Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

Este método detalha, do início ao fim, o procedimento cirúrgico para gerar tumores pancreáticos ortotópicos usando uma quantidade mínima de material celular e a subsequente rápida dissociação de tumores estabelecidos para análise abrangente de citometria de fluxo das populações de células imunes, incluindo a análise ex vivo da função das células T.

O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é um carcinoma agressivo, com apenas 8% dos pacientes sobreviventes de 5 anos^1. Como menos de 20% dos pacientes são elegíveis para ressecção cirúrgica^2,amostras de pacientes frescos não são facilmente acessíveis para pesquisa e, portanto, os modelos in vivo fornecem ferramentas essenciais para investigar esta doença. Existem vários modelos de urina de PDAC: ortotópico, subcutâneo, transgênico, intravenoso e xenoenxerto derivado do paciente (PDX), amplamente descrito aqui³. O modelo ortotópico descrito aqui permite a injeção de células PDAC singênicas no pâncreas de camundongos imunocompetentes. Isso pode ser realizado em grandes coortes de ratos selvagens ou mutantes e, portanto, fornece um modelo econômico e consistente para comparação de agentes terapêuticos. Importante, o modelo ortotópico fornece o microambiente cognato para o crescimento celular do tumor e metástases em nossas mãos e outros⁴ para sites clinicamente relevantes (por exemplo, fígado), tornando-o mais clinicamente relevante do que os modelos subcutâneos ou quimicamente induzidos. Tumores ortotópicos exibem características-chave do PDAC, como uma forte reação desmoplástica com abundância de fibroblastos e deposição de matriz extracelular^5. Modelos transgênicos de PDAC são o padrão-ouro do modelo de urina e o mais comumente usado é o modelo KPC, que expressa o mutante Kras^G12D/+ e Trp53^R172H/+ o pâncreas específico pdx-1-Cre promotor⁶. KPC adicional e outros modelos in vivo PDAC são revisados aqui⁷. Camundongos KPC desenvolvem espontaneamente tumores pancreáticos com uma progressão da doença que reproduz fielmente as características do PDAC humano⁶. No entanto, como para todos os modelos transgênicos, o programa de reprodução é caro, a progressão do tumor é variável e, portanto, muitas vezes requer grandes coortes de camundongos. Os modelos PDX usam células tumorais derivadas de pacientes ou pedaços que são cultivados ortotópicamente ou mais frequentemente subcutâneos em camundongos imunocomprometidos. Os modelos xenoenxerto fornecem ferramentas úteis para triagem de compostos terapêuticos e são responsáveis pela heterogeneidade do paciente. No entanto, eles não fornecem um microambiente imunológico completo, limitando assim suas aplicações^8,9.

Uma vez estabelecidos, os tumores ortotópicos normalmente levam cerca de 1 mês ou mais para crescer (dependendo da linha celular usada) e formam grandes tumores que podem ser facilmente imageados por ultra-som ou ressonância magnética para rastrear a progressão e determinar a eficácia do tratamento^4,5,10. No entanto, uma vez em crescimento exponencial, a última fase do crescimento do tumor pode ser rápida, de modo que a maioria dos regimes de tratamento são iniciados relativamente cedo (por exemplo, 14 dias)^11,12. O sistema imunológico desempenha um papel crítico no desenvolvimento do tumor, incluindo no PDAC, que é caracterizado por um tumor imunossupressor infiltrar-se com relativa escassez de células T e presença freqüente de células mieloides¹³. A alta presença de células T em PDAC confere um melhor prognóstico^14,15. No entanto, como agentes individuais, inibidores de pontos de verificação imunes que aliviam a imunossupressão de células T, como anti-CTLA-4¹⁶ e anti-PD-L1^17,não mostraram benefício clínico em pacientes pdac, provavelmente porque a reatividade geral das células T é muito baixa. No entanto, os agentes que as respostas das células T prime, como anti-CD40, podem superar a resistência anti-PD-L1/CTLA-4^18,19 e a vacinação com a vacina PDAC alogênica (GVAX) secretada por GM-CSF pode aumentar a imunogenicidade dos tumores pdac^20,indicando que melhorar as respostas às células T forma importante via terapêutica.

Fundamental para uma resposta antitumoral de células T é o reconhecimento de antígenos derivados do tumor através do receptor de células T (TCR) e da subsequente produção de citocinas citotóxicas e grânulos. Embora o reconhecimento de antígenos de células T possa ser determinado pelo sequenciamento do TCR, essa abordagem é cara e demorada. No entanto, a quantificação de subconjuntos de células T infiltradas por tumor estoneca fornece uma boa indicação de uma resposta antitumoral. Um exame mais aprofundado da atividade das células T ex vivo em termos de degranulação, produção de citocina e outros fatores citotóxicos fornece uma análise funcional mais profunda. Estes ensaios podem ser realizados em amostras tumorais frescas e muitos parâmetros da função da célula T podem ser medidos rapidamente pela citometria do fluxo.

