Obtenção de dados de transcriptome de alta qualidade de sementes de cereal por um método modificado para criação de perfil de expressão genética

Resumo

É apresentado um método para traçar o perfil de transcriptome dos cereais. O perfil de expressão genética baseado em microarray começa com o isolamento do RNA total de alta qualidade dos grãos de cereal e continua com a geração de CDNA. Após a rotulagem cRNA e a hibridização do microarray, recomendações para detecção de sinais e controle de qualidade.

Resumo

A caracterização da expressão genética depende da qualidade do RNA. Na germinação, desenvolvimento e sementes de cereais maduros, a extração de RNA de alta qualidade é frequentemente dificultada pelo alto teor de amido e açúcar. Esses compostos podem reduzir tanto o rendimento quanto a qualidade do RNA total extraído. A deterioração da quantidade e da qualidade do RNA total pode, posteriormente, ter um impacto significativo nas análises transcriptômicas a jusante, que podem não refletir com precisão a variação espacial e/ou temporal no perfil de expressão genética das amostras que estão sendo testadas. Neste protocolo, descrevemos um método otimizado para extração de RNA total com quantidade e qualidade suficientes para análise de transcriptome inteiro de grãos de cereais. O método descrito é adequado para várias aplicações a jusante utilizadas para o perfil transcriômico de sementes de cereais em desenvolvimento, germinação e maturação. O método de criação de perfil de transcriptome usando uma plataforma de microarray é mostrado. Este método é especificamente projetado para o perfil de expressão genética de cereais com seqüências de genoma descritas. O procedimento detalhado desde o manuseio do microarray até o controle final de qualidade é descrito. Isso inclui a síntese de cDNA, rotulagem de cRNA, hibridização de microarrays, varredura de slides, extração de recursos e validação da qualidade dos dados. Os dados gerados por este método podem ser utilizados para caracterizar a transcrição de cereais durante a germinação, em vários estágios de desenvolvimento de grãos, ou em diferentes condições de estresse biótico ou abiótico. Os resultados aqui apresentados exemplificam dados de transcrição de alta qualidade passíveis de análises de bioinformática a jusante, como a determinação de genes expressos diferencialmente (DEGs), caracterização de redes reguladoras genéticas e realização de estudo de associação em toda a transcrição (TWAS).

Introdução

A transcrição representa o conjunto completo de transcrições de ácido ribonucleico (RNA) expressas pelo genoma de um organismo em um determinado momento e em particular condições ambientais e de crescimento. Cada célula tem sua transcrição individual, o que reflete seu estado fisiológico e metabólico atual. Uma coleção de células derivadas de um tecido ou órgão semelhante é usada em um estudo típico de transcriptome, mas as transcrições de células únicas e espacialmente resolvidas estão ficando populares¹. As análises transcriptômicas começam com a extração do RNA total de um tecido selecionado em um ponto de tempo específico, e em condições de crescimento definidas. Para isso, recomendamos o uso de um método recém-desenvolvido para a extração de RNA total de amostras ricas em amido ou teor de açúcar, como sementes de cereais². A comparação dos transcriptomas entre diferentes amostras resulta na identificação de moléculas de RNA com diferentes abundâncias. Essas moléculas de RNA são consideradas como genes diferencialmente expressos (DEGs). A abundância de transcrições derivadas de genes marcadores específicos pode então ser usada para estimar o estado de desenvolvimento ou determinar a resposta de um organismo às flutuações ambientais. Genes sem alterações detectáveis em sua abundância de transcrição através dos pontos de tempo de desenvolvimento em estudo são frequentemente usados como referência ou genes de limpeza.

O RNA é tipicamente detectado e quantificado por vários métodos, como a mancha do Norte e a reação em cadeia de polimerase reversa quantitativa (qRT-PCR), mas os métodos atuais de transcrição de alto desempenho dependem fortemente da hibridização do ácido nucleico usando a tecnologia de microarray, bem como o sequenciamento de RNA (RNA-Seq). O RNA-Seq é muito popular no momento porque oferece várias vantagens para aplicações transcriômicas de alto executo, como revisado em outros lugares^3,4. Embora seja uma tecnologia mais antiga, o perfil de expressão genética usando chips de micromatriz ainda é amplamente utilizado porque é uma tecnologia mais estabelecida, que requer menos experiência em bioinformática. Em comparação com o RNA-Seq, os conjuntos de dados gerados a partir de experimentos de microarray são menores e mais fáceis de analisar. Além disso, é mais rentável, especialmente se lidar com grandes números de amostras. Em nosso laboratório, utilizamos rotineiramente análises transcriômicas utilizando a tecnologia micromatriz para determinar o papel dos hubs centrais regulatórios que regem as redes moleculares e caminhos envolvidos no crescimento, desenvolvimento e metabolismo dos grãos de cereais^5,6,7,8,9. Também o utilizamos rotineiramente para realizar estudos de perfil de expressão genética em todo o genoma para obter uma compreensão mecanicista da resposta dos grãos de cereais aos estresses abióticos¹⁰, bem como na condução de estudos de associação de transcriptome-wide (TWAS) e estudos de mapeamento de vinculação para identificar genes responsáveis pela qualidade e nutrição dos grãos de cereais^11,12. Outros grupos também utilizaram a tecnologia microarray no fornecimento de atlas de expressão genética específicos para o desenvolvimento em cevada^13,arroz^14,,15,,16,sorgo¹⁷e trigo¹⁸.

