Sistema de Cocultura Multidimensional para Modelar Progressão do Carcinoma Escamoso Pulmonar

Resumo

Um sistema de modelo in vitro foi desenvolvido para capturar alterações arquitetônicas teciduais durante a progressão do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) em uma cocultura tridimensional (3D) com fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Este sistema organóide fornece uma plataforma única para investigar os papéis de diversas alterações tumorais intrínsecas e extrínsecas que modulam o fenótipo tumoral.

Resumo

As interações tumorais-estroma desempenham um papel crítico no desenvolvimento do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC). No entanto, entender como essas interações dinâmicas contribuem para as mudanças arquitetônicas teciduais observadas durante a tumorigênese continua sendo desafiador devido à falta de modelos adequados. Neste protocolo, descrevemos a geração de um modelo de cocultura 3D usando uma cultura de células primárias LUSC conhecida como TUM622. As células TUM622 foram estabelecidas a partir de um xenoenxerto derivado do paciente LUSC (PDX) e têm a propriedade única para formar estruturas semelhantes a acinar quando semeadas em uma matriz de membrana de porão. Demonstramos que o TUM622 acini na cocultura 3D recapitula as principais características da arquitetura tecidual durante a progressão do LUSC, bem como as interações dinâmicas entre as células LUSC e componentes do microambiente tumoral (TME), incluindo o extracelular matriz (ECM) e fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Adaptamos ainda nosso protocolo principal de cultivo 3D para demonstrar como esse sistema poderia ser utilizado para várias análises a jusante. No geral, este modelo organóide cria uma plataforma biologicamente rica e adaptável que permite obter uma visão sobre os mecanismos intrínsecos e extrínsecos que promovem a ruptura das arquiteturas epiteliais durante a progressão do carcinoma e ajudarão a busca por novos alvos terapêuticos e marcadores diagnósticos.

Introdução

O câncer de pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. Carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), que é o segundo tipo mais comum de câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC) e é responsável por aproximadamente 30% de todo o câncer de pulmão, é frequentemente diagnosticado em estágios avançados e tem um prognóstico ruim¹. As opções de tratamento para pacientes com LUSC são uma necessidade importante não atendida que pode ser melhorada por uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes que impulsionam a tumorigênese lusc.

Como na maioria dos cânceres humanos, a patogênese do LUSC é caracterizada pela ruptura da arquitetura de tecido epitelial intacta e bem ordenada². Durante esse processo, são perdidos os contatos adequados das células-basais, células-células e matriz celular, permitindo crescimento descontrolado e comportamento invasivo das células tumorais. Agora é amplamente apreciado que as características malignas das células cancerosas não podem se manifestar sem uma interação importante entre as células cancerígenas e seu microambiente tumoral local (TME)³. Os principais componentes do TME, incluindo matriz extracelular (ECM), fibroblastos associados ao câncer (CAFs), bem como células endoteliais e células imunes infiltradas formam ativamente o TME e impulsionam a tumorigênese⁴. No entanto, nossa compreensão atual de como as células tumorais e esses componentes-chave no TME interagem para conduzir mudanças arquitetônicas teciduais durante a progressão do LUSC é muito limitada.

A cultura tridimensional (3D) é uma importante ferramenta para estudar as atividades biológicas das alterações células intrínsecas e extrínsecas na regulação das alterações arquitetônicas teciduais em tecidos normais e doentes⁵. As culturas 3D fornecem o contexto estrutural e funcional adequado que geralmente falta nas culturas bidimensionais tradicionais (2D). As dimensões adicionadas desses sistemas imitam mais de perto o tecido in vivo em muitos aspectos da fisiologia celular e comportamentos celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração, expressão proteica e resposta ao tratamento medicamentoso. Nos últimos anos, esforços de vários laboratórios levaram ao desenvolvimento de modelos 3D in vitro tanto para o pulmão normal quanto para o NSCLC^6,7,8. No entanto, um modelo para carcinoma escamoso pulmonar que pode recapitular tanto as mudanças arquitetônicas dinâmicas do tecido durante a tumorigênese como incorporar componentes estrôneos-chave não estava disponível.

