Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

Piyan Zhang; Irina  V. Kovtun

doi:10.3791/60646

Artigo de método

Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

DOI:

10.3791/60646

⸱

25 de julho de 2020

Piyan Zhang¹ , Irina V. Kovtun¹^,²

¹Center for Individualized Medicine, Mayo Clinic, ²Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic

Neste artigo

Resumo

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Aqui apresentamos um protocolo para testar a eficácia de terapias-alvo selecionadas com base na composição genômica de um tumor. O protocolo descreve a identificação e validação de rearranjos estruturais de DNA, o enxerto dos tumores dos pacientes em camundongos e as respostas de teste a medicamentos correspondentes.

Resumo

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Apresentamos aqui uma abordagem integrativa para testar a eficácia de terapias-alvo que combina a próxima geração de sequenciamento technolo-gies, análises de alvos terapêuticos e monitoramento de resposta a medicamentos usando xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Essa estratégia foi validada usando tumores ovarianos como exemplo. O protocolo de sequenciamento de próxima geração (MPseq) foi utilizado para identificar alterações estruturais e seguido pela análise de alterações potencialmente direcionadas. Tumores humanos cultivados em camundongos imunocomprometidos foram tratados com drogas selecionadas com base nas análises genômicas. Os resultados demonstraram uma boa correlação entre as respostas previstas e as observadas no modelo PDX. A abordagem apresentada pode ser utilizada para testar a eficácia de tratamentos combinados e auxiliar o tratamento personalizado para pacientes com câncer recorrente, especificamente nos casos em que a terapia padrão falha e há a necessidade de usar medicamentos fora do rótulo.

Introdução

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Os xenoenxertos derivados do paciente (PDXs), gerados a partir da implantação de pedaços de tumores de pacientes em camundongos imunodeficientes, emergiram como um poderoso modelo pré-clínico para ajudar o cuidado anticâncológico personalizado. Modelos PDX foram desenvolvidos com sucesso para uma variedade de malignidades humanas. Estes incluem câncer de mama e ovário, melanoma maligno, câncer colorretal, adenocarcinoma pancreático e câncer de pulmão de células não pequenas^1,^,²^,^3,^,⁴^,⁵. O tecido tumoral pode....

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Protocolo

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Tecidos frescos de pacientes com câncer de ovário foram coletados no momento da cirurgia de debulking de acordo com um protocolo aprovado pelo Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Todos os procedimentos e tratamentos animais utilizados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais da Clínica Mayo (IACUC) e seguiram as orientações de cuidados com animais.

1. Sequenciamento e análises do par mate

NOTA: O tecido congelado fresco ou flash deve ser usado para o sequenciamento do par de mate (MPseq). O material incorporado à parafina não é adequado porque contém DNA fragme....

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Resultados

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Tecidos de tumores ovarianos ressecados no momento das cirurgias de debulking foram coletados de acordo com a orientação do IRB e utilizados para 1) caracterização genômica e 2) enenerxerto em camundongos imunocomprometidos(Figura 1). O protocolo de sequenciamento de pares de mate³⁶^,³⁷ foi usado para identificar alterações estruturais no DNA, incluindo perdas, ganhos e amplificações. Uma trama representativa do genoma ilustrando uma .......

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Discussão

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Descrevemos a abordagem e os protocolos que usamos para realizar um "ensaio clínico" em modelos PDX que se aproveita das características moleculares do tumor obtidas pelo perfil genômico para determinar a melhor escolha de medicamentos para testes. Várias plataformas de sequenciamento são atualmente usadas para caracterização genômica de tumores primários, incluindo sequenciamento de genoma inteiro, RNAseq e painéis genéticos personalizados. Para carcinoma ovariano de alto grau, mPseq para identificar alterações estrutur.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

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Agradecemos aos membros do Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang e Faye R. Harris, MS, pela ajuda na realização de experimentos. Este trabalho foi apoiado pelo Presente do Sr. e Sra. Neil E. Eckles para o Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo
3M Vetbond	3M, Co.	Anticorpo anti-AKT 1469SB
	Cell Signaling Technologies, Inc.	9272
Anticorpo anti-GAPDH (G-9)	Santa Cruz Biotech. Inc.	sc-365062
Anticorpo Anti-MAPK	Cell Signaling Technologies, Inc.	9926
Anti-fosfo-AKT anticorpo	Cell Signaling Technologies, Inc.	9271
Anti-mTOR anticorpo	Cell Signaling Technologies, Inc.	2972
Anti-Phospho-mTOR anticorpo	Cell Signaling Technologies, Inc.	2971
Anti-Phospho-S6 anticorpo	Cell Signaling Technologies, Inc.	4858
Anti-Rictor anticorpo	Cell Signaling Technologies, Inc.	2114
Anticorpo Anti-S6	Cell Signaling Technologies, Inc.	2217
Captisol	ChemScene, Inc.	cs-0731
Carboplatina	NOVAPLUS, Inc.	61703-360-18
DMEM	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Easy-A Hi-Fi PCR Clonagem Enzima	Agilent, Inc.	600404-51
Lubrificante	Cardinal Healthcare	82-280
Matrigel	Corning, Inc.
mídia de McCoy	Mediatech, Inc.	10-050-CV
MK-2206	ApexBio, Inc.	A3010
MK-8669	ARIAD Pharmaceuticals, Inc.
Nair Pele Sensível	Igreja & Fornecedor:Dwight Co.	Removedor de Pêlos Nair Chuveiro Sensível à Energia Ratos
NOD/SCID	Charles River, Inc.	aceno. CB17-Prkdcscid/NCrCrl
Paclitaxel	NOVAPLUS, Inc.	55390-304-05
PEG400	Millipore Sigma, Inc.	88440-250ML-F
Perjeta	Genetech, Co.	Pertuzumab
Rituximab	Genetech, Co.	Rituxan RPMI1640
	Mediatech, Inc.	Camundongos SCID 10-040-CV
	Harlan Laboratories, Inc.	C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg
SLAx 13-6MHz transdutor linear	FUJIFILM SonoSite, Inc	HFL38xp
SonoSite S-series Máquina de ultrassom	FUJIFILM SonoSite, Inc	SonoSite SII
Tween 80	Millipore Sigma, Inc.	Pág. 4780-100ML

356234AP23573

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived ....

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Sequenciamento de Nova Gera o An lise de Altera o Gen mica Monitoramento da Resposta a F rmacos Camundongos Imunocomprometidos Enxerto de Tecido Tumoral An lise por Immunoblotting An lise de Enriquecimento de Vias

Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

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