CD8⁺ e CD4⁺ Células T produzem citocinas como IFNγ e TNFα para potencializar uma resposta imune²¹. Ifn' induz mhci upregulation em células-alvo, induz diferenciação e recrutamento de células imunes e ajuda a morte celular. A produção de IFNγ por células T CD8⁺ é bem caracterizada como parte de uma resposta antitumoral e se correlaciona com a regressão tumoral^22,23. TNFα é outra citocina proinflamatória produzida por células CD8⁺ e CD4⁺ T. Melhora a ativação dependente do TCR e a proliferação de células T, auxiliando na resposta antitumoral. Após o envolvimento do TCR, as células T^{CD8 +} T citotóxicas podem sofrer degranulação, onde lisomas secretory pré-formados contendo moléculas citotóxicas são liberados na sinapse imunológica para causar degradação de células-alvo²¹. Estas moléculas incluem Perforin, uma proteína que se liga à membrana celular alvo, formando poros que, em seguida, interromper a integridade da membrana e permitir a difusão²¹ ou endocitose²⁴ de outras moléculas citotóxicas, como Granzyme B, diretamente no citopplasma da célula-alvo. Granzyme B é uma protease que promulga a degradação de múltiplas proteínas dentro da célula-alvo, levando à morte celular²¹. A liberação de tais moléculas requer exocitose de endosomes para a superfície celular, onde o marcador endossômico CD107a (também conhecido como LAMP-1) é incorporado transitoriamente na membrana celular²⁵.

A medição da secreção de citocina pelas células T requer seu isolamento por meio de classificação de células assistidas por fluxo ou ensaios de separação baseados em contas, que não podem ser prontamente realizados em grande número de amostras simultaneamente. No entanto, a medição de citocinas intracelulares não requer quaisquer etapas de pré-isolamento e pode ser facilmente realizada em várias amostras ao mesmo tempo, permitindo uma abordagem de taxa de maior rendimento. Como citocinas são rapidamente secretadas por células T, os níveis intracelulares podem ser indetectáveis e, portanto, a célula T requer estimulação para aumentar a produção de citocina basal. Para avaliar a produção de citocinas movidas por antígenos, o antígeno reconhecido pelo TCR deve ser apresentado à célula T por um APC preparado in vitro. Nos casos em que a especificidade do antígeno não é conhecida, é necessária uma abordagem ampla de estimulação. Estimulação TCR pode ser imitado usando contas anti-CD3/28 que fornecem ativação TCR e coestimulação, o que induz a produção e proliferação de citocina. No entanto, uma alternativa mais econômica é o uso de PMA e ionomicina, que juntos ativam amplamente as vias de sinalização que levam à síntese e liberação de citocinas intracelulares. Especificamente, pma ativa proteína quinase C (PKC) e ionomicina levanta intracelular Ca^{2 +} íons, levando ao aumento da sinalização celular. A fim de preservar o conteúdo intracelular de citocinas, esta estimulação pode ser efetivamente combinada com inibidores de transporte de proteínabrefeldina A e monensina, que bloqueiam proteínas no Golgi e, assim, impedem a liberação extracelular. O uso de PMA/ionomicina é um método bem estabelecido para estimular as células T e há uma forte correlação entre citocinas extracelulares e intracelulares²⁶. A estimulação das células T com PMA e ionomicina também aumenta o tráfico de lisosome para a membrana celular e, portanto, CD107a torna-se transitóriamente integrado na superfície celular antes de ser reciclado na célula. Ao incluir um anticorpo anti-CD107a durante a estimulação, é possível usá-lo como um marcador de atividade de degranulação²⁵.

Este método digere rapidamente os tumores para fornecer uma suspensão unicelular. Neste ponto, as populações individuais podem ser diretamente manchadas para citometria de fluxo ou purificadas por métodos a jusante: classificação de células assistidas por fluxo ou separação de contas magnéticas. A preparação de uma suspensão unicelular para análise de citometria de fluxo permite uma análise de alta taxa de taxa de produtividade de múltiplas populações de células imunes e seus marcadores fenotípicos, proporcionando uma quantificação precisa do número de células imunes e fenótipo.

Finalmente, o protocolo de digestão descrito aqui impede a perda de marcadores de superfície celular e mantém a viabilidade das células imunes, permitindo que as células imunes passem por mais passos de purificação celular e cultura, conforme necessário. No entanto, este método não foi testado para derivar células epiteliais desta digestão.

