Artigo de método

Gerando paisagens químicas controladas e dinâmicas para estudar comportamento microbiano

DOI:

10.3791/60589

⸱

31 de janeiro de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

É apresentado um protocolo para a geração de paisagens químicas dinâmicas por fotolise dentro de configurações microfluidas e milfluidas. Essa metodologia é adequada para estudar diversos processos biológicos, incluindo o comportamento motil, a absorção de nutrientes ou adaptação a produtos químicos de microrganismos, tanto no nível celular quanto populacional.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstramos um método para a geração de pulsos químicos controlados e dinâmicos — onde o quimioatrativo localizado se torna subitamente disponível na microescala — para criar microambientes para experimentos microbiano de quimioterapia. Para criar pulsos químicos, desenvolvemos um sistema para introduzir fontes de aminoácidos quase instantaneamente por fotolise de aminoácidos enjaulados dentro de uma câmara microfluida de polimetilsiloxano (PDMS) contendo uma suspensão bacteriana. Aplicamos esse método à bactéria quimotática, Vibrio ordalii, que pode escalar ativamente esses gradientes químicos dinâmicos enquanto é rastreado por microscopia de vídeo. Os aminoácidos, tornados biologicamente inertes ('enjaulados') por modificação química com um grupo de proteção fotoremovível, estão uniformemente presentes na suspensão, mas não estão disponíveis para consumo até sua liberação repentina, que ocorre em pontos definidos pelo usuário no tempo e espaço por meio de um feixe LED focado em UV-A próximo. O número de moléculas liberadas no pulso pode ser determinado por uma relação de calibração entre o tempo de exposição e a fração incessante, onde o espectro de absorção após a fotolise é caracterizado pelo uso da espectroscopia UV-Vis. Uma membrana policarbonato nanoporosa (PCTE) pode ser integrada ao dispositivo microfluido para permitir a remoção contínua pelo fluxo dos compostos sem tampa e da mídia gasta. Uma ligação forte e irreversível entre a membrana PCTE e a estrutura microfluida PDMS é alcançada revestindo a membrana com uma solução de 3 aminopropidaltriethoxysilane (APTES) seguida pela ativação plasmática das superfícies a serem ligadas. Um sistema controlado por computador pode gerar sequências definidas pelo usuário de pulsos em diferentes locais e com diferentes intensidades, de modo a criar paisagens de recursos com variabilidade espacial e temporal prescrita. Em cada paisagem química, a dinâmica do movimento bacteriano na escala individual e seu acúmulo no nível populacional podem ser obtidas, permitindo assim a quantificação do desempenho quimotático e seus efeitos sobre as agregações bacterianas em ambientes ecologicamente relevantes.

Introdução

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Micróbios dependem de quimotáxis, processo de detecção de gradientes químicos e modificação da motilidade na resposta1, para navegar em paisagens químicas, abordar fontes de nutrientes e hospedeiros e escapar de substâncias nocivas. Esses processos de microescala determinam a cinética macroescala das interações entre micróbios e seu ambiente2,3. Os recentes avanços em microfluidos e tecnologias de microfabricação, incluindo alitografia4, revolucionaram nossa capacidade de criar microambientes controlados para estudar as interações dos micróbios. Por exemplo, experimentos anteriores estudaram quimiotáxibacteria susindo gerando gradientes altamente controlados e estáveis de concentrações intermediárias a altas de nutrientes5,6. No entanto, em ambientes naturais, gradientes químicos de microescala podem ser de curta duração — dissipados por difusão molecular — e as condições de fundo são muitas vezes altamente diluídas7. Para medir diretamente a resposta quimiotática de populações microbianas expostas pela primeira vez a ambientes químicos instáveis, criamos e aqui descrevemos métodos para combinar tecnologia microfluida com fotolise, imitando gradientes que as bactérias selvagens encontram na natureza.