Aqui, descrevemos os métodos para estabelecer um novo sistema de cocultura tridimensional (3D) utilizando células LUSC derivadas do PDX primário (denominadas TUM622) e CAFs^9,10. Tanto tum622 quanto CAFs são derivados de pacientes NSCLC com tumores mal diferenciados¹⁰. Quando incorporadas como células únicas em ECM, uma rara subpopulação de células TUM622 tem a capacidade de formar organóides com estruturas semelhantes a acinar que exibem polaridade celular apical-basal adequada. Essas estruturas semelhantes a acinar são hiperplásticas, exibem expressão heterogênea de marcadores semelhantes a hastes e diferenciais semelhantes ao tumor original, permanecendo não invasivos, e assim imitam o estágio mais antigo do desenvolvimento do LUSC. É importante ressaltar que a arquitetura tecidual das estruturas semelhantes ao acinar pode ser alterada pela inibição de vias de sinalização intrínsecas celulares com inibidores de pequenas moléculas ou adição de componentes-chave no ECM, como os CAFs, este último melhora a formação de acini e provoca ainda mais o acini a se tornar invasivo quando em proximidade. Juntos, esses dados sugerem que este sistema de cocultura 3D de organóides LUSC fornece uma plataforma valiosa para a investigação da reciprocidade dinâmica entre as células LUSC e o TME e poderia ser adaptado para monitorar a resposta das células LUSC ao tratamento medicamentoso¹¹.

Protocolo

1. Passaging e Culturing TUM622 Células e CAFs em Culturas 2D

1. Passaging e culturing Células TUM622
   1. Reagentes de cultura 3D aquecidos e reagentes de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) para células TUM622 a 37 °C.
   2. Passagem Células TUM622 com 80% de confluência em frascos 2D. Normalmente, isso ocorre uma semana após a aprovação.
   3. Descarte o meio antigo de um frasco T75 e lave uma vez com 6 mL de tampão HEPES. Evite pipetting diretamente sobre as células.
   4. Apirateo o tampão HEPES. Adicione 4 mL de tripsina/EDTA (0,25 mg/mL, consulte Tabela de Materiais) para uma lavagem rápida e descarte a tripsina/EDTA.
   5. Adicione 2 mL de tripsina/EDTA e incubar a 37 °C por 5 min. Remova os frascos da incubadora e toque nos frascos para soltar as células sem criar bolhas de ar e retorne os frascos à incubadora por mais 5 min.
      NOTA: A exposição prolongada à tripsina danificará irreversivelmente as células e alterará seu fenótipo, sendo assim recomendado limitar o tempo que as células são expostas à tripsina.
   6. Confirmar as células se desprenderam e se dissociaram um microscópio leve (4x ou 10x). Adicionar 4 mL de buffer de neutralização (buffer TNS) (ver informações de reagente de subcultura na Tabela de Materiais) seguido por 10 mL de meio de cultura 3D (ver Tabela de Materiais).
   7. Pipeta para cima e para baixo suavemente para dissociar ainda mais as células usando uma pipeta de 10 mL. Transfira a suspensão através de um filtro de células de 40 μm para um tubo cônico de 50 mL.
   8. Conte números de células usando um hemocytometer ou contador de celular automatizado.
   9. Sementes 0,8 x 10⁶ células/frasco T75 em 20 mL de meio de cultura 3D (ver Tabela de Materiais).
   10. Alimente as células todos os dias, substituindo metade do meio gasto por meio fresco.
2. CaFs de passagem e cultivo
   1. Passagem CAFs quando as células atingem a confluência. Normalmente, isso ocorre após 5 dias de cultivo de uma divisão 1:2.
   2. Prepare o meio CAF utilizando o meio basal RPMI com 20% de soro bovino fetal inativado pelo calor, 1% de L-Glutamina e 1% de Penicilina/Estreptomicina. Aqueça o meio a 37 °C.
   3. Em um frasco T75, enxágue OS CAFs com solução salina tamponada por fosfato (PBS) uma vez, adicione 2 mL de tripsina/EDTA e incubar a 37 °C por 5 min.
   4. Observe um microscópio leve para garantir que as células tenham se dissociado no frasco (4x ou 10x). Caso assim, amplie a incubação por mais 2-3 min.
   5. Uma vez que as células tenham se destacado e dissociado, adicione 10 mL de meio de cultura 3D para neutralizar a tripsina/EDTA e a pipeta para cima e para baixo várias vezes para dissociar ainda mais os CAFs.
   6. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e gire a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente.
   7. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota em um volume apropriado de meio de cultura 3D (ver Tabela de Materiais) e passe em dois novos frascos T75.