Os tumores pancreáticos ortotópicos foram gerados como descrito anteriormente¹⁰ de acordo com a Lei de Procedimentos Científicos e Animais do Ministério do Interior do Reino Unido de 1986 e a Diretiva Europeia 2010/63/UE. Todos os camundongos foram monitorados perioperatórios quanto a sinais de dor ou sofrimento, incluindo, entre outros, a perda de peso (> 15% em 72 h ou 20% em qualquer período), piloereção, estreitamento dos olhos, marcha levantada, aparência curvada, bem como sinais de infecção da ferida, incluindo sangramento, vermelhidão e ulceração. O crescimento do tumor foi monitorado por palpação, e sinais clínicos adicionais, como respiração trabalhada, icterícia e extremidades frias, também foram monitorados para avaliar se sinais de ponto final haviam sido alcançados. Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. Todos os reagentes utilizados antes do fluxo de coloração citometria devem ser preparados em condições estéreis.

1. Preparação de células tumorais para injeção

1. Pegue um alibamento da membrana do porão de -20 °C e coloque no gelo a 4 °C durante a noite.
   NOTA: A concentração da membrana do porão pode variar do grupo ao grupo; Portanto, lotes de membrana de porão específicos de lote devem ser testados in vivo para garantir a reprodutibilidade. Um novo lote de membrana do porão é descongelado no gelo a 4 °C durante a noite, em seguida, alicitado em alíquotas definidas pelo usuário, no gelo, e depois armazenados em -20 °C até que seja necessário. Isto minimiza o pipetting e o gelo-descongelamento ao usar a membrana do porão.
   1. Coloque PBS estéril em 4 °C durante a noite para esfriar.
   2. Coloque as pontas estéreis de 200 μL e 1000 μL pipette a -20 °C durante a noite para relaxar.
2. Use células tumorais que são livres de micoplasma, cultivadas por pelo menos 2-10 passagens pós-descongelamento e em fase de registro de crescimento antes da colheita. Este protocolo utiliza a linha celular derivada de murine C57BL/6 KPC: TB32048 fornecida como um presente generoso pelo laboratório de David Tuveson.
   1. Quando as células tumorais são necessárias para a colheita, retire o meio do frasco e lave as células duas vezes na PBS (pré-aquecida a 37 °C).
   2. Adicione 2x tripsina (pré-aquecido a 37 °C) ao frasco por 10 min a 37 °C (a um frasco T175, adicione 5 mL).
   3. Após 10 min, adicione um volume igual de médio completo (10% FBS, 1x penicilina, 1x estreptomicina em DMEM) para o frasco e as células dissociadas, tocando suavemente o frasco e resuspendendo bem em médio.
   4. Transfira as células para um tubo e centrífuga por 5 min a 300 x g e temperatura ambiente (RT).
   5. Retire as células supernatant e resuspender em meio completo para a contagem de células.
   6. Células centrífugas novamente por 5 min a 300 x g e RT, e remover o supernatant.
   7. Resuspender as células em PBS pré-refrigerados para alcançar uma concentração de 1x10⁶ células /mL.
      NOTA: Esta concentração de estoque está preparada para alcançar uma concentração de injeção final de 1000 células em 5 μl. Nós encontramos a injeção de um número mais baixo de pilhas em um baixo volume de injeção minimizou o escapamento da pilha e conseqüentemente a reproducibilidade aumentada entretanto, o crescimento do tumor pode ser dependente da pilha-linha conseqüentemente os usuários devem aperfeiçoar cada linha da pilha.
3. Ao lado disso, coloque um aliquot membrana pré-alicitada porão, no gelo, no capô.
   1. A proporção da solução final da membrana do porão, PBS e pilhas do tumor em PBS preparado para a injeção é 5:3:2. Portanto, a um alibato de 500 μL da membrana do porão adicione 300 μL de PBS pré-refrigerado usando uma ponta de pipeta de 1000 μL pré-refrigerada.
   2. Adicione o PBS diretamente ao aliquot da membrana do porão para minimizar pipetting.
   3. Mantenha o p1000 ajustado a 300 μL e resuspende a membrana de PBS e do porão, certificando-se manter o tubo no gelo para preservar a membrana do porão no estado líquido.
   4. Quando terminou de ejetar toda a membrana do porão da ponta p1000, deixe a ponta no tubo para permitir que toda a membrana/PBS do porão desça mabaixo da ponta da pipeta.
   5. Após 5-10 min, ejetar mais membrana do porão da ponta p1000 de volta para o tubo e deixar o tubo para se sentar no gelo.
4. Tome 200 μL de pilhas resuspended do tumor em PBS e adicione diretamente à membrana do porão usando uma ponta pre-refrigerada da pipeta de 200 μL.
   1. Pegue uma ponta de pipeta p1000 pré-refrigerada fresca, coloque a pipeta em 300 μL e resuspenda 30-40 vezes. Uma ponta maior da pipeta, ajustada em um baixo volume, é preferível porque a membrana do porão pode viajar acima da ponta e tocar no filtro da ponta da pipeta durante o resuspension.
   2. As células tumorais estão prontas para injeção. Mantenha a membrana da pilha/porão do tumor no gelo durante a cirurgia.