O objetivo desta publicação é fornecer um breve resumo textual e uma descrição visual detalhada do método que atualmente empregamos em nosso laboratório para o perfil transcriômico de grãos de cereais usando uma plataforma de micromatriz Agilent. Observe que outras plataformas de microarray estão disponíveis, mas não serão cobertas neste método. Iniciamos o protocolo apresentando uma descrição detalhada da extração de RNA do desenvolvimento ou germinação de sementes de cereais. Com base em nossa experiência, obter uma transcrição de alta qualidade e alta quantidade passível de análises transcriômicas a jusante é frequentemente o gargalo ao usar tecidos de sementes de cereais. Tentamos vários kits de extração de RNA disponíveis comercialmente, mas nenhum deles forneceu resultados satisfatórios. Assim, desenvolvemos um protocolo de extração química para obter um extrato de RNA bruto que é então submetido à purificação de colunas usando um kit comercialmente disponível. Usando este método, rotineiramente e reprodutivelmente obtemos RNA² de alta qualidade (Figura 1),que pode ser usado para diferentes aplicações a jusante para gerar um perfil de transcriptome.

Protocolo

1. Extração e purificação total de RNA

NOTA: Trabalhe sempre sob a capa de fumaça, pois este método envolve o uso de solventes orgânicos voláteis prejudiciais. Pré-aqueça um tubo de microfuge de água sem nuclease em bloco de calor de 50 °C antes de começar o experimento. Esta água sem nuclease será usada para eluir o RNA total da coluna spin no Passo 1.8.

1. Aterram separadamente as amostras, cada uma com pelo menos três réplicas biológicas, em um pó fino usando uma argamassa esterilizada e pilão que são pré-resfriados em nitrogênio líquido.
   1. Colher as amostras em pó usando uma pequena espátula metálica mergulhada em nitrogênio líquido e colocar as amostras em pó em tubos de microfuge sem nuclease de 2,0 mL, também pré-mergulhados em nitrogênio líquido. Armazene imediatamente as amostras no congelador de temperatura ultrabaixa (-80 °C) até o dia alocado para extração de RNA em lote (STOP POINT).
      NOTA: As amostras de sementes podem ser moídas em pó fino com ou sem deshusking. Para o arroz, rotineiramente moemos as amostras sem desembaçar porque a casca contém sílica que pode ajudar durante o processo de moagem.
      ATENÇÃO: Este passo deve ser feito rapidamente e sob condições estritamente criogênicas. Uma opção para a automação é moer as amostras usando um moinho de bolas criogênicas para minimizar a degradação do RNA e a deterioração da qualidade.
2. Obter um extrato de RNA bruto utilizando aproximadamente 200 mg da amostra original em pó. Adicione individualmente cada amostra a um tubo de microfuge sem nuclease contendo 750 μL de Tampão de Extração de RNA (100 mM Tris, pH 8.0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-mercaptoetanol) e 500 μL de fenol:cloroform:isoamyl (25:24:14:14:
   1. Misture todas as amostras ao mesmo tempo por 5 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice de vários tubos definido em alta velocidade. Imediatamente mantenha todos os tubos no gelo por dois min.
      ATENÇÃO: Trabalhe sempre dentro da capa de fumaça, especialmente para todas as etapas que envolvam fenol, clorofórmio e outros solventes orgânicos. O ideal é usar uma capa de fumaça larga que possa acomodar uma centrífuga de bancada, misturador de vórtice, misturador de vórtice de vários tubos e misturador rotativo de vários tubos.
3. Separe o extrato de RNA bruto dos detritos por centrifugação a 14.000 x g por 10 min. Faça todas as etapas de centrifugação nas mesmas configurações para esta seção.
   1. Transfira aproximadamente 800 μL de sobrenadante para um novo tubo de microfusão de 2,0 mL contendo 400 μL de 1,2 M NaCl e 700 μL de isopropanol. Misture a solução suavemente por inversão 5x.
   2. Precipitar o RNA incubando em um congelador de temperatura regular (-20 °C) ou ultrabaixa (-80 °C), por pelo menos 1 h (ou durante a noite).
      PONTO STOP ou PAUSE: basta manter as amostras no congelador regular -20 °C para pausar por algumas horas. Para passar a noite ou um ponto de parada mais longo, armazene as amostras em freezer de temperatura ultrabaixa (-80 °C).
4. Obtenha uma pelota de RNA bruta por centrifugação a 18.800 x g por 15 min. Depois de descartar o sobrenadante, purifique a pelota bruta de RNA por purificação de coluna usando um Mini Kit (Tabela de Materiais).
   1. Dissolver a pelota em 450 μL de Tampão RLT recém-preparado (antes de usar, adicione 100 μL de β-mercaptoetanol por 100 mL de tampão RLT, preparado diariamente). Melhore a dissolução de todas as pelotas misturando todos os tubos à temperatura ambiente em uma misturadora de vórtice de vários tubos por pelo menos 5 min.
5. Purifique a pelota de RNA dissolvida passando pela coluna de mini spin roxo com um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugação em temperatura ambiente por 1 min a 9.000 x g e descarte a coluna de mini spin roxo.
   1. Adicione 0,5 volume de etanol absoluto (~225 μL) ao lysate limpo no tubo de coleta de 2 mL. Misture a solução usando a mesma ponta de plástico, pipetando para cima e para baixo algumas vezes.
6. Coletar o RNA purificado transferindo imediatamente a solução para uma coluna de mini spin rosa com um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugação a 9.000 x g para 15 s para coletar o RNA na membrana de sílica da coluna de giro de min rosa. Descarte o fluxo através e lave o RNA com 350 μL de Buffer RW1 por centrifugação a 9.000 x g para 15 s.
7. Remova o DNA genômico contaminante adicionando 80 μL de DNase diluído 1 (50 μL de estoque de DNase congelado + 350 μL de RDD usando o conjunto DNase) diretamente na membrana e digestão incubando à temperatura ambiente por pelo menos 15 minutos (PAUSE POINT).
   1. Lave o DNase 1 adicionando 350 μL de RW1 e girando a 9.000 x g para 15 s. Repita duas vezes, mas desta vez lave com 500 μL de Buffer RPE. Transfira para um novo tubo de coleta de 2 mL e gire a 9.000 x g por 2 min para secar.
8. Transfira a coluna de spin seca para um novo tubo de coleta sem nuclease de 1,5 mL. Inicie o processo de elução para o extrato de RNA purificado adicionando 50 μL de água sem nuclease (pré-aquecida a 50 °C) e incubando por 3 min a 50 °C de bloco térmico.
   1. Após a incubação, eluie o extrato total de RNA centrifugando a 9.000 x g por 1 min. Coloque imediatamente todas as amostras no gelo.
9. Determine a quantidade e a qualidade do extrato total de RNA executando diluições apropriadas (geralmente 1:10) em Nanodrop e BioAnalyzer usando seus respectivos protocolos de fabricante. Os extratos de RNA devem ter pelo menos um valor de RIN de 8,0 e uma concentração de 50 ng/μL. A figura 1 mostra um resultado típico para extratos de RNA obtidos a partir de folha de cevada e sementes.
   PONTO DE PARADA: Armazene as amostras em -80 °C até o uso.