A tecnologia uncing emprega sondas sensíveis à luz que encapsulam funcionalmente biomoléculas de forma inativa. A irradiação libera a molécula enjaulada, permitindo a perturbação direcionada de um processo biológico8. Devido ao rápido e preciso controle da química celular que o uncaging oferece9,a fotolise de compostos enjaulados tem sido tradicionalmente empregada por biólogos, fisiologistas e neurocientistas para estudar a ativação dos genes10, canais íons11e neurônios12. Mais recentemente, os cientistas aproveitaram as vantagens significativas da fotolise para estudar quimotaxe13, para determinar a dinâmica de troca de flagella de células bacterianas individuais expostas a um estímulo quimioatraidor depassos 14,15, e para investigar padrões de motilidade de células de esperma única em gradientes tridimensionais (3D)16.

Em nossa abordagem, implementamos a fotolise de aminoácidos enjaulados dentro de dispositivos microfluidos para estudar a resposta comportamental de uma população bacteriana a pulsos químicos controlados, que se tornam quase instantaneamente disponíveis através da foto-lançamento. O uso de um objetivo de baixa ampliação (4x) (NA = 0,13, profundidade de foco aproximadamente 40 μm) permite tanto a observação da resposta agregadora em nível populacional de milhares de bactérias sobre um grande campo de visão (3,2 mm x 3,2 mm), quanto a medição do movimento no nível unicelular. Apresentamos duas aplicações deste método: 1) a liberação de um único pulso químico para estudar a dinâmica de acumulação bacteriana-dissipação a partir de condições uniformes, e 2i) a liberação de pulsos múltiplos para caracterizar a dinâmica de acumulação bacteriana em condições de quimioterapia variadas e espacialmente heterogêneas. Este método foi testado na bactéria marinha Vibrio ordalii realizando quimioterapia em direção ao glutamato aminoácido17,mas o método é amplamente aplicável a diferentes combinações de espécies e quimioatraintes, bem como a processos biológicos além da quimotaxe (por exemplo, absorção de nutrientes, exposição a antibióticos, sensoriamento de quórum). Essa abordagem promete ajudar a elucidar a ecologia e o comportamento dos microrganismos em ambientes realistas e descobrir as trocas ocultas que as bactérias individuais enfrentam ao navegar por gradientes dinâmicos efêmeros.

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Protocolo

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1. Fabricação do Dispositivo Microfluido para o Experimento Único de Pulso Químico