2. Células TUM622 emplacamento na matriz extracelular para cultura 3D

1. Um dia antes do experimento, descongele frascos da matriz da membrana do porão em uma geladeira de 4 °C durante a noite. Pipetas plásticas de recarga (2 mL) e pontas a -20 °C durante a noite.
   NOTA: Nem todos os lotes de matriz de membrana de porão têm a mesma capacidade de suportar o crescimento 3D de células TUM622. Portanto, é necessário adquirir e testar vários lotes de matriz de membrana de porão para identificar aqueles que suportam a formação robusta de acini. Normalmente, isso requer uma maior concentração proteica (16-18 mg/mL) na matriz.
2. No dia do experimento, meio de cultura 3D quente, tampão hepes, trypsin/EDTA e tampão de neutralização de tripsina (TNS) em um banho de água de 37 °C. Imediatamente antes de montar a cultura, retire a matriz de membrana do porão descongelado da geladeira e coloque o frasco no gelo.
3. Remanereça as placas de cultura de tecido em um refrigerador de plataforma de metal colocado no gelo. Coloque tubos de centrífuga em um rack de resfriamento metálico no gelo.
4. Utilizando células TUM622 obtidas a partir da etapa 1.1.7, calcule o número desejado de células necessárias para o revestimento. Normalmente, 15.000-30.000 células são necessárias por poço de uma placa de 24 poços. A densidade mais baixa é mais adequada para imagens e quantificação, enquanto a maior densidade é preferível ao coletar células para extração de RNA ou manchas ocidentais.
5. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga resfriado (cada tubo contendo células para revestimento triplicado) e gire para baixo a 300 x g em uma centrífuga de balde suspensa a 4 °C por 5 min.
6. Apirate o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta aspirante presa a uma ponta não filtrada (20 μL), deixando aproximadamente 100 μL do meio no tubo (use marcas no tubo como guia).
7. Toque suavemente na lateral do tubo para desalojar e dissociar a pelota antes de devolvê-la ao rack de refrigeração.
8. Usando as pipetas pré-resfriadas de 2 mL, misture suavemente a matriz, pipetando para cima e para baixo algumas vezes, mantendo o frasco em contato com o gelo. Pipeta a uma velocidade uniforme e moderada para que nenhuma bolha seja introduzida na matriz durante este procedimento.
9. Transfira o volume apropriado da matriz para cada tubo de centrífuga. Para emplacar triplicados em uma placa de 24 poços, adicione 1,1 mL de matriz de membrana de porão a cada tubo.
10. Usando pontas pré-resfriadas, pipeta a matriz em cada tubo para cima e para baixo cerca de 10 vezes para fazer uma suspensão celular uniforme.
11. Transfira 310 μL de suspensão celular/matriz em cada poço de uma placa pré-resfriada de 24 poços. A pipeta é colocada em um ângulo de 90° para a superfície da placa e a suspensão adicionada ao centro do poço. A suspensão deve se espalhar e cobrir todo o poço sem precisar inclinar a placa.
12. Para facilitar a análise de imunofluorescência a jusante, emplaca a suspensão celular/matriz em paralelo em lâminas de câmara de 2 poços. Transferir 100 μL de suspensão celular/matriz para o centro de um poço de 2 poços de lâmina de câmara (ver Tabela de Materiais). Isso permite que a matriz forme uma estrutura semelhante a uma cúpula com volume muito menor.
13. Devolva a placa e a câmara deslize de volta para uma incubadora de cultura de tecidos e incubapor por 30 min para permitir que a matriz se solidifique. Examine a placa/slide um microscópio leve para garantir que as células únicas sejam distribuídas uniformemente dentro da matriz (4x ou 10x).
14. Adicione 1 mL de cultura 3D pré-aquecida em cada poço e 1,5 mL de meio de cultura 3D para cada poço do slide da câmara e depois devolva-os à incubadora.