2. Injeção ortotópica de células tumorais

1. Aclimate os ratos na instalação animal por 7 dias.
   1. Cerca de 2 h antes da cirurgia, raspar o lado esquerdo do abdômen e das costas, em seguida, administrar subcutâneo analgésico pré-operatório a nuca (Buprenorfina em 50-100 μg/kg).
   2. Prepare o campo cirúrgico, com uma esteira de calor para colocar o rato sobre e drapeja para o equipamento circunvizinho e sobre o rato. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas; prepare conjuntos de ferramentas suficientes para cada mouse.
   3. Coloque o rato em um isoflurane de 5% com câmara O₂ até ficar inconsciente.
   4. Transfira o mouse, deitado de costas, em um tapete de calor e manter anestesia usando uma máscara, geralmente em um isoflurano inferior de 2-3%.
   5. Confirmar anestesia profunda; como identificado pela perda do reflexo de retirada de pedal quando a pata traseira é beliscada e monitorar a taxa de respiração permanece constante.
   6. Cubra o corpo em cortina, com apenas a porção raspada exposta. Certifique-se de que o mouse está seguro na máscara de anestesia.
   7. Usando um cotonete estéril, adicione a solução de iodo em um movimento circular sobre a área raspada: a partir do centro e circulando até a borda. Repita o processo novamente com cotonete fresco e iodo.
2. Use bisturi para fazer uma incisão de 1 cm diretamente acima da localização do pâncreas/baço (quadrante superior esquerdo). Tesoura sérstéril também pode ser usado para fazer a incisão, se preferir.
   1. Puxe a pele para além usando fórceps. Com novos fórceps, localizar a parede peritoneal e usar tesoura para fazer mais 1 cm de incisão através da parede peritoneal.
   2. Extraia o pâncreas, que pode vir com o baço, do corpo usando o segundo par de fórceps.
   3. Gentilmente inverter o frasco de células tumorais / membrana do porão várias vezes para misturar.
   4. Prepare a seringa de vidro com 5 μL contendo 1.000 células tumorais na membrana do porão e coloque no esteira de calor por alguns segundos para permitir que ele aqueça.
      NOTA: O breve aquecimento da seringa permitirá que a membrana do porão comece a solidificar, a fim de facilitar a injeção sem vazamento. Entretanto, isto deve ser mantido breve, se deixado demasiado por muito tempo a membrana do porão solidificará completamente e não será injetada. O uso de uma seringa de vidro permite que um baixo volume seja injetado com precisão.
   5. Segure o pâncreas na cauda para estendê-lo e inserir a agulha diretamente no centro do pâncreas, paralela ao pâncreas em si com um esforço para evitar vasos sanguíneos visíveis.
      NOTA: O centro do pâncreas tem uma grande área e é mais fácil de injetar. No entanto, a cabeça ou cauda do pâncreas também pode ser injetada especificamente, se preferir.
   6. Injetar lentamente 5 μL de membrana do porão no pâncreas e manter a agulha estável no pâncreas por pelo menos 30 s após a injeção para permitir que a membrana do porão para solidificar e evitar vazamento. A membrana do porão deve ser visível como uma bolha desobstruída pequena terá dado forma; no entanto, pode não ser visível.
      NOTA: Maiores volumes de células tumorais / membrana do porão podem ser injetados; no entanto, o volume exato deve ser testado para garantir que o vazamento não ocorra.
   7. Retire a agulha do pâncreas e espere para confirmar que nenhum sangramento ocorreu. Insira delicadamente o pâncreas de novo na cavidade abdominal, tomando cuidado para não tocar na bolha da membrana do porão.
   8. Puxe a parede peritoneal junto e execute uma única sutura, ou duas suturas interrompidas se necessário.
   9. Puxe os dois lados da incisão da pele juntos e realizar várias suturas interrompidas, conforme necessário ou inserir dois clipes cirúrgicos.
3. Administrar outra injeção subcutânea de buprenorfina na nuca.
   1. Transfira o mouse para uma gaiola aquecida de 37 °C por pelo menos 30 min após a cirurgia para manter a temperatura corporal antes de transferir de volta para uma gaiola fresca.
   2. Prepare uma dieta mash disponível na gaiola, para garantir a reidratação e peso corporal.
   3. Readministrar a analgesia pós-operatória, conforme recomendado, e observe de perto os sinais de abertura de feridas, dor ou infecção e perda de peso. Se usar clipes cirúrgicos, estes podem ser removidos 7-10 dias depois usando um removedor de clipe.
   4. Após cerca de 14 dias, o tecido cicatricial terá curado o suficiente para começar a palpating o abdômen. Monitore o tamanho do tumor de perto através da palpação até que os ratos atinjam o ponto final.
   5. No ponto final, o rato é abatido através de deslocamento cervical seguido de decapitação. A pele e a cavidade peritoneal são abertas usando tesouras e o tumor do pâncreas excisou usando fórceps para prender o tumor, e tesouras para remover o tecido circunvizinho.