  1. Projete o canal usando o software de design auxiliado por computador (CAD) e imprima-o em um filme de transparência para criar a máscara fotográfica (Figura 1A).
  2. Fabricar o mestre por litografia suave (em condições de sala limpa).
    1. Limpe um wafer de silício (4 polegadas) em rápida sucessão com acetona, metanol e isopropanol, depois seque usando nitrogênio. Asse o wafer no forno a 130 °C por 5 min.
    2. Coloque o wafer no centro de um spin-coater e despeje foto SU-8 fotoresistem no wafer. Aumente a velocidade do spin-coater até 500 rpm acima de 5 s, e mantenha-se a 500 rpm por 10 s. Rampa até a velocidade final acima de 10 s e mantenha-se a esta velocidade para 30 s.
      NOTA: O valor exato da velocidade final depende da espessura de revestimento direcionada e do SU-8 usado.
    3. Após o processo de revestimento de spin, asse o wafer a 65 °C e depois a 95 °C. Deixe o wafer esfriar à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 5 min.
      NOTA: O tempo de cozimento depende da espessura direcionada e tipo de fotoresiste usado. Como regra geral, para cada camada de 100 μm o wafer deve ser assado por 5 min a 65 °C e 45 min a 95 °C.
    4. Coloque a máscara fotográfica no wafer para garantir que apenas a região de interesse seja exposta e polimerizada. Expor à luz UV pelo tempo recomendado no manual SU-8.
      NOTA: Aqui, com energia de exposição de 200 mJ cm-2 a um comprimento de onda de 350 nm, o wafer foi exposto por 150 s.
    5. Asse o wafer a 65 °C e 95 °C pelo tempo recomendado no manual su-8.
      NOTA: Como regra geral, para cada camada de 100 μm o wafer deve ser assado por 5 min a 65 °C e 45 min a 95 °C.
    6. Mergulhe o wafer em um béquer cheio de desenvolvedor de metocrilato de polimetil (PMMA) para obter o mestre. Agite suavemente o béquer para garantir que a fotoresistnão polimerizada seja lavada. Asse o mestre a 200 °C para ligar ainda mais a camada SU-8.
  3. Prepare uma mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) combinando o elastômero com seu agente de cura(Tabela de Materiais) a uma proporção de 10:1 em um béquer (aqui, 40 mL). Misture vigorosamente até que o líquido seja homogêneo.
    NOTA: A mistura PDMS parecerá opaca porque as bolhas são geradas durante o processo de mistura.
    ATENÇÃO: Para evitar que a pele entre em contato com produtos químicos ou materiais biológicos potencialmente perigosos, use sempre um jaleco e luvas de plástico descartáveis em todo o protocolo e siga quaisquer protocolos de segurança específicos de acordo com o Material Ficha de dados de segurança (MSDS).
  4. Degasa a mistura PDMS em uma câmara de vácuo por 45 min na RT. Para agilizar o processo, libere periodicamente o vácuo para estourar as bolhas que se formam na interface.
    NOTA: O processo de degasagem deve ser realizado dentro de 1h para evitar que a mistura de PDMS comece a curar.
  5. Retire a poeira da superfície do mestre com um limpador pressurizado, em seguida, despeje a mistura de PDMS desgasejado no mestre e asse em um forno a 80 °C por 2 h.
    NOTA: Alternativamente, assar durante a noite (ou por pelo menos 12 h) a 60 °C alcançaria o mesmo PDMS endurecido.
  6. Corte o PDMS com uma lâmina ao redor das microestruturas (a uma distância de aproximadamente 5 mm) e, em seguida, retire cuidadosamente o PDMS do mestre.
  7. Furos para servir como inlet e saída do microcanal (aqui, uma dentro e uma tomada, ver Figura 1A). Certifique-se de que nada toque na face inferior do PDMS onde as características estão localizadas.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. O microcanal deve ser selado com fita adesiva para evitar acúmulo de poeira e outras partículas durante o armazenamento.
  8. Conecte o microcanal PDMS a um escorregador de vidro.
    1. Limpe completamente um toboçador de vidro com sabão, água isopropanol e desonizada. Deixe o vidro deslizar seco ou usar ar comprimido para acelerar o processo.
    2. Remova partículas de poeira, batendo com fita adesiva. Ligue o microcanal PDMS no escorregador de vidro limpo, imediatamente após tratar ambas as superfícies com plasma (usando um sistema corona ou uma câmara de oxigênio plasmático) por 2 min.
    3. Coloque o dispositivo microfluido para aquecer em uma placa quente a 80 °C por pelo menos 1h para fortalecer a ligação química com o vidro.