2. síntese de cDNA seguida de transcrição e rotulagem de cRNA

NOTA: Esta etapa é adequada para o processamento de 24 amostras simultaneamente. Sugere-se que toda a etapa seja realizada continuamente em um dia, mas são identificados pontos de parada e pausa opcionais. Certifique-se de pré-aquecer três blocos de calor do tubo de microfuge a 80 °C, 65 °C e 37 °C antes de começar os degraus abaixo. Estas configurações de temperatura serão alteradas conforme observado nas etapas abaixo. Por exemplo, o bloco de calor de 37 °C será definido para 40 °C após a preparação da Mistura de Espigão (ou se já tiver sido previamente preparada). Prepare o Spike Mix de uma cor, o T7 Promoter Mix e o cDNA master mix usando o Kit de Rotulagem de Expressão genética de amplificação rápida de baixa entrada (ver Tabela de Materiais)com base nas instruções do fabricante. Esta preparação depende da quantidade de extratos de RNA iniciais, que geralmente variam de 10 a 200 ng para RNA total ou 5 ng para RNA PolyA. Utilizamos rotineiramente 50 ng RNA total como material inicial para hibridização de micromatriz² e para o método que será descrito abaixo. Ao preparar uma mistura mestre para 24 amostras, adicione 2 reações extras para explicar as variações pipetting. Use sempre tubos de microfugen sem nuclease e água sem nuclease nesta etapa.

1. Devido ao alto rendimento, normalmente diluir o extrato de RNA 100 vezes para caber dentro da faixa de 50-100 ng. Com base nos resultados de quantificação de RNA no Passo 1.9, faça uma diluição de 1:100 adicionando 1 μL de extrato de RNA purificado a 99 μL de água sem nuclease em um tubo de microfusão de 1,5 mL. Determine a concentração real desta diluição usando um Nanodrop.
   1. Faça uma segunda diluição de cada amostra total de RNA em tubo de microfuge de 1,5 mL para fazer 50 ng de RNA total em um volume final de 1,5 μL. Mantenha todas as amostras no gelo.
2. Prepare o Spike Mix com base nas instruções do fabricante. Esta etapa também é resumida em Püffeld et al. 2019². Use um bloco de calor de 37 °C para isso. Armazene a primeira e segunda diluição do pico de uma cor mistura controles positivos em um freezer de temperatura ultrabaixa (-80 °C) e só passe por oito ciclos repetidos de congelamento/degelo.
   1. Prepare a terceira e quarta diluição fresca diariamente. Descongele e armazene a terceira e quarta diluição da mistura de espigão no gelo antes de usar.
      NOTA: Converta a temperatura do bloco de calor de 37 °C para 40 °C quando a Mistura de Espigão tiver sido preparada (ou se estiver previamente preparada).
3. Prepare o T7 Promoter Mix e armazene no gelo antes de usar. O seguinte é suficiente para 24 amostras:
   20,8 μL de primer promotor T7
   + 26,0 μL de água sem nuclease
   = 46,8 μL do volume total T7 Promoter Mix
4. Adicione 1,8 μL de T7 Promoter Primer Mix (Passo 2.3) em cada tubo de microfuge contendo 1,5 μL de amostra de RNA de 50 ng do Passo 2.1. Misture os componentes corretamente, pipetando várias vezes. Desnaturar a mistura rna modelo-primer incubando em bloco de calor de 65 °C por 10 min. Coloque imediatamente os tubos de microfuge no gelo em preparação para o próximo passo.
5. Enquanto desnatura a mistura de primer de modelo (Passo 2.4), pré-aqueça o buffer de 5x First Strand a 80 °C por pelo menos 4 min. Prepare rapidamente a síntese de CDNA Master Mix do Kit de Rotulagem De Amplificação Rápida de Baixa Entrada (ver Tabela de Materiais)com base nas instruções do fabricante. O seguinte é suficiente para 24 reações:
   52,0 μL de buffer pré-aquecido 5x first strand (passo 2.5)
   + 26,0 μL de 0,1M DTT
   + 13,0 μL de 10 mM dNTP mix
   + 31,2 μL de Mistura de Bloco sinuoso
   = 122,2 μL de mistura mestre de síntese de cDNA de volume total
   1. Descongele cada componente no gelo. Misture cada componente por pipetting suave. Mantenha a Mistura Mestre em temperatura ambiente antes de usar.
      ATENÇÃO: A mistura de bloco sino deve ser imediatamente colocada de volta no congelador -20 °C após o uso.
6. Remova a mistura rna-primer no gelo (Passo 2.4) e centrífuga brevemente à temperatura ambiente para girar todo o conteúdo para o fundo do tubo de microfusão. Dispense 4,7 μL do cDNA Master Mix (Passo 2.5) para cada tubo, misturando cuidadosamente por pipetting para cima e para baixo. O volume total quando todos os componentes são adicionados deve ser de 8,0 μL.
   1. Sintetinoo o cDNA para 2 h em bloco de calor de 40 °C. Durante a incubação de 2 h, mude a temperatura do bloco de calor de 65 °C para 70 °C em preparação para a inativação do calor (Passo 2.7).
      PONTO DE PAUSA OPCIONAL: Armazene as amostras a -80 °C durante a noite. O experimento pode ser continuado no dia seguinte após a inativação do calor (Passo 2.7).
7. Incubar cada tubo em bloco de calor de 70 °C por 15 min para inativar o RNase Block Mix. Transfira os tubos no gelo imediatamente e incuba por pelo menos 5 min.
8. Enquanto as amostras estão no gelo por 5 min (Passo 2.7), prepare rapidamente a Mistura Mestre de Transcrição. Todos os componentes podem ser combinados à temperatura ambiente, mas descongelam componentes no gelo. O seguinte é suficiente para 24 amostras:
   19,5 μL de água sem nuclease
   + 83,2 μL de buffer de transcrição de 5x
   + 15,6 μL de 0,1M DTT
   + 26,0 μL de mistura NTP
   + 5,5 μL de Mistura de Polimerase T7 RNA
   + 6,2 μL de Cyanine 3-CTP (Cy3)
   = 156,0 μL do volume total do Mix Mestre de Transcrição
   ATENÇÃO: A mistura de Polimerase T7 RNA deve ser mantida no congelador -20 °C e colocada de volta imediatamente após o uso. Além disso, cy3 é sensível à luz. Assim, a mistura (Passo 2.9) e a dispensação (Etapa 2.10) devem ser feitas em condições de pouca luminosa. Para isso, geralmente desligamos qualquer luz diretamente acima do banco do laboratório.
9. Como os tubos foram submetidos a aquecimento e resfriamento abrupto (Passo 2.7), gire brevemente o conteúdo de cada amostra usando uma microcentrífuse para coletar todo o líquido na parte inferior de cada tubo de microfusão. Adicione 6 μL de Mistura Mestre de Transcrição (Passo 2.8) encanando suavemente para cima e para baixo. O volume total desta reação deve ser de 16 μL nesta fase. Incubar os tubos a 40 °C por 2 h para gerar o cRNA com a etiqueta Cy3.
   PONTO DE PARADA OPCIONAL: Os tubos podem ser armazenados a -80 °C após a transcrição.
10. Ao gerar o cRNA (Passo 2.9), defina a temperatura do bloco de calor para 55 °C. Adicione pelo menos um tubo de microfuge de água sem nuclease no bloco de calor. Esta água sem nuclease será usada para a elução de cRNA purificado.
11. Após a transcrição e rotulagem de cRNA, purifique o cRNA rotulado usando um Mini Kit RNeasy conforme detalhado no Passo 3.