3. Digestão de tumores pancreáticos

1. Coloque o tumor pancreático dissecado, tumores de local metastático, ou tecido pancreático saudável em PBS gelada, e armazenar no gelo.
   1. Use fórceps para transferir o tumor para uma placa de Petri.
   2. Adicione 5,0 mL de médio de digestão (2 mg/mL Collagenase, 0,025 mg/mL DNase RPMI) em um tubo de 50 mL; armazenar no gelo para evitar a atividade enzimática começando.
      NOTA: Este protocolo utiliza collagenase tipo V, que tem uma atividade de ≥1 unidades/mg FALGPA e > 125 unidades de digestão de colágeno (CDU)/mg sólidas. Collagenase e dnase aliquots podem ser armazenados a -20 °C e descongelados no gelo antes do uso. Quando ambos são completamente solubilizados em RPMI estéril, eles podem ser passados através de um filtro de 0,2 μm para remover contaminantes. A colagem deve ser completamente solubilizada antes da filtragem para evitar a perda de material.
   3. Pegue um pequeno alibado desta solução para cobrir o tumor na placa de Petri.
   4. Use bisturi efórico estéril para cortar o tumor em pedaços pequenos, cerca de 3 mm de comprimento.
   5. Raspe os pedaços do tumor no tubo e gentilmente inverter o tubo até que todas as peças estão submersas em mídia de digestão. Guarde no gelo se outras amostras de tumor precisam ser preparadas em um lote.
   6. Transfira para um dispositivo de agitação por 20 min a 37 °C. Certifique-se de que todos os pedaços de tumor estão submersos e não presos à borda do tubo. Se a agitação não for possível, então vortex a amostra a cada 5 min para ajudar a digestão.

4. Preparação da suspensão unicelular do tumor digerido

1. Imediatamente após o passo de digestão, coloque o tubo no gelo para retardar a atividade enzimática.
   1. Adicione EDTA para alcançar uma concentração final de 20 mM e brevemente amostra de vórtice para misturar. Isto retardará mais a atividade da enzima.
   2. Abra o tubo e lave qualquer tumor digerir fora da tampa do tubo com médio RPMI fresco.
   3. Prepare um filtro de 70 μm (o tamanho μm do filtro pode ser alterado como desejado) em um tubo aberto de 50 mL, no gelo.
   4. Pré-molhe o filtro com médio.
   5. Resuspenda as células digeridas e lave os lados do tubo usando uma stripette de 25 mL, ou maior. A abertura mais larga do stripette é importante permitir que o digesto grosso passe facilmente.
   6. Transfira todo o resumo, usando a stripette de 25 mL, para o filtro.
   7. Amasse o tumor em cima do filtro usando um desentupidor de seringa de 1 mL. Mash apenas diretamente para cima e para baixo para minimizar o estresse de cisalhamento para as células.
   8. Lave continuamente as células através do filtro com RPMI. Certifique-se de lavar com força suficiente para empurrar as células.
   9. Se ainda houver material para triturar, mas o RPMI pára de passar, o filtro será saturado. Portanto, transfira a amostra para um novo filtro e continue.
      NOTA: Eventualmente, apenas componentes de matriz extracelular permanecerá no filtro, todas as células individuais devem ter passado.
2. Centrífuga do tubo por 5 min a 300 x g e 4 °C.
   1. Suspenda cuidadosamente a pelota celular em RPMI completo e passe diretamente por outro filtro para remover qualquer matriz extracelular ou grandes grupos celulares que não possam ser adequadamente resuspensos.
   2. Neste ponto, se nenhuma estimulação é necessária, mancha imediatamente as pilhas isoladas para a análise da citometria do fluxo saltando à etapa 6.1. Alternativamente, resuspendê-los em meio de congelamento (10% DMSO em FBS) e armazenar a -80 °C seguido de armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido.
      NOTA: O passo de congelamento pode permitir a purificação das células imunes em uma data posterior; no entanto, a quantificação dos subconjuntos de células imunes pode exigir otimização para confirmar que o número de células e fenótipo não é afetado pelo processo de congelamento / degelo. A estimulação da célula T ex vivo é melhor realizada em amostras de tumor estiveram frescas. Neste ponto, a amostra pode ser ainda mais purificada pela remoção de células mortas à base de contas ou ensaios de enriquecimento de células imunes, se necessário.