2. Fabricação do dispositivo milífluido impresso em 3D para o experimento com pulsos múltiplos

  1. Projete a forma 3D usando software de design 3D e imprima o mestre para o molde PDMS com uma impressora 3D de alta resolução(Figura 1B).
    NOTA: Consulte tabela de materiais para a impressora 3D e material de molde usado para criar o mestre.
  2. Repita os passos 1.3-1.4, em seguida, limpe a superfície do mestre, batendo com fita adesiva. Coloque o mestre em uma escala, então, evitando a região central do mestre que será ocupada pela membrana, despeje sobre a quantidade exata de mistura de PDMS não curada (aqui, 23,4 g) para obter a altura desejada de PDMS, combinando com a altura do mestre (aqui, 0,5 mm). Remova todas as bolhas restantes com a ajuda de ar comprimido.
  3. Coloque o PDMS lançado no mestre em um forno a 45 °C para assar por pelo menos 12 h.
  4. Conecte o molde 3D PDMS a uma placa de Petri.
    1. Retire delicadamente a camada de PDMS endurecida e perfura a inlet e os furos de saída para a injeção da suspensão bacteriana(Figura 1C).
    2. Ative tanto a superfície de uma placa de Petri (90 mm x 15 mm) quanto o molde PDMS com plasma de oxigênio por 2 min. Conecte o molde PDMS na placa de Petri. Pressione suavemente o molde para a placa de Petri, mas não pressione onde as características estão localizadas, pois isso pode desmoronar na câmara de interrogatório.
    3. Coloque a placa de Petri ligada ao molde PDMS 3D em um forno a 45 °C por pelo menos 12 h para fortalecer a ligação química.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
  5. Funcionalização da superfície da membrana18
    1. Ative a membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) em uma câmara de plasma de oxigênio por 1 min na RT.
      ATENÇÃO: Evite usar um sistema corona para a ativação do plasma porque danificará a membrana.
    2. um capô químico, diluir uma solução comercial de 3 aminopropidaltriethoxysilane (APTES) em água deionizada para 1% em volume (aqui, 40 mL), usando um tubo de polipropileno.
      ATENÇÃO: A solução APTES é extremamente tóxica (pontuação 3 de risco à saúde do MSDS) e deve ser tratada com extremo cuidado exclusivamente um capuz químico com luvas. Troque as luvas imediatamente após o manuseio da solução APTES. Os vapores APTES são destrutivos para as membranas mucosas e o trato respiratório superior. Os órgãos-alvo da APTES são nervos, fígado e rim. Se um capô de fumaça não estiver disponível, um escudo facial e um respirador de rosto completo devem ser implementados.
    3. Transfira a solução APTES diluída em uma placa de Petri e mergulhe a membrana ativada na solução APTES por 20 min.
    4. Remova a membrana da solução APTES com pinças e coloque-a em uma limpeza para secar.
  6. Para a fabricação dos canais microfluidos PDMS que ficarão na membrana e permitirão a lavagem da arena bacteriana, repita os passos 1.1-1.7.
  7. Ligar os canais de lavagem PDMS à membrana funcionalizada.
    1. Ative tanto o canal de lavagem PDMS quanto a membrana PCTE com uma câmara de plasma de oxigênio por 2 min.
      NOTA: A membrana, que será sanduíche entre duas camadas De PDMS, deve ser menor que o canal de lavagem PDMS.
    2. Imediatamente após o tratamento plasmático, coloque a membrana funcionalizada e o canal de lavagem PDMS em contato pressionando suavemente o canal de lavagem PDMS na membrana.
      NOTA: Não aplique pressão excessiva nesta fase, pois pode causar (irreversível) fixação da membrana ao teto do canal, bloqueando o canal.
  8. Sanduíche a membrana entre duas camadas PDMS(Figura 1E).
    1. Ative tanto o canal de lavagem pdms laminado ligado - membrana PCTE quanto o molde 3D PDMS anteriormente ligado à placa de Petri com uma câmara de plasma de oxigênio por 2 min. Leve-os para contato e pressione juntos.
    2. Coloque a placa petri ligada à estrutura do sanduíche em um forno a 45 °C por pelo menos 12 h para fortalecer a ligação química.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. Cultura Celular

  1. Cresça uma população de V. ordalii (cepa 12B09 ou 12B09pGFP) durante a noite por 20 h em 2216 médio19 em um shaker orbital (600 rpm) a 30 °C e células de colheita em fase exponencial tardia. Para isolados que abrigam pGFP, adicione espectinomicina (50 μg mL-1) para manter o plasmídeo.
  2. Centrífuga uma alíquota de 1 mL de células a 2500 x g por 3 min, remova o supernatant e resuspenda as células em 1 mL de água do mar artificial filtrada. Repita este passo.
  3. Fome a população de V. ordalii em um agitador orbital (600 rpm) a 30 °C por 3h.
  4. Prepare uma solução artificial de água do mar de 10 mM (aqui, 1 mL) de 4-metoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate (MNI-caged-L-glutamato) e armazene a -20 °C.
    NOTA: Proteja a soluçãoMNI-caged-L-glutamate da luz ambiente para evitar a foálise.
  5. Diluir as células 50x resuspendendo as células famintas em uma solução artificial de água do mar de 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato.
    NOTA: Isso garantirá uma concentração bacteriana final inferior a 5 x 107 mL-1 (o valor exato depende da concentração inicial de células no exponencial tardio, que é tipicamente ~109 mL-1). A concentração bacteriana foi estimada utilizando-se um espectrofotômetro em densidade óptica (OD) de 600 nm.