3. purificação cRNA

1. Purifique o cRNA rotulado usando um Mini Kit RNeasy (ver Tabela de Materiais). Prepare os buffers com base nas instruções do fabricante. Por exemplo, o Buffer RPE é fornecido no kit de forma concentrada. Antes de usar, adicione 4 volumes de etanol absoluto de grau de biologia molecular (96-100%).
2. Adicione 84 μL de água livre de nuclease a cada amostra para ajustar o volume total a 100 μL. Em seguida, adicione 350 μL de Tampão RLT e 250 μL de etanol absoluto a cada tubo. Misture bem por pipetting.
3. Transfira 700 μL de cada mistura para uma mini coluna de giro com um tubo de coleta de 2 mL. Coletar o cRNA rotulado na membrana por centrifugação a 4 °C para 30 s a 7.534 x g. Descarte o líquido de fluxo.
4. Lave cada amostra em 500 μL de Buffer RPE. Centrifugação e descarte o fluxo-through como na etapa anterior. Repita este passo uma vez e passe para o próximo passo.
5. Transfira a mini coluna spin para um novo tubo de coleta. Seque as amostras por centrifugação como no Passo 3.3.
6. Transfira a mini coluna spin para um tubo de microfusão de 1,5 mL sem nuclease que é fornecido com o kit. Elute cada amostra de cRNA rotulada adicionando 30 μL de água sem nuclease (pré-aquecida a 55 °C) diretamente no filtro de membrana. Aumente a elusão incubando em bloco de calor de 55 °C para 60 s.
7. Coletar o cRNA rotulado por centrifugação à temperatura ambiente para 30 s a 7.535 x g. Descarte a coluna de giro e feche cada tubo de microfuge. Coloque imediatamente cada tubo no gelo.
   PONTO DE PARADA OPCIONAL: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C após a elusão.
8. Quantifique o cRNA com Nanodrop usando o recurso microarray. Defina a amostra para RNA-40. Obter os seguintes valores e registro em uma planilha: concentração de ciana 3 (pmol/μL), razão de absorvância de RNA (260 nm/280 nm) e concentração de cRNA (ng/μL).
   PONTO DE PARADA: Armazene imediatamente as amostras de cRNA a -80 °C após a leitura.
9. Calcule o rendimento do cRNA e a atividade específica conforme detalhado em Püffeld et al. 2019².

4. Hibridização e digitalização de microarrays

NOTA: Esta etapa leva apenas 3-4 h e, portanto, a hibridização de 24 amostras pode ser iniciada após o almoço. Um operador pode executar confortavelmente até 4 slides (32 amostras). A manhã do dia seguinte é alocada para lavagem e digitalização de slides de micromatriz. Corridas adicionais podem ser realizadas na tarde do segundo dia. Esta etapa é repetida até que todas as amostras sejam hibridizadas e escaneadas. É altamente recomendável usar luvas de látex sem cor e sem pó para manusear e processar as lâminas para garantir que as amostras não estejam contaminadas com pigmentos coloridos que possam interferir nas análises de micromatriz. Além dos microarrays disponíveis comercialmente, as seguintes matrizes personalizadas são projetadas pelo nosso grupo e disponíveis para encomenda da Agilent: Código de Ordem 028827 para Cevada (Hordeumvulgare), 054269 para Rice (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 para Rice (Oryzasativa subs. Indica) e 048923 para Trigo(Triticumaestivum).

