visíveis durante a citometria de fluxo por sinal de fluorescência maior do que as células de controle não rotuladas (Figura 2A). As portas são ajustadas para a classificação de pilhas positivas dobro, enriquecendo esta população diretamente em pratos da imagem latente para umas análises microscópicas mais adicionais. As células fundidas são detectáveis como células distintas duplamente positivas fluorescentem...

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Discussão

Demonstramos um protocolo fácil e econômico para a fusão de células e a visualização da arquitetura subsequente de híbridos celulares com microscopia, levando aproximadamente dois dias do início ao fim. Partes críticas deste protocolo são o enriquecimento de células fundidas por classificação celular (seção 3 protocolar), e validação cuidadosa de células fundidas por microscopia (seção de protocolo 4). Estas seções garantem que as células fundidas são facilmente obtidas e são heterokaryons de boa-fé. Concentrações e temp...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por um Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship para R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant número 100090/12/Z). O financiador não teve nenhum papel no projeto do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos a Ashok Venkitaraman e Paul French por conselhos críticos e orientações sobre o projeto. Agradecemos a Chiara Cossetti e Gabriela Grondys-Kotarba no Instituto de Pesquisa Médica de Cambridge Flow Citometria facilidade para um excelente apoio. Agradecemos a Liam Cassiday, Thomas Miller e Gianmarco Contino pela revisão do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 15 mLSarstedt62554502
solução de formaldeído a 37%Sigma-AldrichF8875
880 Microscópio de varredura a laser confocal AiryscanZeiss
Ibidi80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanocorpoChromotekgba-488
BD Influx Classificador de CélulasBD Biosciences
Albumina de soro bovinoFiltros de Células Sigma-AldrichA7906
(70 μ m)BiofilCSS010070
CellTrace Far RedThermoFisher ScientificC34572
CellTrace VioletThermoFisher ScientificC34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glicose alta, GlutaMAX, piruvatoThermoFisher Scientific31966021
Fetal Soro BovinoSigma-Aldrich10270-106
FluoTag-X2 nanocorpo de alpaca anti-mScarlet-INanoTag BiotechnologiesN1302-At565
L15 CO2 meio de imagem independenteSigma-Aldrich21083027
Penicilina/estreptomicinaSigma-Aldrich15140122
DMEM livre de vermelho de fenol, alta glicoseThermoFisher Scientific21063029
Solução salina tamponada com fosfato (1x PBS)8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2HPO4, dH2O até 1 L
Polietilenoglicol Hybri-Max 1450Sigma-AldrichP7181
Tubos de polipropilenoBD Falcon352063
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151surfactante não iônico
TripsinaSigma-AldrichT4049
Tween 20Fisher BioReagentsBP337detergente não iônico
Carl Placas de imagem de 8 poços

Referências

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