4. Calibração do Protocolo Descarado

  1. Coloque uma gota (20 μL) de uma solução artificial de água do mar de MNI-enjaulado-L-glutamate20 em uma concentração C0 = 10 mM em um slide de vidro. Encapsular a gotícula cobrindo-a com uma câmara de PDMS circular (diâmetro d = 5 mm, altura h = 250 μm).
  2. Coloque o deslizamento de vidro em um palco de microscópio e exponha toda a câmara por 20 ms a um feixe de LED a um comprimento de onda de 395 nm (potência de 295 mW) usando um objetivo de 4x (abertura numérica [NA] = 0,13).
  3. Abra a câmara PDMS e extrai uma gotícula (1 μL) para análise com um espectrômetro UV-Vis.
  4. Repita as etapas 4.1-4.3 para diferentes períodos de iluminação led de 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (ou até saturação da reação química) e 0 s (para obter o fundo). Reproduza as etapas do procedimento 4.1-4.4 pelo menos 3x (aqui, 4x).
  5. Do espectro de absorção, extrair o valor em 405 nm, que representam o pico no espectro de absorção da molécula da gaiola21. Para determinar a taxa k da reação química incessante pela exposição led14,use a seguinte equação cinética de primeira ordem para o ajuste numérico dos dados experimentais17
    figure-protocol-1
    onde C(t) é o valor do espectro de absorção da solução a 405 nm (após a remoção de antecedentes) com um tempo de sem esclerose de segundos. Por um pequeno tempo de semeado t tal que kt 1, Eq. 1 pode ser simplificado para a formulação linear
    figure-protocol-2

5. Experimento de pulso químico único

  1. Mantenha o canal microfluido vácuo por 20 minutos para reduzir a concentração de gás dentro do PDMS para que as bolhas sejam menos propensas a se formar durante o processo de enchimento.
  2. Extrair o canal da bomba de vácuo e introduzir imediatamente a suspensão bacteriana diluída em 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato em água do mar artificial para o microcanal usando suavemente uma micropipeta para evitar danos flageladores por forças mecânicas de cisalhamento (aqui, todo o processo de enchimento levou de 5 a 10 s). Depois de encher o canal com a suspensão bacteriana, chupe a solução em excesso com papel toalha e veda a linto e saída com plugues PDMS pressionando-os suavemente para os buracos.
    NOTA: Desta forma, o fluxo de fluidos na câmara é impedido.
  3. Coloque o microcanal em um palco de microscópio e mova o palco para definir o campo de visão no meio do canal. Configure o microscópio para realizar imagens em contraste de fase (objetivo 4x) a uma taxa de quadrode de 12 fps.
    NOTA: Esse valor pode ser variado, mas não deve ser inferior a 10 fps para permitir a reconstrução das trajetórias bacterianas através da análise de imagens (ver protocolo seção 7).
  4. Coloque o pinhole da viga LED na abertura mínima. Ao definir o tempo de exposição da câmera para 5 s, grave alguns quadros para obter medições precisas da localização espacial e tamanho do feixe led.
    NOTA: A fonte de luz LED se conecta ao iluminador epi-fluorescência do microscópio através da conexão de guia de luz líquida. O feixe led não afeta a captura de vídeo, pois a aquisição de vídeo e a estimulação led são comandadas independentemente via software.
  5. Realizar imagens contínuas por uma duração total de 10 min (20 min para o maior pulso químico), e ativar simultaneamente o feixe de LED focado em 395 nm para a duração desejada (neste experimento, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) em um ponto de tempo definido pelo usuário (aqui, 10 s após o início da aquisição de vídeo) via microscópio. Para obter várias réplicas do mesmo processo, mova o palco para registrar a resposta bacteriana sobre diferentes posições do canal microfluido. Reproduza este procedimento para cada tamanho do pulso, usando um novo microcanal.
    NOTA: O processo de semeamento gera um pulso cilíndrico eixométrico que difunde radialmente para fora no plano de imagem.
  6. Realizar experimentos separados sem o empenhamento químico em maior ampliação (objetivo de 20x, NA = 0,45) a uma taxa de quadros mais alta (50 fps) para registrar o movimento imparcial de natação das bactérias.