1. Realize a hibridização do microarray usando o Kit de Hibridização da Expressão Genética (ver Tabela de Materiais). Prepare o agente de bloqueio 10x de acordo com a especificação do fabricante². Alíquota o agente de bloqueio de 10x em porções de 200 μL e armazene a -20 °C até o uso. Cada alíquota é suficiente para até 40 hibridizações e é estável até 2 meses.
2. No dia alocado para hibridização de micromatriz, descongele uma alíquota de 200 μL de 10x agente de bloqueio no gelo. Além disso, pré-aqueça o forno de hibridização a 65 °C e pré-aqueça um bloco de calor a 60 °C para uso durante a fragmentação do cRNA.
3. Preparar a mistura de fragmentação para cada amostra conforme descrito pelo fabricante². Em nosso laboratório, usamos rotineiramente 600 ng de cRNA cilíficamente amplificado com rótulo Cy3 para hibridização em um microarray de 8 pacotes. Neste caso, a lista abaixo resume os componentes da Mistura de Fragmentação por amostra:
   600 ng de cRNA litoxiado amplificado, cianina 3-labeled
   + 5 μL de 10x agente de bloqueio
   Ajuste o volume para 24 μL com água sem nuclease
   + 1 μL de tampão de fragmentação de 25x
   = 25 μL da mistura de fragmentação de volume total
   1. Misture as amostras suavemente usando um misturador de vórtice. Gire todas as amostras brevemente usando uma microcentrifuge.
4. Incubar todas as amostras no bloco de calor de 60 °C por exatamente 30 min. Resfrie imediatamente cada tubo no gelo por um min e siga rapidamente para o próximo passo.
5. Para parar totalmente a reação de fragmentação, adicione 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM a cada tubo. Misture suavemente, pipetando para cima e para baixo, tomando muito cuidado para não introduzir bolhas durante a mistura. Usamos rotineiramente 25 μL de Buffer de Hibridização para parar a reação de fragmentação para o formato de microarray de 8 pacotes.
6. Centrifugar todos os tubos por 1 min a 15.750 x g em temperatura ambiente ambiente. Coloque rapidamente todos os tubos no gelo e carregue cada amostra o mais rápido possível.
7. Antes de sair do laboratório para a incubação de 17 horas durante a noite, prepare o conjunto de hibridização² conforme detalhado no vídeo.
   1. PASSO CRÍTICO: Transfira cada mistura de hibridização e dispense lentamente no centro de cada junta bem, observando muito cuidado para não introduzir bolhas durante a distribuição. Usamos rotineiramente 44 μL de mistura de hibridização para o formato de microarray de 8 pacotes. Coloque também 44 μL de 1x Buffer de Hibridização em quaisquer poços não utilizados.
   2. Coloque imediatamente o slide de micromatriz com orientação correta na parte superior do slide da junta. Isso precisa ser feito com muito cuidado para não derramar nenhum líquido. Feche bem o conjunto de hibridização e gire-o para verificar se não foram introduzidas bolhas de ar permanentes. Todas as bolhas devem estar se movendo dentro do deslizamento da junta.
8. Coloque o conjunto da câmara de hibridização no rotador do forno de hibridização. Se usar o Buffer de Hibridização GEx 2x, defina a velocidade de rotação para 10 rpm e hibridize a 65 °C por exatamente 17 horas.
9. Lave micromatrizes hibridizadas usando o Kit tampão de lavagem de expressão genética (ver Tabela de Materiais). Prepare os buffers de lavagem de expressão genética 1 e 2 com base nas instruções do fabricante². Adicionar 2 mL de 10% Triton X-102 a ambos os buffers (puramente opcionais, mas altamente recomendados para reduzir a incidência de artefatos de lavagem micromatriz)².
10. Prepare três conjuntos de câmaras de lavagem conforme detalhado na publicação anterior². Os detalhes de cada câmara de lavagem são tabulados abaixo(Tabela 1).
11. Alíquota 500 mL de Wash Buffer 1 em uma garrafa de reagente de 1 L e deixe à temperatura ambiente ambiente. Prepare uma garrafa de reagente extra de 1 L e etiqueta com "Wash Buffer 1 Reuse" para salvar o tampão de lavagem da primeira câmara. Além disso, alíquota 500 mL de Wash Buffer 2 em uma garrafa de reagente e incubar em um banho de água de 37 °C durante a noite.
    NOTA: Não saia do laboratório sem preparar as etapas 4.9 a 4.11. Eles são necessários para as etapas de lavagem no dia seguinte.
12. No dia seguinte, prepare os tampões de lavagem conforme detalhado na Tabela 2. Encha cada prato para três quartos de seu tampão correspondente. Cada tampão de lavagem é bom para até 4-5 slides.
13. Após exatamente 17 h de hibridização, obtenha uma câmara de hibridização e desmonte no banco do laboratório forrado com papel sem fiapos, conforme detalhado na publicação anterior².
    1. PASSO CRÍTICO: Transfira o sanduíche de micromatriz para o Prato 1. Certifique-se de que o código de barras do microarray está voltado para cima em uma posição inclinada e evite submergir todo o slide no buffer. Manuseie cada deslizamento de micromatriz de suas extremidades e evite tocar no lado ativo do slide.
    2. Separe as duas lâminas de vidro usando um fórceps². Deixe a junta deslizar para baixo do Prato 1, ao mesmo tempo em que garante que o slide de microarray seja mantido firmemente para o próximo passo.
14. PASSO CRÍTICO: Levante lentamente os slides do microarray para os lados e transfira imediatamente para o rack de microarray na Prato 2, conforme detalhado na publicação anterior². É fundamental que os slides de micromatriz estejam minimamente expostos ao ar.
    1. Repita as etapas 4.13 e 4.14 até que os oito slides estejam no rack. Distribua os slides de micromatriz uniformemente ao longo do rack. Esta etapa pode ser feita por um operador sem assistência para até 4 slides. Fixar o suporte do rack e transferir toda a configuração do Prato 2 para o primeiro agitador magnético. Mexa delicadamente por exatamente 1 min.
15. Enquanto mexe por 1 min (Passo 4.14), transfira o Prato 3 da mini incubadora de 37 °C e coloque em cima do segundo agitador magnético. Coloque suavemente o Tampão de Lavagem 2 (a partir do banho de água de 37 °C) no Prato 3. Evite a formação de bolhas enquanto derrama.
    1. Depois de 1 min de agitação é feito (Passo 4.14), levante suavemente e lentamente o rack de slides do Prato 2 e transfira para o Prato 3. Retire o suporte do rack e mexa por exatamente 1 min.
16. Levante lentamente e suavemente o rack de deslizamento do Prato 3. Certifique-se de evitar a formação de gotículas tampão². Seque as laterais de cada slide tocando suavemente em papel sem fiapos. Coloque cada slide seco em uma caixa de slides e repita o passo 4.16 até que todos os slides de microarray estejam na caixa de slides. Seque por aproximadamente 15 min.
    PONTO DE PARADA OPCIONAL
17. Coloque cada slide de microarray em um suporte de slides, garantindo que o código de barras esteja voltado para cima.
    NOTA: Os níveis de ozônio dentro da sala de micromatriz devem ser de 50 ppb (100 μg/m³) ou menos. Isso é puramente opcional, mas é altamente recomendado: use uma tampa de lâmina de barreira de ozônio para evitar a degradação induzida pelo ozônio de corantes de cianina.
18. Coloque os suportes de slides montados no carrossel de varredura. Carregue as amostras em seqüência, com base no número de código de barras. Escaneie os slides imediatamente usando um scanner de microarray (ver Tabela de Materiais),conforme detalhado na publicação anterior².
19. Após a execução, submeta os dados à extração de recursos e validação de QC, conforme detalhado na publicação anterior².