3. Coculturing 3D de células tum622 e CAFs na matriz extracelular

1. Preparar suspensões celulares de TUM622 e CAFs de acordo com a seção 2.
2. Conte a densidade celular CAF tomando 10 μL de suspensão celular e misturando-a com 10 μL de azul trypan.
3. Adicione 10 μL da mistura a cada uma das duas câmaras em um hemaciatometro para contar e calcular a densidade celular.
   NOTA: Os CAFs têm formas irregulares e podem não ser contados com precisão em um contador automático de células.
4. Co-incorporando células TUM622 e CAFs na matriz de membrana do porão
   1. Com base nas informações de densidade celular, calcule o número desejado de células utilizadas para chapeamento. Os CAFs são semeados a uma proporção de 2:1 de células TUM622. Por exemplo, para 30.000 células TUM622 semeadas, 60.000 CAFs são co-incorporados.
   2. Transfira o volume apropriado de TUM622, bem como a suspensão celular dos CAFs para o mesmo tubo de centrífuga e siga as etapas 2.5-2.11 para emplacamento em placas de 24 poços. Para imunofluorescência, transfira 60 μL de mistura tum622/CAFs para lâminas de câmara conforme descrito na etapa 2.12).
5. Coculturing TUM622 com CAFs sobrepostos na matriz da membrana do porão (ver Tabela de Materiais)
   1. Configure a monocultura TUM622 de acordo com as etapas 2.5-2.13.
   2. Transfira o dobro do número de CAFs de suspensão (em comparação com o número de células TUM622 semeadas) em um tubo de centrífuga e gire para baixo a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   3. Apiratee o sobrenadante e resuspenda os CAFs em 1 mL de meio de cultura 3D.
   4. Transfira a suspensão de 1 mL de CAFs para o poço que contém as células TUM622 incorporadas.

4. Colheita de Acini TUM622 para Extração de RNA/Proteína e Triagem Celular Ativada por Fluorescência (FACS)

1. Prepare o tampão de lavagem e o tampão de colheita celular de acordo com o protocolo do kit de colheita de células 3D no dia anterior e esfrie durante a noite a 4 °C.
2. Mantenha as placas em um refrigerador de placas e outros reagentes no gelo antes de iniciar o processo de extração.
3. Aspirar mídia de poços de cultura 3D sem tocar na matriz e lavar suavemente o poço 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem.
4. Apiratee a lavagem final e adicione 1 mL de tampão de colheita de células a cada poço.
5. Use uma ponta p1000 pipeta para raspar a matriz de cada poço.
6. Pipeta para cima e para baixo para dissociar ainda mais a matriz.
7. Transfira 1 mL da mistura para um tubo cônico pré-refrigerado de 15 mL. Adicione mais 1 mL de tampão de colheita ao mesmo poço.
8. Repita as etapas 4.5-4.7 e transfira toda a mistura do mesmo poço em um tubo cônico de 15 mL.
9. Tampe os tubos e arochar a 4 °C por 30 min.
10. Encha cada tubo com PBS gelado até 10 mL e, em seguida, centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C.
11. Apire o supernadante sem tocar na pelota. O sobrenadante deve conter fragmentos de matriz, mas os esferóides devem ser todos coletados na parte inferior do tubo.
12. Adicione PBS gelado para uma segunda lavagem. Inverta o tubo algumas vezes para dissociar a pelota. Gire a 300 x g por 5 min.
13. Durante a fiação, prepare o tampão de lyse para a coleta de proteínas e RNA.
14. Apiratee cuidadosamente o sobrenadante e adicione tampão de lyse para processamento a jusante para coletar proteína ou RNA. Alternativamente, as células podem ser resuspensas para análise de fluxo/triagem FACS ou passagem em série.

