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Artigo de método

In Vivo Infecção com Leishmania amazonensis avaliará virulence parasita em camundongos

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DOI:

10.3791/60617

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20 de fevereiro de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo compilado para avaliar a infecção cutânea de camundongos com Leishmania amazonensis. Este é um método confiável para estudar a virulência parasite, permitindo uma visão sistêmica da resposta do hospedeiro vertebrado à infecção.

Resumo

Leishmania spp. são parasitas protozoários que causam leishmanioses, doenças que apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, desde lesões cutâneas até viscerais. Atualmente, estima-se que 12 milhões de pessoas estejam infectadas pela Leishmania em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas vivem em risco de infecção. A leishmania amazonensis é endêmica na América Central e do Sul e geralmente leva à forma cutânea da doença, que pode ser diretamente visualizada em um modelo animal. Portanto, as cepas de L. amazonensis são bons modelos para estudos de leishmaniose cutânea, pois também são facilmente cultivados in vitro. Camundongos C57BL/6 imitam a progressão da doença orientada por L. amazonensisobservada em humanos e são consideradas um dos melhores modelode cepas de camundongos para leishmaniose cutânea. No hospedeiro vertebrado, esses parasitas habitam macrófagos apesar dos mecanismos de defesa dessas células. Diversos estudos utilizam ensaios de infecção por macrófagos in vitro para avaliar a infectividade do parasita em diferentes condições. No entanto, a abordagem in vitro limita-se a um sistema celular isolado que desconsidera a resposta do organismo. Aqui, compilamos um método de infecção por murina in vivo que fornece uma visão geral fisiológica sistêmica da interação hospedeiro-parasita. O protocolo detalhado para a infecção in vivo de camundongos C57BL/6 com L. amazonensis compreende diferenciação parasite em amastigotes infecciosos, inoculação cutânea do pé de camundongos, desenvolvimento de lesões e determinação de carga parasite. Propomos esse método bem estabelecido como o método mais adequado para estudos fisiológicos das respostas imunes e metabólicas do hospedeiro à leishmaniose cutânea.

Introdução

Os leishmanioses são doenças infecciosas parasitárias predominantes mundialmente representando desafios importantes nos países em desenvolvimento e são reconhecidas como uma das doenças tropicais negligenciadas mais importantes pela Organização Mundial da Saúde1,2. Os leishmanioses são caracterizados por manifestações cutâneas, mucosas e/ou viscerais. Leishmaniose cutânea geralmente é causada por L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica3. Esta forma da doença é muitas vezes auto-curativa em humanos devido à indução da resposta imune celular protetora. No entanto, a resposta imune celular pode falhar, e a doença pode progredir para a leishmaniose cutânea disseminada4,5. Não há vacina disponível devido à diversidade entre espécies de Leishmania e hospedam origens genéticas6,7. As opções de tratamento também são limitadas, pois a maioria dos medicamentos disponíveis atualmente são caros, tóxicos e/ou podem exigir tratamento de longo prazo8,9. Além disso, houve relatos de resistência medicamentosa contra os tratamentos disponíveis10,11.

O agente causal da leishmaniose é o parasita protozoário Leishmania. O parasita apresenta duas formas morfológicas distintas em seu ciclo de vida: promastigotes, a forma flagelada encontrada em moscas de areia; e amastigotes, a forma intracelular encontrada nos vacuoles parasitophorosos dos macrófagos hospedeiros de mamíferos12,13. A capacidade dos amastigotes de invadir, sobreviver e replicar apesar dos mecanismos de defesa dos macrófagos do hospedeiro vertebrado estão sujeitas a muitos estudos14,15,16,17. Consequentemente, vários grupos de pesquisa têm descrito ensaios de infecção por macrófagos in vitro para avaliar o impacto de fatores ambientais específicos, bem como genes parasitas e hospedeiros na infectividade do parasita. Este ensaio apresenta várias vantagens, como a capacidade de adaptar estudos a um formato de alto desempenho, período de tempo relativamente menor para obter resultados, e número reduzido de animais de laboratório sacrificados18. No entanto, os achados dos ensaios in vitro são limitados porque nem sempre se replicam nos estudos vivo14,19,20,21. Em ensaios vivos fornecem uma visão geral fisiológica sistêmica da interação host-parasita, que não pode ser totalmente imitada por ensaios in vitro. Por exemplo, estudos imunológicos podem ser realizados através de ensaios imunohistoquímicos de seções de tecido de pisque coletados ou até mesmo de linfonodos popliteis para análise das células imunes recuperadas22.

