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Artigo de método

Cotocação e gota lipídica manchando de enocitos nas larvas de Drosophila

11.7K vistas

DOI:

10.3791/60606

28 de dezembro de 2019

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui são apresentados métodos detalhados para a dissecação e mancha de gotícula lipídica de estenocitos em larvas de Drosophila usando BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotícula lipídica.

Resumo

Os lipídios são essenciais para o desenvolvimento animal e a homeostase fisiológica. A desregulação do metabolismo lipídico resulta em vários defeitos e doenças do desenvolvimento, como obesidade e fígado gorduroso. Normalmente, os lipídios são armazenados em gotículas lipídicas, que são as organelas de armazenamento lipídico multifuncionais nas células. As gotículas lipídicas variam em tamanho e número em diferentes tecidos e diferentes condições. Tem sido relatado que as gotículas lipídicas são rigidamente controladas através da regulação de sua biogênese e degradação. Em Drosophila melanogaster,o enocito é um tecido importante para o metabolismo lipídico e foi recentemente identificado como um análogo de fígado humano sobre a mobilização lipídica em resposta ao estresse. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação do metabolismo das gotículas lipídicas nos enocitos permanecem evasivos. Para resolver este problema, é de extrema importância desenvolver um método confiável e sensível para visualizar diretamente as mudanças dinâmicas de gotículas lipídicas nos enocitos durante o desenvolvimento e em condições estressantes. Aproveitando o LIPophilic BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotídea lipídica, descrito aqui é um protocolo detalhado para a dissecação e a mancha lipídica subseqüente na mancha de enocícitos das larvas de Drosophila em resposta à fome. Isso permite a análise qualitativa da dinâmica de gotículas lipídicas várias condições pela microscopia confocal. Além disso, este método rápido e altamente reproduzível também pode ser usado em telas genéticas para identificar novos fatores genéticos envolvendo o metabolismo das gotículas lipídicas em enocitos e outros tecidos.

Introdução

Os lipídios são essenciais para a sobrevivência celular. Além de seu papel tradicional como componentes integrais dos sistemas de membrana celular, os lipídios também desempenham funções cruciais no fornecimento de energia e sinalização transduction ao longo dos ciclos de vida de animais individuais1. Assim, o metabolismo lipídico deve estar em conformidade com regulamentos rigorosos para manter a hemostase fisiológica nas células. Sabe-se que a desregulação do metabolismo lipídico resulta em várias doenças, como diabetes e fígado gorduroso. Apesar da grande importância do metabolismo lipídico na saúde animal, os mecanismos subjacentes à regula....

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Protocolo

1. Postura de ovo

  1. Prepare o alimento padrão da farinha de milho para a postura do ovo.
    Nota: Para a receita e procedimento de cozimento para o alimento padrão da farinha de milho usado aqui, veja os detalhes previamente publicados15.
  2. Prepare pasta de fermento fresco, adicionando 6 mL de água destilada para 4 g de fermento seco ativo em um tubo centrífuga de 50 mL. Use uma espátula para misturar e fazer uma pasta.
  3. Faça garrafas de postura de ovos, enchendo o alimento da farinha de milho nas garrafas e espalhe aproximadamente 1 g de pasta de fermento na superfície da comida de farinha de milho com....

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Resultados

A execução bem-sucedida deste procedimento deve resultar em gotículas lipídicas claras que revelam o número e o tamanho das gotículas lipídicas nos enocitos. A Figura 1A,A',A'' mostra que existem poucas gotículas lipídicas detectáveis (pontos verdes) nos enocitos das larvas normais de alimentação durante diferentes estágios de desenvolvimento. Figura 1B,B',B'' mostra aumento das gotículas lipídic.......

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Discussão

Entre os descritos acima, há vários passos críticos neste protocolo, com o período de tempo de postura de ovos sendo um desses. Como um tecido de mobilização lipídica, o enocito é altamente sensível ao estado nutricional6,8. Períodos prolongados de tempo de postura de ovos podem resultar em larvas de canto e aumento da concorrência alimentar, levando a resultados imprecisos. O período de tempo de postura de ovos de 1 h usado neste protocolo permite que as larvas .......

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a serem divulgados.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 e 31601112), do Projeto 111 (D18010), do Projeto local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do ....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de centrífuga de 50 mLCorning43082950 mL
6 cm Placa de PetriThermo Fisher1503266 cm
ÁgarPara alimentos para moscas
Folha de alumínioN/AN/AProteger o smaple da luz
BODIPY 493/503InvitrogenD3922Corante de coloração de gotículas lipídicas
MicroscópioconfocalLeicaLeica TSC SP5Imagem confocal
Xaropede milho Para comida para moscas
FubáPara comida para moscas
LamínulaCitoglas10212424C20 mm, 0,13-0,17 de espessura
Pino de dissecaçãoN/AN/A
Placa de dissecaçãoN/AN/A
Papel de filtroN/AN/ADiâmetro: 11 cm
Tampão de fixaçãoN/AN/A4% Paraformaldeído (PFA) em 1x PBS
FórcepsDumont11252-30#5
IncubadoraJiangnanSPX-380Para cultura de moscas
Tubo de microcentrífugaAxygenMCT-150-C1,5 mL
Lâmina de microscopiaCitoglas10127105P-G
Meio de montagemVECTASHIELDAntifade Meio de montagemH-1000Meio de montagem antidesbotamento
EsmaltePanEraAAPR419Selar a lamínula Pincel
N/AN/A
PBSN/A N/A1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4, pH 7.4)
RotatorKylin-Bell Lab InstrumentsWH-986
ScissorSmartdata MedicalSR81Vannas primavera tesoura
Farinhapara comida de mosca
EspátulaN / AN / A
Comida de fubá padrãoN / AN / ACodificação para receita de comida de fubá padrão
Bloomington Estéreo microscópioLeicaLeica S6EPara dissecção de tecidos
Limpe o papelN/AN/A
LeveduraPara comida para moscas
ywMantido como estoque de laboratórioN/ADrosophila
de soja

Referências

  1. Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
  2. Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-5....

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