5. Imunofluorescência de TUM622 Acini

1. Prepare o tampão de imunofluorescência (tampão IF: PBS com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,2% Triton X-100 e 0,05% Tween-20), tampão de bloqueio primário (tampão IF com soro de cabra 10% ), tampão de bloqueio secundário (tampão de bloqueio primário com 20 μg/mL cabra anti-mouse F(ab')₂)
2. Aspire meio a partir de lâminas de câmara de 2 poços, enxágue uma vez com PBS e coloque o slide no refrigerador de placa de metal no gelo. O slide da câmara deve permanecer no refrigerador da placa metálica para o restante do protocolo.
3. Adicione PFA pré-refrigerado de 4% para fixar o acini e incubar no gelo por 20 min.
4. Remova 4% de PFA e lave três vezes com 2 mL de PBS pré-refrigerado cada um por 5 min com balanço suave em um roqueiro.
5. Aspirar PBS e permeabilizar com 1,5 mL de 0,5% Triton X-100 em PBS (pré-refrigerado) por 20 min. Ao final deste procedimento, a estrutura em forma de cúpula se soltará.
6. Atribua suavemente o tampão de permeabilização do slide da câmara para evitar a perda da amostra. Isso é conseguido adicionando uma ponta fina (20 μL) à pipeta aspiradora e pressionando a ponta em direção ao canto da câmara.
7. Lave três vezes com 2 mL de PBS pré-refrigerado cada um por 5 min com balanço suave em um roqueiro.
8. Bloqueie a amostra com o tampão de bloqueio primário no gelo por 1 h.
9. Remova o buffer de bloqueio primário e adicione o buffer de bloqueio secundário e bloqueie por 30 min.
10. Adicione anticorpos primários no tampão de bloqueio primário e incubadurante durante a noite a 4 °C.
    NOTA: A concentração dos anticorpos aqui utilizados deve ser maior do que o normalmente utilizado para células de coloração na cultura 2D. A maioria dos anticorpos primários utilizados neste estudo são diluídos à diluição de 1:100 (ver Tabela de Materiais).
11. Remova os anticorpos primários e lave a amostra 3 vezes com 2 mL de tampão IF frio.
    NOTA: As amostras podem estar soltas, tome cuidado extra ao aspirar.
12. Incubar as amostras em anticorpos secundários diluídos em tampão de bloqueio primário por 1h no RT. Os anticorpos secundários preferidos devem ser altamente interligados para reduzir a coloração do fundo. A maioria dos anticorpos secundários utilizados neste estudo são diluídos à diluição de 1:200.
13. Remova os anticorpos secundários e lave a amostra 3 vezes com 2 mL de tampão IF frio.
    NOTA: As amostras podem estar soltas, tome cuidado extra ao aspirar.
14. Adicione PBS com DAPI (1:1.000 de diluição) durante a última lavagem para colorir o núcleo. A realização de mais 2 lava-se na PBS.
15. Imagem as amostras em um microscópio confocal dentro de 3 dias.
    NOTA: Devido ao tamanho dos organóides e limites na distância de trabalho do objetivo, as amostras são geralmente imagens em ampliação de 10x ou 20x.

6. Preparar amostras de cultura 3D para imunohistoquímica

1. Aspirar meio a partir de slides de câmara de 2 poços e enxágüe uma vez com PBS.
2. Fixar culturas 3D em 4% pfa a 37 °C durante a noite.
3. Remova 4% de PFA, certe culturas com 2,5 mL de gel de amostra de histologia (ver Tabela de Materiais) e coloque o slide a 4 °C para solidificar por pelo menos 1 h.
4. Transferir amostras cercadas com gel de amostra histológica para de tecido e processadas em um processador de amostra de tecido automatizado durante a noite.
5. Incorporar amostras em cera de parafina e preparar para a secção¹².

7. Ensaio de citotoxicidade 3D para triagem composta (exemplo para uma placa de 96 poços)

1. Coloque uma placa de 96 poços em um refrigerador de placa, um reservatório de 25 mL em um refrigerador de reservatório e um tubo cônico de 15 mL no gelo antes de iniciar o experimento.
2. Prepare as suspensões da matriz celular das células TUM622 em um tubo cônico de polipropileno pré-refrigerado de 15 mL adicionando o volume apropriado da matriz de membrana do porão às células. A densidade desejada para células TUM622 é de 10.000 células por 70-75 μL de matriz de membrana de porão. Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para permitir até mesmo a mistura de células dentro da matriz.
3. Mova a placa com refrigerador de placa e reservatório com um refrigerador de reservatório longe do gelo para uma superfície seca para evitar o contato da matriz de membrana do porão com gelo durante a transferência.
4. Transfira a mistura celular matriz para o reservatório de resfriamento sem criar bolhas.
5. Utilizando uma pipeta multicanal mecânica (10-300 μL), transfira 70-75 μL das células de mistura para cada poço apropriado de uma placa de 96 poços.
6. Incubar placa a 37 °C e 5% CO₂ por 30 min para solidificar a matriz da membrana do porão.
7. Adicione 100 μL de mídia em todas as linhas e devolva a placa à incubadora.
8. Comece a dosagem composta no dia seguinte ou mais tarde, dependendo do objetivo do experimento.
9. Os esferóides podem ser realimentados e re-dosados a cada 2-3 dias por até 10 dias, removendo a mídia gasta com um coletor de vácuo de 8 ou 12 poços e substituindo por mídia fresca com ou sem compostos desejados.
10. O número de esferóides TUM622 poderia ser quantificado usando imagens 3D de acordo com o protocolo do fabricante.

