Demonstrado aqui é um método eficiente e econômico para purificar, cultura e diferenciar células-tronco de matéria branca do cerebelo de rato pós-natal.
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Artigo de método
Purificação de Prominin-1+ Células-tronco do Rato Pós-Natal Cerebellum
Neste artigo
Resumo
Resumo
A maioria dos neurônios cerebelares surge de dois nichos embrionários: um nicho labial rombônico, que gera todos os neurônios glutamatergicos excitatórios cerebelares, e um nicho de zona ventricular, que gera as células purkinje sinógicas inibidoras, que são neurônios que constituem os núcleos cerebelares e a glia de Bergman. Recentemente, um terceiro nicho de células-tronco foi descrito que surge como uma zona germinal secundária do nicho da zona ventricular. As células deste nicho são definidas pelo marcador de superfície celular prominin-1 e são localizadas para a matéria branca em desenvolvimento do cerebelo pós-natal. Este nicho explica a camada molecular de nascimento tardio dos interneurônios GABAergic, juntamente com os astrócitos cerebelares gerados no pós-natal. Além de seu papel de desenvolvimento, esse nicho vem ganhando importância translacional no que diz respeito ao seu envolvimento na neurodegeneração e tumorigênese. A biologia dessas células tem sido difícil de decifrar devido à falta de técnicas eficientes para sua purificação. Aqui estão demonstrados métodos eficientes para purificar, cultura rastamente e diferenciar essas células-tronco cerebelares pós-natal.
Introdução
O cerebelo foi há muito reconhecido como um grande circuito neuronal que coordena o movimento voluntário1. Ele recebe entrada das amplas faixas do neuroeixo, que inclui informações proprioceptivas da periferia, de modo a ajustar a saída do motor e coordenar o movimento. Mais recentemente, também foi implicado na regulação da cognição e das emoções por potencialmente usar redes de processamento de informações semelhantes2,3,4.
O cerebelo adulto é composto por um córtex cerebelar externo e matéria branca interior. Intercalados....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011) do NIH e aprovados pelo IACUC da Universidade northwestern (Protocolo IS00011368).
1. Preparação de Soluções
- Preparar a solução de dissociação tecidual feita a partir do fenol estéril contendo a solução de soro tamponado de dulbecco (DPBS) com papaína (100 U/ml), cisteína (0,2 mg/ml) e DNase (250 U/ml).
- Para preparar a solução DNase diluir 100 mg do pó liofilizado de DNase I (uma garrafa) em 50 mL de H2O. Misture bem e filtre a solução de estoque. Prepare as alíquotas de estoque de 10 ....
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Resultados
As células-tronco cerebelares pós-natal prominin-1-positivas formaram neuroesferas na média neurosfera rica em fatores de crescimento (EGF e bFGF). Estas neuroesferas foram positivas para a coloração de prominin-1, o marcador usado para o isolamento, e também como uma mancha para outros marcadores de células-tronco como Nestin e GFAP13 (Figura 1). A expressão do marcador de células-tronco foi mantida em toda a cultura e por pelo menos oito passagens2.......
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Discussão
As células-tronco cerebelares expressas em prominin-1 residem na matéria branca em potencial durante as primeiras 3 semanas de vida pós-natal. Sua proliferação é fortemente controlada pela via de ouriço sônico apoiada pelas células Purkinje17. Essas células-tronco/progenitores contribuem para interneurônios GABAergic os nascidos posteriormente chamados células cestas e células estelares. Estes interneurônios residem na camada molecular, onde sinapse nas células purkinje e esculpe a topografia do P.......
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Divulgações
Não são declarados conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório opala por suas sugestões. Este trabalho foi apoiado pelas subvenções do NIH 1RO1 NS062051 e 1RO1NS08251 (Opal P)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0,05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solução | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microesferas | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma | A9418 | |
| Coluna MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Placas de cultura ultra - baixo anexo | Corning | 3473 | |
| Cisteína | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco' s Tampão fosfato solução salina | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's solução salina balanceada-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Fator de crescimento básico de fibroblastos recombinante humano | Promega | G507A | 20 ng / mL |
| Fator de crescimento epidérmico recombinante humano | Promega | G502A | 20 ng / mL |
| Fator inibidor de leucemia | Sigma | L5158 | |
| l-glutamina | Gibco | 25030081 | |
| Microscopia | Lieca TCS SP5 microscópios | ||
| MiniMACS separador | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 em 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 em 200 |
| Meio neurobasal | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Fator de crescimento derivado de plaquetas | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Anti-tubulina de coelho, b-III | Sigma | T2200 | 1 em 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako Z0334 | 1 em 500 | |
| Colunas de separação-Colunas MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Filtro de células estéreis | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μ m |
Referências
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al.
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Reimpressões e permissões