5. Preparar células para estimulação ex vivo

1. Conte as células para alcançar uma concentração de 2 x 10⁶/ 100 μL em meio completo (RPMI 10% FBS, 1X penicilina e 1X estreptomicina).
   NOTA: O elevado número de células totais banhadas garante que haverá células T adequadas dentro desta amostra para analisar. No entanto, o número pode ser ampliado para cima ou para baixo, dependendo da disponibilidade da amostra e da natureza rara dos subconjuntos de interesse de células T.
   1. Placa 100 μL das pilhas em uma placa de 96 poços U-bottomed.
   2. Adicione 100 μL de meio completo contendo uma preparação 2x de PMA/ ionomicina (para alcançar uma concentração final 0.081 μM e 1.34 μM, respectivamente, como recomendado pelo fabricante).
      NOTA: Se medir a degranulação/exocitose, inclua também aqui um CD107a anti-mouse fluorescente conjugado na mídia. Uma amostra de controle que não contenha CD107a também deve ser realizada.
   3. Coloque em 37 °C incubadora com 5% CO₂ para 1 h.
   4. Adicione 20 μL de uma preparação 10x de brefeldin A e monensin (para alcançar uma concentração final 1.06 μM e 2.0 μM, respectivamente (como recomendado pelo fabricante) em meios completos.
      NOTA: Brefeldin A e monensina são inibidores de transporte de proteínas e, assim, bloquear a liberação extracelular de citocinas, etc, permitindo a sua detecção por citometria de fluxo. Se medir a liberação de citocina no supernatant pela ELISA ou métodos similares - então esta etapa pode ser ignorada.
   5. Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂ para mais 4 h.

6. Coloração extracelular e intracelular para citometria de fluxo

1. Retire a placa e resuspenda cada poço para transferir todo o material para uma placa com fundo De V, colocada no gelo.
   NOTA: Células epitelias, macrófagos e outras células aderentes podem não ser totalmente recuperadas a partir da resuspensão. No entanto, como a análise a jusante é apenas em células T, isso não é um problema.
   1. 6.1.1 Centrífuga a placa para 5 min em 300 x g e 4 °C (use estas circunstâncias para etapas subseqüentes a menos que indicado).
   2. Retire o supernatant, sacudindo a placa de cabeça para baixo em um movimento afiado.
2. Resuspenda em 50 μL de um corantes de viabilidade fixáveis, preparados em PBS gelado. Ao resuspender, definir a pipeta para um volume mais baixo para evitar fazer bolhas.
   1. Incubar por 20 min a 4 °C, no escuro.
   2. Passo de lavagem: Adicione 100 μL de buffer FACS, centrífuga e retire o supernatant.
3. Resuspenda cada poço com 50 μL de anti-CD16/CD32 (2,5 μg/mL) no buffer FACS (0,5% BSA, 2,0 mM EDTA no PBS) para bloquear a ligação não específica de anticorpos de detecção aos receptores Fc.
   1. Incubar por 15 min a 4 °C, no escuro.
4. Adicione diretamente a cada poço um mastermix 2x de cD45 anti-mouse com conjugado fluorocromático, CD3, CD4 e CD8 (mais marcadores extracelulares podem ser adicionados conforme desejado) no buffer FACS.
   1. Incubar por 30 min a 4 °C, no escuro.
   2. Passo de lavagem: Adicione 100 μL de buffer FACS, centrífuga e retire o supernatant.
5. Adicione 100 μL de 1x Intracelular (IC) buffer de fixação e incubar por 30 min em RT, no escuro.
   1. Prepare a centrífuga na RT.
6. Adicione 100 μL de buffer FACS, centrífuga por 5 min a 300 x g e RT e retire o supernatant. Repita com tampão de permeabilização 1x e centrífuga por 5 min a 300 x g; em seguida, retire o supernatant.
7. Adicione 50 μL de mastermix 1x de finγ anti-mouse conjugado fluorocromático, TNFα e outros marcadores intracelulares preparados em buffer de permeabilização 1x.
   1. Incubar por 1 h em RT, no escuro.
   2. Adicione 100 μL de buffer de permeabilização para lavar. Em seguida, centrífuga por 5 min a 300 x g e RT e remover o supernatant.
   3. Adicione 100 μL de buffer FACS para lavar, centrífuga por 5 min a 300 x g e RT e remover o supernatant.
8. Após esta centrifugação final, resuspende as células em um volume compatível com o citometro de fluxo. Pode variar dependendo do tamanho dos tubos FACS.
   1. Transfira esse volume para tubos FACS apropriados para aquisição.
   2. Cubra da luz e guarde na geladeira e adquira as amostras dentro das 24 h.