Os animais são frequentemente usados como modelo para doenças humanas em pesquisas biológicas e biomédicas para entender melhor os mecanismos fisiológicos subjacentes das doenças23. No caso da leishmaniose, a rota, local ou dose de inoculação influenciam o desfecho da doença24,25,26,27. Além disso, a suscetibilidade e a resistência à infecção em humanos e camundongos são altamente reguladas pelos antecedentes genéticos do hospedeiro e parasita4,5,22,28,29,30,31. Os camundongos BALB/c são altamente suscetíveis à infecção cutânea de L. amazonensis, mostrando uma rápida progressão da doença com a disseminação dos parasitas para os linfonodos, baço e fígado32. Como a doença pode progredir para metástases cutâneas, a infecção pode ser fatal. Em contraste, os camundongos C57BL/6 geralmente desenvolvem lesões crônicas com cargas de parasitas persistentes em ensaios de infecção por L. amazonensis 33. Assim, a infecção por L. amazonensis com essa espécie de camundongos em particular tem sido considerada um excelente modelo para estudar formas crônicas de leishmaniose cutânea em humanos, pois imita melhor a progressão da doença do que o modelo de infecção por camundongos BALB/C5,34.

Por isso, propomos que a murina na infecção vivo seja um método útil para estudos fisiológicos de virilidade leishmania aplicáveis à doença humana, permitindo uma visão sistêmica da interação hospedeiro-parasita. Revisitando ensaios bem estabelecidos22,apresentamos aqui um protocolo compilado passo a passo da infecção in vivo de camundongos C57BL/6 com L. amazonensis que compreende a diferenciação parasita em amastigotes axenic, ambulatora cutânea cutânea cutânea, desenvolvimento de lesões e determinação de carga parasite. Este protocolo pode ser adaptado a outras cepas de camundongos e espécies de Leishmania que causam leishmanioses cutâneas. Em conclusão, o método aqui apresentado é crucial para identificar novas metas e vacinasanti-Leishmania, bem como em estudos fisiológicos das respostas imunes e metabólicas do hospedeiro à infecção por Leishmania.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Biociência da Universidade de São Paulo (CEUA 342/2019), e foram conduzidos de acordo com as recomendações e as políticas de Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais do Estado de São Paulo (Lei Estadual 11.977, lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) e do governo brasileiro (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Todas as etapas descritas nas seções 1-5 devem ser realizadas de forma asséptica dentro de armários de fluxo laminar. Os equipamentos de proteção individual devem ser utilizados durante o manuseio de parasitas leishmania vivos.

1. Diferenciação In Vitro de L. amazonensis Promastigotes em Amastigotes Axenic15,20,35,36,37,38

NOTA: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasita foi usado neste ensaio. Dependendo do propósito do estudo, a forma de parasita infecciosa pode ser obtida seja pela purificação da forma metacíclica utilizando um gradiente de densidade, como descrito anteriormente14, ou por diferenciação de promastigotes em amastigotes axenic, de acordo com o seguinte protocolo.