Resultados

TUM622 e CAFs na cultura 2D
A Figura 1 apresenta a morfologia típica de células TUM622 e CAFs na cultura 2D. As células TUM622 são arredondadas com núcleos grandes, enquanto os CAFs são planos e alongados. As células TUM622 podem atingir 80%-90% de confluência na cultura. A proliferação leva a mais, mas células menores agregadas em colônias que não entram em contato direto. Em contraste, os CAFs preferem crescer em maior densidade celular ...

Discussão

Os tumores são tecidos heterogêneos compostos por células cancerígenas coexistindo lado a lado com células estrômicas, como fibroblastos associados ao câncer, células endoteliais e células imunes dentro do ECM. Juntos, esses diversos componentes conversam e influenciam o microambiente tumoral, desempenhando um papel ativo na condução da tumorigênese, processo que envolve mudanças progressivas na arquitetura tumoral. Idealmente, um modelo in vitro de desenvolvimento tumoral deve ser capaz de capturar as mudanças arquitetô...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de crescimento epitelial brônquico	Lonza	CC-3170	BEGM
Cell Strainer 40um	ThermoFisher	352340	Para passar células TUM622
Clivado Caspase 3 anticorpo	Tecnologia de sinalização celular	9661 (RRID: AB_2341188)	Coelho
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	para cultura 3D
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	Para cultura 3D
Cultrex Kit de colheita de células 3D	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (preferido para co-cultura)	Bio-Techne	3443-005-01	Para cultura 3D
anticorpo CXCR4	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Anticorpo
E-caderina	de coelho BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Mouse
GelCount	Oxford Optronix		Para contagens e medições de Acini
anticorpo GM130	BD Biosciences	610822 (RRID: AB_398141)	Laboratório
de vetor de	soro de cabra	S1000 (RRID: AB_2336615)	Para imunofluorescência
FBS inativado por calor	Gibco	10082-147	Para CAFs
Gel de amostra de histologia	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	para imunofluorescência
Integrin alfa 6 anticorpo	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID: AB_2128317)	Rat
Involucrin anticorpo	Abcam	Ab68 (RRID: AB_305656)	Mouse
Ki67 anticorpo	Abcam	Ab15580 (RRID: AB_443209)	Rabbit
Lab-Tec II com câmara # 1.5 Sistema alemão de lamulínula	Nalge Nunc International	155379 (2)	Para cultura 3D
Lab-Tec II com câmara # 1.5 Sistema de Cobertura de Vidro Alemão	Nalge Nunc International	155409 (8)	Para cultura 3D
L-Glutamina	Gibco	25030-081	Para CAFs
Matrigel (preferido para monocultura)	Corning	356231	Para cultura 3D
anticorpo p63	Tecnologia de Sinalização Celular	13109 (SRRID: AB_2637091)
Caneta / Strep	de CoelhoGibco	15140-122	para reagentes de subcultura CAFs
ReagentPack	Lonza	CC-5034	para dissociação celular TUM622
RPMI	ThermoFisher	11875-093	para CAFs
de sinalização celular	de anticorpo Sox2	3579 (RRID: AB_2195767)	Rabbit
TrypLE Express	Gibco	12604-021	para dissociação CAF
Vi-Cell	Bechman Coulter		Contador automático de células
Anticorpo Vimentina	Abcam	Ab92547 (RRID: AB_10562134)	Coelho
β -catenina	anticorpo Tecnologia de sinalização celular	2677s (RRID: AB_1030943)	Mouse