Aqui são apresentados métodos detalhados para a dissecação e mancha de gotícula lipídica de estenocitos em larvas de Drosophila usando BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotícula lipídica.
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Artigo de método
Cotocação e gota lipídica manchando de enocitos nas larvas de Drosophila
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os lipídios são essenciais para o desenvolvimento animal e a homeostase fisiológica. A desregulação do metabolismo lipídico resulta em vários defeitos e doenças do desenvolvimento, como obesidade e fígado gorduroso. Normalmente, os lipídios são armazenados em gotículas lipídicas, que são as organelas de armazenamento lipídico multifuncionais nas células. As gotículas lipídicas variam em tamanho e número em diferentes tecidos e diferentes condições. Tem sido relatado que as gotículas lipídicas são rigidamente controladas através da regulação de sua biogênese e degradação. Em Drosophila melanogaster,o enocito é um tecido importante para o metabolismo lipídico e foi recentemente identificado como um análogo de fígado humano sobre a mobilização lipídica em resposta ao estresse. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação do metabolismo das gotículas lipídicas nos enocitos permanecem evasivos. Para resolver este problema, é de extrema importância desenvolver um método confiável e sensível para visualizar diretamente as mudanças dinâmicas de gotículas lipídicas nos enocitos durante o desenvolvimento e em condições estressantes. Aproveitando o LIPophilic BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotídea lipídica, descrito aqui é um protocolo detalhado para a dissecação e a mancha lipídica subseqüente na mancha de enocícitos das larvas de Drosophila em resposta à fome. Isso permite a análise qualitativa da dinâmica de gotículas lipídicas várias condições pela microscopia confocal. Além disso, este método rápido e altamente reproduzível também pode ser usado em telas genéticas para identificar novos fatores genéticos envolvendo o metabolismo das gotículas lipídicas em enocitos e outros tecidos.
Introdução
Os lipídios são essenciais para a sobrevivência celular. Além de seu papel tradicional como componentes integrais dos sistemas de membrana celular, os lipídios também desempenham funções cruciais no fornecimento de energia e sinalização transduction ao longo dos ciclos de vida de animais individuais1. Assim, o metabolismo lipídico deve estar em conformidade com regulamentos rigorosos para manter a hemostase fisiológica nas células. Sabe-se que a desregulação do metabolismo lipídico resulta em várias doenças, como diabetes e fígado gorduroso. Apesar da grande importância do metabolismo lipídico na saúde animal, os mecanismos subjacentes à regula....
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Protocolo
1. Postura de ovo
- Prepare o alimento padrão da farinha de milho para a postura do ovo.
Nota: Para a receita e procedimento de cozimento para o alimento padrão da farinha de milho usado aqui, veja os detalhes previamente publicados15. - Prepare pasta de fermento fresco, adicionando 6 mL de água destilada para 4 g de fermento seco ativo em um tubo centrífuga de 50 mL. Use uma espátula para misturar e fazer uma pasta.
- Faça garrafas de postura de ovos, enchendo o alimento da farinha de milho nas garrafas e espalhe aproximadamente 1 g de pasta de fermento na superfície da comida de farinha de milho com....
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Resultados
A execução bem-sucedida deste procedimento deve resultar em gotículas lipídicas claras que revelam o número e o tamanho das gotículas lipídicas nos enocitos. A Figura 1A,A',A'' mostra que existem poucas gotículas lipídicas detectáveis (pontos verdes) nos enocitos das larvas normais de alimentação durante diferentes estágios de desenvolvimento. Figura 1B,B',B'' mostra aumento das gotículas lipídic.......
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Discussão
Entre os descritos acima, há vários passos críticos neste protocolo, com o período de tempo de postura de ovos sendo um desses. Como um tecido de mobilização lipídica, o enocito é altamente sensível ao estado nutricional6,8. Períodos prolongados de tempo de postura de ovos podem resultar em larvas de canto e aumento da concorrência alimentar, levando a resultados imprecisos. O período de tempo de postura de ovos de 1 h usado neste protocolo permite que as larvas .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a serem divulgados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 e 31601112), do Projeto 111 (D18010), do Projeto local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de centrífuga de 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Placa de Petri | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Ágar | Para alimentos para moscas | ||
| Folha de alumínio | N/A | N/A | Proteger o smaple da luz |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Corante de coloração de gotículas lipídicas |
| Microscópio | confocalLeica | Leica TSC SP5 | Imagem confocal |
| Xarope | de milho Para comida para moscas | ||
| Fubá | Para comida para moscas | ||
| Lamínula | Citoglas | 10212424C | 20 mm, 0,13-0,17 de espessura |
| Pino de dissecação | N/A | N/A | |
| Placa de dissecação | N/A | N/A | |
| Papel de filtro | N/A | N/A | Diâmetro: 11 cm |
| Tampão de fixação | N/A | N/A | 4% Paraformaldeído (PFA) em 1x PBS |
| Fórceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubadora | Jiangnan | SPX-380 | Para cultura de moscas |
| Tubo de microcentrífuga | Axygen | MCT-150-C | 1,5 mL |
| Lâmina de microscopia | Citoglas | 10127105P-G | |
| Meio de montagem | VECTASHIELDAntifade Meio de montagem | H-1000 | Meio de montagem antidesbotamento |
| Esmalte | PanEra | AAPR419 | Selar a lamínula Pincel |
| N/A | N/A | ||
| PBS | N/ | A N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas primavera tesoura |
| Farinha | para comida de mosca | ||
| Espátula | N / A | N / A | |
| Comida de fubá padrão | N / A | N / A | Codificação para receita de comida de fubá padrão |
| Bloomington Estéreo microscópio | Leica | Leica S6E | Para dissecção de tecidos |
| Limpe o papel | N/A | N/A | |
| Levedura | Para comida para moscas | ||
| yw | Mantido como estoque de laboratório | N/A | Drosophila |
Referências
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-5....
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Reimpressões e permissões