  1. Grow La promastigotes em um frasco de cultura celular de 25 cm2 contendo 10 mL de médio para promastigotes (pro-médio) (pH = 7,0).
  2. Incubar a 25 °C por 3 dias.
    NOTA: Use culturas promastigotas que foram periciadas in vitro menos de 10x para evitar a perda de virulência e alterações aneuploidy de parasitas39,40,41,42,43,44.
  3. Pipette 5 mL de cultura promastigote fase de crescimento logarítmico em um novo frasco de 25 cm2.
  4. Adicione 5 mL de média para amastigotes axenic (ama-médio) (pH = 5,2).
  5. Incubar a 34 °C por 3-4 dias.
  6. Divida a cultura diluindo com ama-médio a uma proporção de 1:3 em um novo frasco de 25 cm2.
  7. Incubar a 34 °C por 3-5 dias.
    NOTA: Incubar os amastigotes axenic por até 5 dias, pois representa o fim do amadurecimento37.

2. Infecção por Pé c57BL/6 com L. amazonensis

NOTA: Camundongos C57BL/6 femininos (6 a 8 semanas) foram obtidos e mantidos no Centro Animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Os animais receberam comida e água ad libitum.

  1. Conte a cultura dos amastigotes axenic transferindo uma alíquota da suspensão do parasita diluída na PBS para uma câmara de Neubauer (ou seja, hemocímetro). Conte os parasitas não flagrados, que representam formas de amastigotes.
    NOTA: Alternativamente, o Trypan azul (1:1) pode ser usado para contar o número de amastigotes viáveis (ou seja, aqueles que não estão manchados com azul Trypan).
  2. Diluir os amastigotes axenic em PBS de acordo com a dose inólquia desejada e o número de inóculos pretendidos (1 x 106 amastigotes axenic em 50 μL de PBS é recomendado).
  3. Carregue uma seringa de tubécula com uma agulha de 27 G com a suspensão preparada do parasita.
  4. Anestesiar um mouse C57BL/6 usando 3-5% isoflurane, conforme recomendado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins45. Avalie a profundidade anestéstica testando a resposta do mouse a uma pitada de dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo.
  5. Inocular 50 μL da suspensão de parasitas homogeneizada (1 x 106 amastigotes axenic ou a dose inólmétrica desejada) no tecido subplantar do footpad traseiro esquerdo, utilizando a seringa de tubéculina previamente carregada (passo 2.3).

3. Desenvolvimento de Lesões de Pé de Rato

  1. Meça a progressão da lesão uma vez por semana medindo a espessura das pastilhas esquerda (infectada) e direita (não infectada) usando uma pinça.
  2. Calcule a diferença da espessura entre os peões traseiros esquerdo e direito semanalmente para avaliar a progressão da lesão.
  3. Traçar as diferenças calculadas sobre o eixo Y e o tempo de infecção no eixo X e calcular o significado estatístico.
    NOTA: De acordo com as recomendações dos Comitês de Cuidados e Uso de Animais, os animais devem ser sacrificados antes que a lesão infectada se torne ulcerada, pois úlceras cutâneas podem levar à infecção secundária. Como mostrado na Figura Complementar 1,leva aproximadamente 10 semanas para as lesões apresentarem sinais de ulceração com a dose de parasita (106 amastigotes axenic) e cepa hospedeira (C57BL/6) utilizadaneste protocolo. Os camundongos devem ser sacrificados para extração de lesões antes que os sinais de ulceração sejam observados.

