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Artigo de método

Privação Visual Monocular e Medição de Plasticidade de Dominação Ocular no Córtex Visual Primário do Camundongo

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DOI:

10.3791/60600

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8 de fevereiro de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Clinical Hospital of Chengdu Brain Science Institute, MOE Key Lab for NeuroInformation, University of Electronic Science and Technology of China, 2Sichuan Institute for Brain Science and Brain-inspired Intelligence, 3Department of Electronic Engineering, City University of Hong Kong, 4Centre for Biosystems, Neuroscience, and Nanotechnology, City University of Hong Kong

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos detalhados para privação visual monocular e análise de plasticidade de dominação ocular, que são métodos importantes para estudar os mecanismos neurais da plasticidade visual durante o período crítico e os efeitos de genes específicos em desenvolvimento visual.

Resumo

A privação visual monocular é um excelente paradigma experimental para induzir a plasticidade de resposta cortical visual primária. Em geral, a resposta do córtex ao olho contralateral a um estímulo é muito mais forte do que a resposta do olho ipsilateral no segmento binóculo do córtex visual primário do camundongo (V1). Durante o período crítico dos mamíferos, suturar o olho contralateral resultará em uma rápida perda de capacidade de resposta das células V1 para estimulação ocular contralateral. Com o desenvolvimento contínuo de tecnologias transgênicas, cada vez mais estudos estão usando camundongos transgênicos como modelos experimentais para examinar os efeitos de genes específicos na plasticidade de dominação ocular (OD). Neste estudo, introduzimos protocolos detalhados para privação visual monocular e calculamos a mudança na plasticidade od no mouse V1. Após a privação monocular (MD) por 4 dias durante o período crítico, as curvas de ajuste de orientação de cada neurônio são medidas, e as curvas de ajuste da camada quatro neurônios em V1 são comparadas entre a estimulação dos olhos ipsilaterais e contralaterais. O índice de viés contralateral (ICB) pode ser calculado usando o escore ocular de OD de cada célula para indicar o grau de plasticidade od. Esta técnica experimental é importante para estudar os mecanismos neurais da plasticidade da OD durante o período crítico e para o levantamento dos papéis de genes específicos no desenvolvimento neural. A maior limitação é que o estudo agudo não pode investigar a mudança na plasticidade neural do mesmo camundongo em um momento diferente.

Introdução

A privação visual monocular é um excelente paradigma experimental para examinar a plasticidade V1. Para estudar a importância da experiência visual no desenvolvimento neural, David Hubel e Torsten Wiesel1,2 gatinhos privados de visão normal em um olho em vários pontos de tempo e por períodos variados de tempo. Eles então observaram as mudanças na intensidade de resposta em V1 para os olhos privados e não privados. Seus resultados mostraram um número anormalmente baixo de neurônios reagindo ao olho que havia sido suturado fechado nos primeiros três meses. No entanto, as respostas dos neurônios nos gatinhos permaneceram idênticas em todos os aspectos aos olhos de um gato adulto normal que foi suturado fechado por um ano, e os gatinhos não se recuperaram. MD em gatos adultos não pode induzir plasticidade od. Portanto, o impacto da experiência visual na fiação V1 é forte durante uma breve e bem definida fase de desenvolvimento, antes e depois da qual os mesmos estímulos têm menos influência. Tal fase de maior suscetibilidade à entrada visual é conhecida como o período crítico no córtex visual.

Embora o camundongo seja um animal noturno, neurônios individuais no camundongo V1 têm propriedades semelhantes aos neurônios encontrados em gatos3,4,5. Nos últimos anos, com o rápido desenvolvimento da tecnologia transgênica, um número crescente de estudos em neurociência visual tem usado camundongos como modelo experimental6,7,8. Em estudos visuais de camundongos, neurocientistas usam mutantes e linhas de ratos de nocaute, que permitem o controle sobre a composição genética dos camundongos. Embora os camundongos V1 não tenham colunas od, neurônios únicos na zona binocular V1 mostram propriedades significativas de OD. Por exemplo, a maioria das células responde mais fortemente à estimulação contralateral do que à estimulação ipsilateral. O fechamento temporário de um olho durante o período crítico induz uma mudança significativa na distribuição do índice OD9,10,11. Portanto, o MD pode ser usado para estabelecer um modelo de plasticidade de OD para investigar como genes envolvidos em distúrbios do desenvolvimento neural influenciam a plasticidade cortical in vivo.

Aqui, introduzimos um método experimental para MD e sugerimos um método comumente usado (gravação eletrofisiológica) para analisar a mudança na plasticidade od durante a privação visual monocular. O método tem sido amplamente utilizado em muitos laboratórios por mais de 20 anos12,13,14,15,16. Existem outros métodos utilizados na medição da plasticidade od também, como o potencial visual crônico evocado (VEP) registrando17, e imagen óptica intrínseca (IOI)18. A vantagem significativa deste método agudo é que é fácil de seguir, e os resultados são notavelmente confiáveis.

