Obtenção de dados de transcriptome de alta qualidade de sementes de cereal por um método modificado para criação de perfil de expressão genética

Este método de hibridização de microarray é útil para comparar um grande número de amostras de um organismo com um genoma conhecido. Em comparação com uma abordagem de sequenciamento de alto rendimento, a quantidade de dados gerados por este método é muito mais fácil de manusear e, além disso, pode ser analisada de forma mais econômica. Demonstrando o procedimento será a Dra.

Antes de realizar a hibridização da microarray usando o kit de hibridização de expressão genética, prepare o agente de bloqueio 10X de acordo com as especificações do fabricante e aliquot o agente de bloqueio resultante em volumes de 200 microliter. Em seguida, armazene o agente de bloqueio a menos 20 graus Celsius até usar. No dia da hibridização da microarray, descongele uma alíquota de 200 microliter do agente de bloqueio 10X no gelo e pré-aqueça o forno de hibridização a 65 graus Celsius e um bloco de calor a 60 graus Celsius.

Prepare a mistura de fragmentação para cada amostra descrita pelo fabricante e misture as amostras suavemente em um vórtice. Após o vórtice, gire brevemente as amostras em uma microcentrifuagem antes de incubar por exatamente 30 minutos no bloco de calor de 60 graus Celsius. No final da incubação, esfrie imediatamente cada tubo no gelo por um minuto antes de parar a fragmentação com 25 microliters de tampão de hibridização de expressão genética 2X, altas revoluções por minuto por tubo.

Misture com tubos suaves, tomando muito cuidado para não introduzir bolhas, e centrifugar os tubos em temperatura ambiente. No final do giro coloque imediatamente todos os tubos no gelo e carregue cada amostra no slide de microarray o mais rápido possível. Em seguida, distribua lentamente 44 microliters de cada mistura de hibridização no centro de cada junta bem, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas, e adicione 44 microliters de tampão de hibridização em quaisquer poços nãousados.

Coloque imediatamente o slide de microarray na orientação correta em cima do escorregador da junta, tomando cuidado para não derramar nenhum líquido, e feche firmemente o conjunto de hibridização. Gire a montagem para confirmar a falta de bolhas de ar estacionárias e coloque o conjunto da câmara de hibridização no rotador do forno de hibridização. Defina a velocidade de rotação para 10 revoluções por minuto, em seguida, inicie a hibridização a 65 graus Celsius por exatamente 17 horas.

Enquanto as amostras estiverem hibridizando, prepare três conjuntos de pratos de lavagem nos buffers de lavagem apropriados, conforme descrito nas tabelas. Após exatamente 17 horas de hibridização, desmonte uma câmara de hibridização em um banco de laboratório forrado com papel sem fiapos e transfira um sanduíche de microarray para um prato contendo tampão de lavagem um com o código de barras de microarray voltado para cima em uma posição inclinada sem submergir todo o slide no buffer. Usando fórceps, separe os dois slides de vidro e deixe a junta deslizar suavemente para o fundo do prato, mantendo um aperto firme no slide de microarray.

Levante lentamente o deslizamento de microarray para o lado para transferência imediata para o rack de microarray no prato dois com uma exposição mínima ao ar. Quando todos os oito slides tiverem sido colocados uniformemente ao longo do rack, conecte o suporte do rack e transfira toda a configuração do prato dois para o agitador magnético. Mexa a configuração suavemente por exatamente um minuto.

Enquanto as amostras estão sendo agitadas, transfira o prato três da incubadora Celsius de 37 graus para um segundo agitador magnético. Em seguida, adicione suavemente 37 graus Celsius tampão de lavagem dois para prato três sem formar bolhas. No final da incubação de agitação, transfira suavemente e lentamente o rack de slides para a louxa três e remova o suporte do rack.

Depois de mexer por exatamente um minuto, retire lentamente e suavemente o rack de slides do prato e use papel sem fiapos para secar cuidadosamente ambos os lados de cada slide, colocando cada slide em uma caixa de slides à medida que está seco. Depois de permitir que os slides sequem por 15 minutos, transfira cada deslizamento de microarray para um porta-slides com o código de barras voltado para cima e carregue os suportes de slides montados em um carrossel de varredura e sequencie de acordo com o número do código de barras. Em seguida, escaneie imediatamente os slides.

Nesta figura, um resultado representativo de uma corrida para testar a qualidade da extração de RNA é mostrado. Em análises típicas de amostras de baixo teor de amido, como folhas de cevada, bandas adicionais de RNA ribossômicos de cloroplastos são evidentes. Amostras de alto teor de amido, como sementes de cevada, exibem RNA ribossômico 18 e 28S.

Observe que nenhum valor automático do número de integridade do RNA pode ser calculado para tecidos vegetais verdes, como amostras de folhas, devido ao RNA ribossômico de cloroplasto. Nesta análise representativa, foi realizada uma preparação de RNA e hibridização para um chip personalizado de microarray de cevada. A grade mostra um exemplo de sinais derivados de cada canto do chip, incluindo fundo e pico nos pontos de leitura usados para calibração.

O histograma indica o desvio de pontos detectáveis com as respectivas intensidades de sinal. Como observado, uma hibridização bem sucedida dá uma ampla curva em forma de gaussiana com apenas pequenos outliers. Mostrado aqui é o relatório de controle de qualidade para sinais detectados.

Os valores para o slide hibridizado são dados na coluna dois e a faixa de valores aceitáveis é mostrada na coluna quatro. Este método pode ser usado para abordar qualquer configuração experimental para qualquer organismo onde informações substanciais sobre o genoma estão disponíveis. O uso dessa técnica em nosso laboratório nos permitiu comparar e analisar as alterações transcriômicas no arroz e cevada que ocorrem após a indução do estresse de crescimento.