Depois de injetar 1000 células TB32048 no pâncreas, tumores ortotópicos levam aproximadamente 30 dias para se desenvolver (Figura 1A,B). Vazamento de membrana do porão durante a cirurgia pode causar grandes tumores para formar diretamente na parede peritoneal, que são proeminentemente visíveis através da pele(Figura 1C). Nós removeríamos estes ratos do estudo. No entanto, com boas habilidades cirúrgicas, a incidência de vazamento é minimizada. Tumores ortotópicos colhidos no ponto final podem crescer para um tamanho substancial em camundongos do tipo selvagem C57BL/6 (Figura 1D). Tumores ortotópicos colhidos requerem digestão em colagem/DNase por 20 minutos, a fim de alcançar uma suspensão unicelular (Figura 2). Neste ponto, as células derivadas do tumor podem ser banhadas em uma placa com fundo u em 2 x 106 células/poço. O número de células banhadas pode ser alterado dependendo da prevalência de células T dentro da amostra; o número celular pode ser reduzido se as células T estiverem em alta densidade. Controlar amostras de baço ou nóde linfático também pode ser banhado neste momento para estimulação. Cada poço é estimulado com PMA e ionomicina por 5 h e após 1 h incubação, brefeldin A e monensin são adicionados, a fim de bloquear a liberação extracelular de citocinas (Figura 2). Após a incubação, as amostras são manchadas para epítopos extracelulares e citocinas intracelulares para análise por citometria de fluxo(Figura 2).

Amostras de baço e tumores de camundongos com tumores ortotópicos foram analisadas por citometria de fluxo. A estratégia de gating usada na análise de citometria de fluxo para o baço e tumores ortotópicos exclui detritos usando FSC-A, SSC-A, dobra-los por FSC-A/FSC-H e SSC-A/SSC-W, então células mortas ou apoptotices como positivas para dye de viabilidade fixável (Figura 3A). As células imunes são então fechadas como CD45+, e as células T mais fechadas como CD3+ a partir do qual CD4+ e Subconjuntos CD8+ são definidos (Figura 3A). Uma fluorescência menos uma (FMO) é realizada para determinar a fluorescência de fundo para gating e um controle de brefeldin A/monensin só é realizado para determinar a produção basal de citocinas (Figura 3B-D).

Para IFNγ, a incubação com brefeldin A/monensin não resultou em nenhum aumento no IFNγ sobre o controle de FMO em amostras de baço e tumor. No entanto, a adição de PMA e ionomicina aumentou o% do IFNintracelular detectável em células CD4+ e T derivadas de tumores e em genes T.

As células CD4+ e CD8+ T, utilizadas como controle positivo, têm uma produção relativamente maior de IFNγ do que subconjuntos de células T infiltradas em tumores, com uma média de 6,60 ± 1,5 % e 12,97 ± 3,4% em comparação com 4,81 ± 1,0 % e 4,13 ± 1,3%, indicando que as imunossupressões ocorrem dentro do tumor (Figura 3B e 4A). Usando a mesma estratégia para TNFα, visualizamos que uma alta porcentagem de células CD4+ T espênnicas é positiva para TNFα intracelular (65,93 ± 2,3%), em comparação com células CD4+ T infiltradas por tumor (22,45 ±5,4%). As células CD8+ T que se infiltram em tumores e tumores produzem níveis semelhantes de TNFα (25,15 ± 3,7 % e 19,91 ± 5,1%, respectivamente) (Figura 3C, Figura 4B).

Finalmente, CD107a é um marcador endosômico que é expresso transitoriamente na superfície celular durante a exocitose de grânulos citotóxicos e citocinas, como tal, é usado como um marcador substituto para citotoxicidade. O benefício da coloração para CD107a durante a estimulação é que todos os CD107a expressos transitoriamente da pilha-superfície serão capturados pelo fluorescente-anticorpo. Os níveis basais de CD107a são mostrados em células tratadas apenas em brefeldin A/monensin. Para as células CD8+ T esplênicas, estimulação com PMA/ ionomicina aumenta o nível de CD107a detectado, com a maior upregulação em CD8+ células que foram 23,95 ± 3,5% CD107a+, em comparação com 5,8 ± 1,9 % na infiltração tumoral CD8+ células, indicando CD8 esplênico+ teve uma maior taxa de degranação. Por outro lado, cd4 baço e tumoradorinfiltrado + expressou níveis comparáveis de CD107a 9,37 ± 1,5 % e 11,50 ± 1,8 % (Figura 3D e 4C).

No geral, esses resultados destacam que tumores ortotópicos podem ser gerados a partir da injeção de um número muito baixo (1.000) de células tumorais no pâncreas. Estes tumores podem ser rapidamente digeridos para o isolamento das células T para estimulação ex vivo. A detecção de citocinas intracelulares é possível e destaca o nível basano de imunossupressão de células T infiltradas, em comparação com as células T em órgãos linfóides secundários.