Resultados

Este método é otimizado para extrair amostras de sementes de cereais contendo quantidades significativas de amido ou açúcares contaminantes. Ele foi projetado para extrair RNA total de 24 amostras de sementes por dia. Deve ser conduzido continuamente em um dia, mas pontos opcionais de parada e pausa são identificados ao longo do protocolo. Alternativamente, o leitor pode usar seus kits de extração de RNA preferidos ou método de extração química manual. No entanto, com base em nossa experiência anterior, os kits de extração de RNA vegetal disponíveis comercialmente não são apropriados para sementes devido a quantidades significativas de amido, proteínas, açúcar e/ou contaminação lipídica. No método descrito, uma extração química de RNA bruto é seguida pela purificação da coluna usando um kit de extração de RNA comercial. Isso normalmente fornece RNA com maior qualidade e rendimento. A Figura 1 mostra o resultado de uma execução do BioAnalyzer para testar a qualidade da extração de RNA usando o método descrito aqui. Os resultados são apresentados para folha de cevada (Amostras 1 e 2 representando amostras de baixo teor de amido) e sementes de cevada (Amostras 3 e 4 representando amostras de alto teor de amido). O valor de integridade do RNA (RIN) para todas as amostras é de 10.

A Figura 1 mostra um gel representativo do extrato de RNA purificado, onde a qualidade foi testada utilizando um Bioanalisador. As amostras 1 e 2 são resultados típicos para amostras de baixo teor de amido, como folhas de cevada, onde bandas adicionais de rRNA de cloroplastos são evidentes. As amostras 3 e 4 são resultados representativos para amostras de alto teor de amido, como sementes de cevada, mostrando 18S e 28S rRNA. Observe que nenhum valor automatizado de RIN pode ser calculado para tecidos vegetais verdes, como amostras de folhas, devido ao rRNA de cloroplasto. No entanto, a integridade e a alta qualidade podem ser verificadas visualmente pela ausência de quaisquer produtos de degradação, que normalmente aparecem como baixa mancha molecular. O valor de RIN para amostras de sementes de alto amido, como sementes de cevada, é tipicamente 10 usando o protocolo descrito neste artigo.

Além disso, também apresentamos aqui dados representativos de um experimento de curso de tempo de duas linhas de cevada de elite (Sofiara e Victoriana) utilizadas para análise da qualidade do malte¹⁹. Durante o processo de malte, o amido é convertido em açúcar. Portanto, as amostras representam tecidos com proporções variadas de teor escoscodeiro e açúcar. Como o processo de malte industrial é semelhante ao processo de germinação, foram analisados os transcritores de duas linhas de cevada, diferindo em sua qualidade de malte. As RNAs foram extraídas de sementes germinantes às 2, 24, 48, 72, 120, 144 e 196 h após a imbibição em triplicados biológicos. A preparação e hibridização do RNA para o chip microarray de cevada personalizado foram realizadas conforme descrito acima. A Figura 2 indica a grade normalizada lida a partir da hibridização do microarray dada no relatório de controle de qualidade (QC)(Figura 3)e na trama de histograma para sinais detectados. A grade dá o exemplo de sinais derivados de cada canto do chip, incluindo o fundo e pontos de leitura de spike-in usados para calibração. O histograma indica o desvio de dots detectáveis com respectivas intensidades de sinal. Uma hibridização bem sucedida dá uma ampla curva em forma de gaussiano com apenas pequenos outliers como mostrado na figura. Hibridizações fracassadas podem resultar em uma mudança forte para um lado ("monstros verdes").

Por último, um resultado representativo dos valores aceitáveis é mostrado na coluna 4 da Figura 3. Para indicar a confiabilidade dos experimentos realizados, os resultados são ainda mais avaliados usando o software GeneSpring. Os dados coletados são apresentados como análise principal de componentes (PCA). O PCA integra os valores dos dosts selecionados (genes) como vetor. O número de pontoes avaliados que são usados pode variar de várias centenas para todo o chip e depende do software utilizado. Cada chip (amostra) resulta em um valor (vetor) resultante das intensidades de sinal integradas para os pontos analisados. Portanto, a posição relativa no gráfico (PCA) indica a semelhança das amostras entre si. Quanto mais perto as amostras são, mais semelhantes elas são. As réplicas técnicas devem estar mais próximas do que as biológicas, e as réplicas biológicas de uma amostra devem agrupar-se mais do que amostras de diferentes pontos de tempo, tecidos ou condições.