6. Experimento múltiplo de pulso químico

  1. Mantenha a câmara milifluida vácuo por 20 min.
  2. Coloque a placa petri contendo a câmara milfluida em um estágio de microscópio. Encha a câmara abaixo da membrana com a suspensão bacteriana diluída (aqui, todo o processo de enchimento levou de 10-15 s) de GFP-fluorescente V. ordalii em 1 mM MNI-caged-L-solução glutamato em água do mar artificial. Depois de encher o canal com a suspensão bacteriana, chupe a solução em excesso com papel toalha e veda a linto e saída com plugues PDMS pressionando-os suavemente para os buracos.
    NOTA: Desta forma, o fluxo de fluidos na câmara é impedido. Para permitir uma melhor visualização de bactérias nesta configuração onde a imagem ocorre através da membrana nanoporosa, é fortemente recomendável usar cepas fluorescentes em vez do tipo selvagem (como usado no único experimento químico-pulso).
  3. Encha uma seringa com uma solução artificial de água do mar de 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato e conecte a tubulação à entrada e saída do canal de lavagem acima da membrana.
  4. Conecte a tubulação a um reservatório de resíduos e certifique-se de que a tubulação está totalmente submersa no reservatório de resíduos fluidos para evitar oscilações de pressão.
  5. Defina a taxa de fluxo adequada na bomba de seringa (aqui, 50 μL min-1) para obter a taxa média de fluxo desejada no canal de lavagem, que depende da geometria do canal.
  6. Inicie a bomba de seringa para estabelecer o fluxo no canal de lavagem acima da membrana.
  7. Execute o software controlando o feixe led e o estágio do microscópio para gerar sequências definidas pelo usuário de pulsos em diferentes locais e com diferentes intensidades.
    NOTA: O fluxo contínuo da solução artificial de água do mar de 1 mM MNI-enjaulado-L-glutamato no canal de lavagem acima da membrana reabastece a solução composta enjaulada e lava o meio gasto da arena bacteriana.
  8. Grave vídeo usando um objetivo de 4x em intervalos de tempo regulares durante um período de várias horas e em vários locais contíguos para cobrir uma superfície grande (aqui, 1 cm x 1 cm, Figura 1F).

7. Análise de Imagens e Análise de Dados

  1. Reconstrução das trajetórias bacterianas
    1. A partir dos filmes gravados com o objetivo 4x, reconstruir as trajetórias bacterianas usando o software de rastreamento17.
      NOTA: Essas trajetórias representam as projeções 2D do movimento bacteriano 3D no microcanal.
    2. A partir das trajetórias bacterianas reconstruídas, determine a velocidade de deriva radial de cada indivíduo nadando projetando sua velocidade de natação sobre a direção em direção ao centro do pulso químico (Figura 2D). Para visualização da dinâmica spatio-temporal da velocidade de deriva radial, use uma grade de binning com tamanho espacial 75 μm x 75 μm e janela temporal de intervalo de 5-10 s(Figura 2D,E).
      NOTA: Devido à simetria cilíndrica do processo, os dados podem ser analisados em coordenadas polares e médios sobre a dimensão angular (Figura 3).
    3. A partir das trajetórias bacterianas reconstruídas, determine a dinâmica spatio-temporal da distribuição de bactérias à medida que respondem aos pulsos químicos (Figura 2E).
    4. A partir dos filmes de maior resolução registrados com o objetivo de 20x durante os experimentos de pulso único, extrair a distribuição da velocidade da natação e correr tempo para a população bacteriana à medida que respondem ao pulso químico (Figura 4).
  2. Estimar o coeficiente de difusão das bactérias considerando a dinâmica de dissipação da população bacteriana após a quimioterapia ser concluída17 (aqui, para t > 300 s; Figura 3).
  3. Esgote o coeficiente de difusão do glutamato aplicando a equação de Stokes-Einstein
    figure-protocol-3
    onde as moléculas de aminoácidos são consideradas partículas esféricas com raio hidrodinâmicode 22rG, kB é a constante boltzmann (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T é a temperatura (296 K), e ele é a viscosidade dinâmica da água do mar artificial (salinidade 36 g kg-1) a 23 °C (10-3 Pa s23)