Figura 1: Geração de tumores pancreáticos ortotópicos. (A)Programação de experimentos in vivo. (B) A aparência macroscópica de tumores ortotópicos dentro da cavidade abdominal (esquerda) e após a excisão (direita), onde o tumor mostrado foi cortado pela metade. (C) Evidências de vazamento de membrana do porão durante a cirurgia podem fazer com que tumores se desenvolvam que sejam visíveis através da pele (foto superior) e se formem na parede peritoneal (foto inferior). (D)Pesos ortotópicos do tumor pancreatic colhidos dos ratos que tinham alcangado o ponto final (n=22). Cada ponto de dados representa um mouse individual, gráfico de barras mostra média ± SEM. Os dados deste valor foram modificados a partir do trabalho publicado anteriormente10. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Esquemático de processamento de tumores ortotópicos para estimulação de células T ex vivo. Após a colheita, os tumores pancreáticos são rapidamente digeridos em Collagenase (2 mg/mL) e DNase (0,025 mg/mL) por 20 min a 37 °C. Depois disso, as células são resuspensas em 2 x 106/mLem mídia RPMI completa e banhadas em uma placa com fundo u. Um coquetel de estimulação de PMA e ionomicina é adicionado por 5 h, altura em que o anticorpo CD107a anti-mouse também pode ser adicionado à cultura. Após 1 h de incubação os bloqueadores de transporte intracelular, brefeldin A e monensin, são adicionados. Após a estimulação ex vivo, as células são transferidas para uma placa com fundo v para colorir com o tinuche de viabilidade fixável (em PBS) por 20 min 4 °C. As células são lavadas no tampão FACS e incubadas em anti-CD16/32 (bloco FcR) por 15 min (no tampão FACS) e, em seguida, incubadas com anticorpos extracelulares fluorescentes conjugados por mais 30 min (no tampão FACS). As células são lavadas novamente no tampão FACS e resuspendem no buffer de fixação intracelular por 20 min. Depois disso, as células são lavadas uma vez no tampão FACS e uma vez em 1x buffer de permeabilização. As células são resuspensas por 1 h na RT em anticorpos intracelulares fluorescentes conjugados por 1 h (em buffer de permeabilização 1x). As células são lavadas uma vez em buffer de permeabilização 1x e uma vez no buffer FACS antes de resuspender no buffer FACS para aquisição no citometro de fluxo dentro de 24 h. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 3: Análise de citometria de fluxo de células T derivadas de baço e tumor. (A)Estratégia de gating de citometria de fluxo usada para amostras de baço (controle positivo) e tumores ortotópicos. As células são discriminadas a partir de detritos usando FSC-A/SSC-A e células individuais são ainda mais isoladas usando FSC-A/FSC-H e SSC-A/SSC-W. Células mortas ou apoptóticas são excluídas usando o tintilo de viabilidade fixável -FVD506 e as células imunes são fechadas por CD45+. Após este CD3+ células T e CD4+ e Subconjuntos CD8+ são definidos. Os dados foram adquiridos em um BD Fortessa. (B) A estratégia de gating usado para quantificar IFNγ+ CD4+ e CD8+ células T. Um controle fluorescente menos um (FMO) é usado em amostras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldin A/monensin) para determinar a fluorescência de fundo. Um controle apenas brefeldin A/monensin (apenas B+M) é usado para determinar a produção basal de citocina. A amostra totalmente estimulada é então usada para calcular as células IFNγ+ T%. (C) A estratégia de gating usado para quantificar TNFα+ CD4+ e CD8+ células T. Um controle de FMO é usado em amostras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldin A/monensin) para determinar a fluorescência de fundo. Um controle apenas brefeldin A/monensin (apenas B+M) é usado para determinar a produção basal de citocina. A amostra totalmente estimulada é então usada para calcular as células T % TNFα+ T. (D)A estratégia de gating usado para definir CD107a+ CD4+ e CD8+ células T. Um controle de FMO é usado em amostras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldin A/monensin) para determinar a fluorescência de fundo. Um controle apenas brefeldin A/monensin (apenas B+M) é usado para determinar a degranulação basal. A amostra totalmente estimulada é então usada para calcular as células CD107a+ T%. Todos os dados de citometria de fluxo foram analisados na Versão FlowJo 10.6.1. Os dados deste valor foram modificados a partir do trabalho publicado anteriormente10. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Quantificação da atividade de células T derivada do baço e tumoro ex vivo. A proporção de células CD4+ e CD8+ T positivas para (A)IFNγ+ (B) TNFα+ e (C)CD107a+ foi quantificada no baço (n=4) e tumor (n=7) de camundongos ortopotópicos tumorais. Cada ponto de dados representa um mouse individual e barras de erro display significa ± SEM. Significância estatística foi testado usando um t-teste não emparelhado onde * = p <0.05 e *** = p <0.001. Todos os dados foram analisados por meio do Prism 8. Os dados deste valor foram modificados a partir do trabalho publicado anteriormente10. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Os autores não têm nada a divulgar.