4. Extração de Lesão de Pé de Camundongos e Diluição limitante do parasita

  1. Prepare uma placa de 96 poços (fundo plano) para o ensaio de diluição limitante46,47 adicionando 180 μL de pró-médio a todos os poços.
    NOTA: Use quatro faixas de placa (metade da placa) para cada animal, representando ensaios quadruplicates (ou seja, animal 1 = faixas A-D; animal 2 = faixas E-H).
  2. Adicione 1 mL de pró-médio em um tubo moedor de tecido de vidro por lesão e pesar o tubo.
    NOTA: O tubo deve ser mantido estéril, por isso use uma tampa estéril e pese o tubo com a tampa fechada, se pesar fora do armário de fluxo laminar.
  3. Sacrifique o animal em uma câmara de CO2, seguindo as recomendações dos Comitês de Cuidados e Uso de Animais. Desinfete o animal pulverizando com 70% de etanol.
  4. Excir o pé do animal para extrair o footpad infectado e pulverizar 70% de etanol no footpad para desinfecção. Certifique-se de esterilização de tesouras e fórceps mantendo-as encharcadas em 70% de etanol.
  5. Coloque o footpad infectado em uma placa de Petri estéril e disseque usando fórceps estéreis e um bisturi para coletar todos os tecidos moles. Descarte os ossos.
    NOTA: Recomenda-se uniformidade na etapa de dissecção para evitar a recuperação do tecido tendencioso.
  6. Transfira os tecidos coletados para o tubo moedor de tecido de vidro com pró-médio e, em seguida, pese o tubo novamente para determinar o peso da lesão.
    NOTA: Evite colocar os fórceps e bisturi diretamente no meio, pois pequenos volumes podem ser removidos, resultando em um peso tecido subestimado. O peso da lesão é calculado subtraindo o peso do tubo contendo pró-médio com o tecido coletado do peso do tubo contendo apenas pró-médio.
  7. Homogeneize o tecido de 10x usando o moedor para interrupção completa do tecido.
  8. Deixe a mistura sedimentar por 10 min, depois cole 20 μL do supernatante.
  9. Carregue 20 μL do supernatant na1ª coluna da1ª pista da placa de poço 96 preparada na etapa 4.1. Repita isso para as próximas três pistas para ter quadruplicatos para cada animal (ou seja, para animal 1 adicionar 20 μL a cada poço e rotular A1, B1, C1 e D1).
  10. Homogeneize cada poço na1ª coluna 10x usando uma pipeta multicanal. Em seguida, transfira 20 μL das amostras diluídas da1ª coluna para acoluna 2.
    NOTA: É importante homogeneizar cada poço de 10x de uma coluna para outra.
  11. Repita a etapa 4.10 para todas as colunas restantes até a última coluna(12)e descarte os 20 μL finais de amostra diluída.
    NOTA: Altere as dicas após cada diluição para evitar contaminação cruzada.
  12. Selar as placas com um filme e incubar a 25 °C por 7 dias em uma câmara úmida.

5. Determinação de carga de parasitas de lesão

  1. Analise as placas após 7 dias de incubação usando um microscópio invertido para determinar o último poço contendo parasitas para cada pista.
    NOTA: Também é possível ter uma indicação do crescimento dos parasitas, ou densidade celular, por análise visual das mudanças de cor e turbidez do meio.
  2. Calcule a carga de tecido parasita para cada pista dividindo o fator de diluição por peso de lesão.
    NOTA: Em uma pista específica, se os parasitas estiverem presentes apenas nas colunas 1-5 (ou seja, os poços A1-A5 são positivos para o crescimento do parasita), isso significa que a coluna 5 continha apenas 1 parasita, a coluna 4 continha 10 parasitas, e assim por diante, em múltiplos de dez. A coluna 1 conteria 104 parasitas, o que representa o número de parasitas nos 20 μL iniciais de supernatant (a amostra não diluída na etapa 4.7). Como este 20 μL foi diluído com 180 μL de pró-médio, o tubo inicial continha 5 x 105 parasitas: (1 x 104) / (0,02 mL) = 5 x 105 parasitas/1 mL. Em seguida, a carga de parasitas nessa lesão pode ser calculada dividindo a concentração inicial do parasita pelo peso da lesão: (5 x 105) / peso da lesão (ver passo 4.6).
  3. Traçar a média do resultado quadruplicado para cada animal com uma escala Y log.

6. Análise Estatística

  1. Represente os dados como um desvio padrão ± médio usando pelo menos cinco animais por grupo experimental como replica.
  2. Realizar análiseestatística utilizando teste de duas caudas não emparelhado, considerando um valor p < 0,05 como significativo.

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Resultados

Parasitas protozoários de leishmania existem em duas formas de desenvolvimento durante seu ciclo de vida em hospedeiros invertebrados e vertebrados: promastigotes, as formas proliferativas encontradas no lúmen da sandfly fêmea; e amastigotes, as formas proliferativas encontradas nos vacúrios parasitophorosos das células hospedeiras dos mamíferos. Os promastigotes têm um corpo alongado de aproximadamente 1,5 μm de largura e 20 μm de comprimento, com um flagellum tipicamente emergi...