Figura 1: Resumo de execução de arquivo de eletroforese obtido após verificar a qualidade do RNA com bioanalisador. As amostras 1 e 2 são tecido de folha de cevada, conforme indicado por bandas ribossômicas adicionais de cloroplastos. As amostras 3 e 4 são tecido de cevada com bandas de rRNA de 18S e 28S mostradas. Um fator RIN nem sempre é calculado para tecidos verdes como a folha, mas de acordo com o gel, a qualidade do RNA é muito boa. O valor de RIN para as amostras 3 e 4 é 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Relatório QC da hibridização bem sucedida do microarray de cevada. A + indica sinais detectados na grade de todos os cantos do chip. O histograma mostra o número de sinais categorizados de acordo com a intensidade do sinal (fluorescência) como logaritmo após subtração de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resumo do controle de qualidade (QC) após hibridização e digitalização. Os valores para o slide hibridizado são dados na coluna 2 (valor) e a faixa de valores aceitáveis é mostrada na coluna 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Assembleia da Câmara dos Deputados	Conteúdo e Etiqueta	Propósito
Prato 1	Vazio, deixe no banco do laboratório até o dia seguinte.	Preencha com o Buffer de Lavagem 1 no dia seguinte, usado para desmontar os slides de microarray
Prato 2	Adicione um rack de slides de micromatriz e uma pequena barra de agitação magnética; rótulo com "Wash Buffer 1", deixe no banco de laboratório até o dia seguinte	Usado para lavar os slides de microarray com Wash Buffer 1 no dia seguinte
Prato 3	Adicione uma pequena barra de agitação magnética, etiqueta com "Wash Buffer 2" e coloque em uma mini incubadora de 37 °C.	Usado para lavar os slides de micromatriz com Wash Buffer 2 no dia seguinte dentro da mini incubadora de 37 °C

Tabela 1: Preparação das assembléias da câmara de lavagem.

Passos	Prato	Tampão de lavagem	Temperatura	Tempo
Desmontagem	1	1	Ambiente	O mais rápido possível
(Etapa 4.13)
Primeira lavagem	2	1	Ambiente	1 min.
(Etapa 4.14)
Segunda lavagem	3	2	37 °C	1 min.
(Passo 4.15)

Tabela 2: Temperatura de incubação e tempo para as montagens da câmara de lavagem.

Discussão

O método descrito fornece resultados altamente reprodutíveis para extratos de RNA de alto rendimento e de alta qualidade(Figura 1). Com base em nossa experiência, recomendamos três réplicas biológicas para um genótipo, estágio ou condição para análise. Para ser capaz de detectar diferenças estatisticamente significativas, a abundância geral de mRNA deve ser considerada. Observe, no entanto, que uma quantidade inicial de amostras de tecido de 200 mg é necessária em triplicados para a etapa de extração de RNA. Portanto, para experimentos que tenham uma quantidade limitada de amostras, como materiais vegetais geneticamente modificados, este método pode não ser apropriado.

Durante a hibridização do microarray, as seguintes etapas são mais críticas: (1) carregar as amostras para o slide da junta (Passo 4.7) e (2) lavar as matrizes após a hibridização (Passos 4.13 e 4.14). O carregamento da amostra precisa ser feito com muito cuidado para evitar a formação de bolhas e derramamento de líquido. É necessário ter cuidado ao colocar o slide de micromatriz no slide da junta contendo as amostras carregadas: o lado do DNA (com sondas manchadas) deve ser voltado para baixo para permitir a hibridização. Para lavar os microarrays, o segundo passo de lavagem é especialmente crítico: aqui, a remoção dos slides do tampão de lavagem 2 precisa ser realizada muito lentamente (10 s) para evitar artefatos tampão nos slides, o que pode interferir na aquisição e análise de dados.

Para obter resultados do experimento de hibridização que são elegíveis para a análise de bioinformática a jusante, deve-se seguir alguns critérios importantes. O relatório QC, que é gerado após o desempenho do protocolo acima, dá uma boa ideia do que deve ser melhorado e quais dados estão em condições utilizáveis (Figura 3). As primeiras informações recebidas são a grade visualizada (Figura 2). Aqui, pode-se ver diretamente se todas as áreas para a leitura de fluorescência estão devidamente alinhadas. Se houver uma mudança visualmente detectável, isso influenciará todos os outros valores (Fundo, intensidade do sinal, etc.) e a leitura deste chip não pode ser usada. Na visão geral (Distribuição Espacial de todos os Outliers), pode-se detectar facilmente qualquer contaminação (por exemplo, poeira ou cabelo), o que afetou o resultado. A sujeira pode ser removida soprando suavemente e reescando o chip. O histograma da trama de sinal, como mencionado acima, deve resultar em uma curva ampla em forma de gauss, com apenas pequenos outliers(Figura 2). Dependendo do tecido analisado (Figura 1),esta curva pode parecer diferente e pode parecer ter dois picos, ou um pico predominante com um ombro. Isso não influenciará a qualidade dos dados. Apenas um pico deslocado forte, ou sinais altos nas bordas indicam problemas, como "monstros verdes" (intensidades de fluorescência muito altas), que não podem ser removidos por lavagem e devem ser reportados ao fabricante do chip. Além disso, o "gráfico de distribuição espacial para sinais medianos" deve variar em torno de um valor comum. Isso deve estar na faixa entre 40 e 100, dependendo da leitura geral da intensidade do chip analisado. Outro importante controle de qualidade é a avaliação do pico de dados: O gráfico de logpara o pico de sinais deve resultar em uma linha linear e regular. Finalmente, a tabela de "métricas de avaliação" dá uma boa e confiável visão dos resultados recebidos. Aqui o fabricante fornece uma gama de valores que podem ser classificados como Excelente, Bom e Avaliar (Figura 3). De acordo com nossa experiência, alguns dos valores nem sempre podem ser aplicados para todos os chips. Para chips personalizados de arroz, o "valor não Control" estava frequentemente fora de alcance, mas não afeta significativamente o processamento adicional de dados. Além disso, o intervalo para "NegControl" pode ser estendido, com base no tecido, organismo e saída geral do Chip para <80. A faixa de avaliação para o valor E1 med CV pode ser estendida para <9, em vez de <8 de acordo com nossa experiência. Após isso, é possível uma avaliação adequada de todos os dados de leitura de chip. Em geral, deve-se sempre ter em mente que as réplicas biológicas independentes sempre dão o resultado mais confiável.