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Protocolo

Neste protocolo, camundongos C57Bl/6 masculinos foram obtidos do Instituto de Animais De Laboratório da Academia de Ciências Médicas de Sichuan e do Hospital Popular Provincial de Sichuan. Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, Universidade de Ciência Eletrônica e Tecnologia da China.

1. Privação monocular (DM) no dia pós-natal 28 em camundongos

  1. Coloque as ferramentas cirúrgicas, a agulha de sutura (0,25 mm de diâmetro, diâmetro da corda 0,07 mm) e os cotonetes de algodão em uma caixa de alumínio e autoclave-los a 120 °C por 0,5 h. Estique a capô com 75% de etanol. Seque as ferramentas cirúrgicas em um forno de secagem.
  2. Prepare uma solução de 2% de agarose, coloque-a em um banho de água a 75 °C para evitar solidificar.
  3. Use isoflurane misturado com oxigênio para anestesiar o camundongo (2% de indução e manutenção de 1,2-1,5%). Conserte o mouse no aparelho estereotaxic e use um dispositivo regulador de calor para manter a temperatura do corpo do rato em 37 °C e evitar hipotermia.
  4. Aplique uma fina camada de pomada ocular à base de petróleo em ambos os olhos.
  5. o microscópio anatômico com iluminação, sutura a pálpebra em um olho. Faça a agulha passar pelos dois lados da pálpebra 2x (Figura 1A) e faça cerca de quatro pontos.
  6. Aça o rosca 2-3x e depois corte o fio. Aplique 3 μL de cola de secagem instantânea no nó para aumentar sua estabilidade. Em seguida, corte o fio extra de sutura.
  7. Forneça uma injeção intraperitoneal de buprenorfina (1 mg/kg) ao camundongo.
  8. Transfira o rato para uma almofada de aquecimento para manter sua temperatura corporal a 37 °C e evitar hipotermia e monitorá-lo até recuperar a consciência.
  9. Quando o rato estiver totalmente acordado coloque-o em uma gaiola separada.
  10. Verifique as pálpebras diariamente para garantir que elas permaneçam fechadas e não infectadas. Exclua o mouse se uma abertura de pálpebras for encontrada.
  11. Antes da gravação eletrofisiológica, use isoflurane misturado com oxigênio para anestesiar o camundongo (2% de indução e manutenção de 1,2-1,5%).
  12. Remova os pontos com tesoura ocular para expor o globo ocular. Aparar cuidadosamente as pálpebras dos olhos.
  13. Lave o olho com a solução da lente e verifique o olho um microscópio para obter clareza. Exclua camundongos com opacidades córneas ou sinais de infecção.

2. Craniotomia na região binocular do rato V1 após privação monocular no 4º dia

  1. Depois de anestesiar o mouse, verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta a uma pitada de dedo do dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo.
  2. Coloque e conserte o mouse no aparelho estereotaxic. Ajuste a altura da barra de ouvido e a haste do dente para manter o cérebro plano e estável.
  3. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo.
  4. Aplique uma pomada ocular à base de petróleo na superfície dos olhos para mantê-los úmidos.
  5. Remova o cabelo na cabeça do rato para expor sua pele. Esfregue a pele com esfregões alternados de iodo e 70% de etanol 3x.
  6. Incime uma área de 8 x 8 mm da pele entre as orelhas para expor o crânio e remover o tecido do couro cabeludo. Em seguida, remova o tecido conjuntivo sobreposto com 30% de peróxido de hidrogênio.
  7. Faça um buraco de 1 x 1 mm no crânio acima do cerebelo. Afixar um pequeno parafuso ósseo no buraco como referência.
  8. Realizar uma pequena craniotomia de 1 mm de diâmetro na região binocular V1 do hemisfério contralateral até o olho privado (Figura 1B, A-P: lambda -0,51-lambda +1,67 mm; M-L: -2,6- -3,0 mm; D-V: 0-1 mm). Remova cuidadosamente o fragmento do crânio sem machucar o cérebro.
  9. Cubra a superfície cortical exposta com 75 μL de 2% de agarose a 40 °C para evitar a secagem.
  10. Conserte um eletrodo de tungstênio na moldura estereotaxica. Coloque o eletrodo de tungstênio verticalmente na superfície do córtex exposto, a região binocular de V1, para garantir que as células que são registradas reajam aos dois olhos.
  11. Use cotonetes de algodão para remover o gel ocular e aplique óleo de silício no olho a cada 2 h.

3. Estimulação visual e gravação eletrofisiológica

  1. Mascarar o olho com placa de plástico não transparente. Posicione um monitor LCD a 23 cm do olho do mouse.
  2. Reduza a anestesia para 0,5-0,8% quando o mouse estiver totalmente anestesiado.
  3. Avance o eletrodo de microeletrodo lentamente com um micromanipulador hidráulico de óleo. Pare quando uma alta relação sinal-ruído é observada e o eletrodo for avançado para a camada 4 (Figura 1C, aproximadamente 250-450 μm de profundidade). Certifique-se de que o fator amplificador seja fixado em 1.000, o filtro de 300-100 Hz e a taxa de amostra a 40 Hz.
  4. Apresentar uma grade sinusoidal em campo completo (Figura 1D, 12 direções, 100% contraste, 2 Hz de frequência temporária, 0,04 ciclos por grau de frequência espacial) no monitor LED.
  5. Meça a resposta da célula estimulando o olho ipsilateral e contralateral separadamente. Presente de 3-5x total.
  6. Meça as respostas de cinco a oito células em cada penetração. Realize de quatro a seis penetrações em cada mouse.
  7. Após a gravação, ajuste a vazão de isoflurano para 5% ou mais, continue a exposição ao isoflurano por 1 min e, em seguida, realize a luxação cervical.
    NOTA: Penetrações separadas foram espaçadas pelo menos 200 μm de distância na zona binocular V1.