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Resultados

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Usamos os dispositivos microfluidos e milífluidos(Figura 1)para estudar perfis de acumulação bacteriana em condições dinâmicas de nutrientes. Trajetórias bacterianas foram extraídas de vídeos gravados adquiridos pela microscopia de contraste de fase da dinâmica de acumulação-dissipação de uma população bacteriana após um pulso químico liberado pela fotolise(Figura 2 e Figura 3). Com uma média de milhões de trajetórias, a dinâmica sp...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse método permite que os pesquisadores estudem quimotáxis bacterianos gradientes controlados e dinâmicos em dispositivos micro e milífluidos, permitindo a aquisição de dados reprodutíveis. A criação quase instantânea de pulsos químicos na microescala por fotolise visa reproduzir os tipos de pulsos de nutrientes que as bactérias encontram na natureza a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, a disseminação difusiva de plumas atrás de partículas marinhas afundando25, ou o nutriente que se ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a primeira instalação de microfabricação na ETH Zurique. Este trabalho foi apoiado por um Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (to D.R.B.), um Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (to R.S.), e uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência da Suíça 1-002745-000 (para R.S.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(3-Aminopropil) trietoxissilano (APTES)Sigma-AldrichA3648>98% de pureza, tubo CELLSTAR altamente tóxico
Greiner Bio-One210261Centrífuga de 50 ml
Eppendorf5424Rpara eliminar os meios gastos da cultura bacteriana
Incubadoras digitais Incu-LineVWR-CH390-0384para assar 3D master
DusterVWR-CH16650-22para limpar o wafer e os microcanais
Placa quenteVWR-CH444-0601para ligar os microcanais
IsopropanolSigma-AldrichW292907
Tubos de microcentrífuga LightSafeSigma-AldrichZ6883121,5 ml
MATLABMathworkspara análise de imagens e rastreio
bacterianoTubo de microcentrífugaEppendorf301200861,5 ml
Lâmina de vidro para microscópioVWR-CH631-1552
Microscópio Nikon Eclipse TiENikon InstrumentsMEA53100com platina motorizada
MNI-GlutamatoTocris Bioscience1490>98 % de pureza, fotossensível
Equipamento de impressão de moldesStratasysObjet30 3D impressora
Serviço de impressão de moldesEstúdios de impressão 3DCustomhttps://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop Um espectrofotômetro UV-VisThermo Fisher ScientificND-ONE-Wpara calibrar o desenjaulamento
Elementos NISNikon InstrumentsImagem de microscópio Software
Forno Venti-LineVWR-CH466-3516para cozer PDMS (com convecção forçada)
Fotorresistente SU-8-3050MicroChem Corp.SU8-3050
Câmara de plasma ZeptoDiener ElectronicZEPTO-1para funcionalizar as superfícies antes de colar
Membrana de policarbonatoSterlitechPCT04471000,4 µ m tamanho do poro, 19% de área aberta, 24 µ m de espessura
Microtubing de polietilenoScientific CommoditiesBB31695-PE/2I.D. x O.D.: 0,015" x 0,043" / 0,38mm x 1,09mm
Placa de Petri de poliestirenoVWR-CH25373-100superfície inferior (90 mm x 15 mm) para colar o dispositivo milifluídico
EscalaVWR-CH611-2605para pesar a mistura PDMS
câmara sCMOS Andor ZylaOxford Instrumentspara microscopia de contraste de fase e fluorescência (máx. 100 fps)
Sal marinhoInstant OceanProduto nº. SS1-160p
SolidWorks 2015Dassault Systemes SolidWorksUsado para projetar o molde
Spectra X motor leveLumencolorpara LED 395 nm
Sylgard 184Dow Corning110-41-155PDMS Si Kit de Elastômero; agente de cura
Seringa (Luer-Lok)B Braun Omnifix4616308F
SeringaAgulha AganiA228de 10 a 30 ml
Bomba de Seringa 11 Pico Plus EliteHarvard Apparatus70-4506Terumo Agani 23 gauge 5/8 polegada (16mm)
VeroGreyStratasysBomba de Seringa Dupla
Vortex-GenieScientific IndustriesSI-0236Material do Molde

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895(2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985(2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548(2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231(2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

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