A vantagem dessa técnica em relação a outros métodos reside no fato de que ela representa um método econômico e de alto rendimento para o perfil transcricional. Além disso, o pipeline de análise de dados a jusante é mais fácil e mais estabelecido. Apesar das vantagens, existem certas limitações dessa técnica, como o número de genes que podem ser analisados. O microarray só pode facilitar a análise de genes previamente detectados na matriz. Portanto, essa técnica só é aplicável a espécies vegetais com genomas sequenciados e genes totalmente anotados. Prevemos que a transcriptomia baseada em microarray continuará sendo muito útil e relevante não apenas para o perfil de expressão genética, mas também para outros pipelines de bioinformática a jusante, como análises de rede regulatória genética e estudo de associação em toda a transcrição.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
-mercaptoetanol	Roth	4227.3	Adicionar 300 ul a 20 mL de tampão de extração de RNA imediatamente antes de usar
Bioanalisador 2100	Agilent Technologies		Para determinar a qualidade e a quantidade de extrato de RNA Máquina de
gelo picado	Várias marcas		Para manter as amostras no gelo durante o processamento da amostra
Frasco Dewar	Várias marcas		Usado como recipiente de nitrogênio líquido
Etanol, absoluto	de Expressão Gênica Roth	9065.1
	Agilent Technologies	5188-5242	Kit componentes: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit	Agilent Technologies	5188-5325	Componentes do kit: Tampão de lavagem de expressão gênica 1 Tampão de lavagem de expressão gênica 2 Triton X-102
Bloco de calor	Várias marcas		Recomenda-se ter pelo menos um bloco de calor para tubos de 1,5 ml e outro para tubos de 2,0 ml
Forno de hibridização	Agilent	G2545A	Forno de aço inoxidável projetado para hibridização de microarray Da Sheldon Manufacturing, usado para hibridizar a amostra em microarray durante a noite.
Kit de corrediça de junta de hibridização	Agilent	G2534-60014
iQAir air cleaner			Para garantir que o experimento seja conduzido em área de baixo ozônio
Isopropanol	Roth	9866.5
Papel sem fiapos, Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	KC34155
Kit de Rotulagem de Amplificador Rápido de Baixa Entrada	Agilent Technologies	5190-2305	Componentes do kit: T7 Primer 5x Tampão de primeira fita 0,1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Espátula de metal de >
, pequeno			Certifique-se de que a pequena espátula de metal possa caber nos tubos de microcentrífugas para garantir a fácil coleta de amostras.
Scanner de microarray	Agilent Technologies		Agilent SureScan ou Agilent C scanner de microarray são
recomendados Tubos de microcentrífuga, sem nuclease	Várias marcas		2,0 mL e 1,5 mL de volume
Microcentrífuga	Eppendorf	5810 R	Recomenda-se ter pelo menos uma microcentrífuga de temperatura ambiente e fria com rotores que podem conter 24 tubos de microcentrífuga
de 1,5 ml e 2,0 mlMini incubadora	Labnet	I5110-230V	Qualquer incubadora pequena serve.
Almofariz e pilão			Qualquer pequeno almofariz e pilão de cerâmica ou mármore que possa suportar a moagem criogênica usando nitrogênio líquido.
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Nanodrop 1000	Peqlab / Thermofisher
Água sem nuclease	Biozym	351900302
de RNA de uma cor Agilent		5188-5282	Kit: Kit de tampa deslizante de barreira de ozônio de tampão de diluição de uma cor Spike-Mix
	Agilent	G2505-60550	opcional, mas altamente recomendado
, 0,2 mL, livre de RNase	Stratagene	Z376426
Fenol:clorofórmio:mistura de isoamila (25:24:1)	Roth	A156.2
Pontas de pipeta, sem nuclease, pontas de filtro	Várias marcas		Para acomodar volumes de 2, 20, 20, 100, 200 e 1000 ul
Conjunto de pipetas	Várias marcas		Para volumes de 2, 20, 20, 100, 200 e 1000 ul
Tampão de extração de RNA	10 mM Tri-HCl pH 8,0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1,5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoetanol		Usamos rotineiramente produtos químicos Roth ou Sigma; Adicionar conjunto de DNase livre de RNase diário fresco de β-mercaptoetanol
	Qiagen	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Componentes do kit: RNeasy mini coluna de rotação (rosa) Tubos de coleta de 1,5 ml Tubos de coleta de 2 ml Tampão RLT Tampão RW Tampão RPE Água livre de nuclease
RNeasy Plant Mini Kit	Componentes do kit Qiagen	74904	: < / strong> Mini coluna de rotação RNeasy (rosa) < br / > Coluna de rotação QIAshredder (roxo) < br / > Tubos de coleta de 1,5 ml Tubos de coleta de 2 ml Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Suportes de lâmina de água sem nuclease
para scanner de microarray de DNA	Agilent	G2505-60525
Prato de coloração deslizante com rack removível	DWK Life Sciences 900200	Fisher Scientific 08-812	Recomendamos DWK Life Sciences Wheaton™ Prato de Coloração de Vidro 20-Slide com Rack Removível (Completo com prato, tampa e suporte de slides de vidro)
Cloreto de sódio	Roth	P029.1
Freezer de temperatura ultrabaixa	Várias marcas		Capaz de armazenar amostras a -80 ° C
Misturador de vórtice	Várias marcas		Pelo menos um para misturador de vórtice de tubo único e outro para que possa misturar vários tubos de vórtice