4. Classificação de pico off-line e análise de dados

  1. Detecte picos quando o sinal bruto cruza um nível de limiar. Alinhar picos capturados no primeiro pico positivo ou negativo. Use software para detectar picos de diferentes células.
  2. Coloque dois cursores: um positivo e outro para deflexão negativa. Defina o modelo de pico(Figura 2A). Defina a área de modelo para isso com a variação mais significativa entre diferentes classes de picos.
  3. Use a análise principal do componente para separá-los em clusters. Os métodos de agrupamento podem variar entre diferentes laboratórios.
  4. Classifique o pico de um limite usando o algoritmo k-means.
  5. Correlacionar a orientação com a taxa de disparo de pico e traçar as curvas de ajuste de orientação para o olho ipsilateral e contralateral.
  6. Calcule o índice OD para a unidade única, que representa a relação de força de resposta contralateral/ipsilateral:
    figure-protocol-1
    onde Rcontra e Ripsi são a resposta ideal da célula para o olho contralateral e ipsilateral, respectivamente, e Rspon é a atividade espontânea da célula.
  7. Atribuir pontuação oD para 1-7 da seguinte forma: − 1 a −0,75 = 1; −0,75 a −0,45 = 2; −0,45 a −0,15 = 3; −0,15 a 0,15 = 4; 0,15 a 0,45 = 5; 0,45 a 0,75 = 6; e 0,75 a 1 = 7.
  8. Calcular o índice de viés contralateral (ICB):
    figure-protocol-2
    onde N é o número da célula, e nx iguala o número da célula com pontuações od igual a x.

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Resultados

Os resultados experimentais aqui descritos permitem medições bem sucedidas de plasticidade de MD e OD de um rato privado e não privado durante o período crítico (P19-P32). A Figura 1 mostra como realizar gravações de unidade única na camada 4 da V1 a zona binocular para comparar respostas no olho ipsilateral e contralateral 4 dias após o MD. A Figura 2 mostra as medidas de classificação e ajuste de orientação para estimular os olhos ipsilaterais e contralaterais...

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Discussão

Apresentamos um protocolo detalhado para MD e medindo plasticidade od por gravação de unidade única. Este protocolo é amplamente utilizado na neurociência visual. Embora o protocolo de DM não seja complicado, existem alguns procedimentos cirúrgicos críticos que devem ser seguidos cuidadosamente. Primeiro, há dois detalhes importantes garantindo a qualidade da costura. A sutura é suficientemente estável se os pontos estiverem concentrados na porção medial da pálpebra. Além disso, 3 μL de cola é aplicado na cabeça do nó pa...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de CiênciaNatural da China (81571770, 81771925, 81861128001).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
502 colaM & Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
Cartão de AquisiçãoNational InstumentPCI-6250
AgaroseBiowestG-10
Amplificador A-M SystemModelo 1800
AtropinaAladdin Bio-Chem Technology Co., LtdA135946-5
Aparelho Estereotáxico CerebralRWD Life Science Co., Ltd68001
Tesoura de mola Cohan-VannasFine Science Tools15000-02
Soluções de lentes de contatoBeijing Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd.Cotonetes de
algodãoGM17064 Henan Guangderun Medical Instruments Co., Ltd
Porta-agulhas finasSuZhou Stronger Medical Instruments Co., LtdCZQ1370
Forcep66 Vision Tech Co., Ltd.53320A
Fórceps66 Vision Tech Co., Ltd.53072
Fórceps66 Tecnologia Co. da visão, Ltd.#5
Almofada de aquecimentoStrykerTP 700 T
IluminadorMotic China Group Co., Ltd.MLC-150C
IsofluranoRWD Life Science Co., LtdR510-22
Monitor LCDPhilips (China) Investment Co., Ltd.39PHF3251 / T3
MicroscópioSOPTOPSZMT1
de sinais vitais não invasivo MicromanipuladorMouseox
NARISHIGE International Ltd.PC-5N06022
Petrolatum Eye GelDezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd.17C801
Spike2Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino UnidoSpike2 Versão 9
Tesoura cirúrgica66 Vision Tech Co., Ltd.54010
Tesoura cirúrgica66 Vision Tech Co., Ltd.54002
agulha de suturaNingbo Medical Co., Ltd3/8 arco 2.5 * 8
eletrodo de tungstênioFHC, IncL504-01B
XylocaineHuaqing
AWG97028 Monitor hidráulico de óleo

Referências

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