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Discussão

O ensaio de infecção in vivo descrito neste protocolo permite que qualquer pesquisador avalie na leishmaniose cutânea vivo considerando a interação hospedeiro-parasita em um cenário sistêmico. Esses ensaios têm sido utilizados por muitos grupos22,24,27,29,31,32,34,

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos ao Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara, do Centro Animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pelo apoio e pela Profª Dra. Este trabalho contou com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP - Bolsa 2017/23933-3).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 96 poçosGreiner bio-ne655180Uma placa de fundo plano para limitar o ensaio de diluição
adeninaSigmaA8626Suplemento adicionado ao paquímetro de meios de cultura de células M199
Mitutoyo700-118-20Um paquímetro para medir a espessura do frasco de cultura de células da almofada do pé
Corning353014Um frasco de cultura de células de 25 cm2 volume para cultivar centrífuga de parasitas Leishmania
Eppendorf5804RUm equipamento usado para separar amostras com base em sua densidade
CO2 incubadora 34 ° CThermo Scientific3110Uma incubadora para diferenciação de amastigotas
etanolMerckK50237083820Um desinfetante para itens gerais
soro fetal bovinoGibco12657-029de meios de cultura celular M199
Thomas Scientific3431 E04Um tubo para coletar e interromper o tecido
infectado da pataglicoseSynthG1008.01.AHSuplemento adicionado ao meio de cultura de células M199
GraphPad Prism SoftwareGraphPadUm software usado para plotar os dados e calcular a significância estatística
heminSigmaH-2250Suplemento adicionado ao meio de cultura de células M199
HEPESPromegaH5303Suplemento adicionado à incubadora de meios de cultura de células M199
25 ° CFanem347CDUma incubadora para cultivo de promastigotas
microscópio invertidoNikonTMSUm equipamento usado para analisar visualmente as culturas de promastigotas e amastigotas
isofluranoUm anestésico inalante para camundongos (3-5%)
gabinete de fluxo laminarVecoVLFS-09Um gabinete de biossegurança usado para área de trabalho asséptico
Célula M199 meio de culturaGibco31100-035Um meio de cultura celular para
tubo de microcentrífugaAxygenMCT150CUm microtubo usado para coleta, processamento e armazenamento de amostras
pipeta multicanalLabsystemsF61978Uma pipeta multicanal usada para limitar o ensaio de diluição
NaHCO3Merck6329Suplemento adicionado ao meio de cultura celular M199
NaOHSigmaS8045Suplemento adicionado ao meio de cultura celular M199
Câmara NeubauerHBG2266Um hemocitômetro para contagem do microscópio óptico de suspensão parasita
NikonE200Um equipamento óptico usado para contagem de parafilme parasita
Bemis349Um plástico flexível e resistente para selar o placa
penicilina/estreptomicinaGibco15140122Suplemento adicionado ao meio de cultura de células M199
Placas de PetriTPP93100Uma placa estéril para dissecar o tecido da almofada do pé
kit pipetmanGilsonF167360Um kit de micropipeta contendo quatro pipetadores (P2 P20 P200 P1000)
balançaQuimisBG2000Um equipamento usado para pesar a almofada coletada bisturi de lesões
Solidor10237580026Um bisturi para cortar e coletar tecido da pata
pipeta sorológica 10 mLNest327001Uma pipeta estéril usada para transferir volumes de mililitros
pontasAxygenUma ponta de pipeta usada para transferir volumes de microlitros
Trypan blueGibco15250-061Um corante usado para contar parasitas viáveis
peptona tripticaseMerckSuplemento adicionado ao meio de cultura celular M199
seringa de tuberculinaBD305945Seringa com agulha 27G para inocular a suspensão do parasita
Suplemento adicionado ao tubo de moedor de tecido de vidro de cultivo de Leishmania

Referências

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