Utilização da membrana chorioallantoico de frango em modelo vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos

Resumo

Apresentamos o modelo de membrana chorioallantoico de frango como uma alternativa, transplantável, no modelo vivo para o enenxerto de linhas de células cancerígenas ginecológicas e urológicas e tumores derivados do paciente.

Resumo

Os modelos mouse são os testes de referência para estudos de câncer vivo. No entanto, o custo, o tempo e as considerações éticas levaram a pedidos de alternativas nos modelos de câncer vivo. O modelo de membrana chorioallantoico de frango (CAM) fornece uma alternativa barata e rápida que permite a visualização direta do desenvolvimento do tumor e é adequada para a imagem in vivo. Como tal, buscamos desenvolver um protocolo otimizado para enenxerto de tumores ginecológicos e urológicos nesse modelo, que apresentamos aqui. Aproximadamente 7 dias após a fertilização, a célula do ar é movida para o lado vascularizado do óvulo, onde uma abertura é criada na concha. Tumores de murina e linhas celulares humanas e tecidos primários podem então ser ertados. Estes são tipicamente semeados em uma mistura de matriz extracelular e meio para evitar dispersão celular e fornecer suporte de nutrientes até que as células recrutem um suprimento vascular. Os tumores podem crescer por até 14 dias adicionais antes da eclosão dos ovos. Ao implantar células stably transinduzidas com luciferase firefly, a imagem de bioluminescência pode ser usada para a detecção sensível do crescimento tumoral na membrana e células cancerígenas espalhadas pelo embrião. Esse modelo pode potencialmente ser usado para estudar tumorigenicidade, invasão, metástase e eficácia terapêutica. O modelo CAM de frango requer significativamente menos tempo e recursos financeiros em comparação com os modelos tradicionais de murina. Como os ovos são imunocomprometidos e tolerantes imunes, tecidos de qualquer organismo podem potencialmente ser implantados sem animais transgênicos caros (por exemplo, camundongos) necessários para implantação de tecidos humanos. No entanto, muitas das vantagens deste modelo poderiam potencialmente também ser limitações, incluindo o curto tempo de geração de tumores e o status imunocomprometido/imunocomprometido/tolerante imune. Além disso, embora todos os tipos de tumores apresentados aqui enerram no modelo de membrana chorioallantoico de frango, eles o fazem com diferentes graus de crescimento tumoral.

Introdução

Os camundongos serviram como o organismo modelo clássico para o estudo de doenças humanas, incluindo a malignidade. Como mamíferos, eles compartilham muitas semelhanças com os humanos. Seu alto grau de similaridade genética permitiu que a manipulação transgênica do genoma do camundongo fornecesse uma enorme visão sobre o controle genético das doenças humanas¹. A vasta experiência no manuseio e experimentação com camundongos resultou em seu ser o modelo de escolha para pesquisa biomédica. No entanto, além das preocupações éticas e científicas em relação aos modelos de murina, eles também podem ser bastante caros e demorados^2,3. O desenvolvimento de tumores pode levar semanas ou até meses. A moradia em uma instituição típica sozinha pode funcionar entre centenas e milhares de dólares enquanto os tumores estão se desenvolvendo. O câncer de ovário é um exemplo dessa desvantagem porque seu crescimento em modelos de urina pode facilmente levar meses. Atrasos no progresso da pesquisa potencialmente afetam a persistente baixa taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de ovário de apenas 47% (ou seja, um aumento na sobrevida de apenas 10% ao longo de 30 anos)⁴. Da mesma forma, os cânceres urológicos (cânceres de rim, próstata e bexiga) constituem 19% de todos os casos de câncer nos Estados Unidos e 11% das mortes relacionadas ao câncer⁴. Assim, uma nova abordagem in vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos poderia economizar um tempo, trabalho e dinheiro consideráveis, mesmo que esse modelo seja aplicado apenas a experimentos iniciais de triagem. Além disso, a aceleração resultante dos achados da pesquisa poderia impactar significativamente os 177.000 indivíduos diagnosticados com esses cânceres anualmente.

O modelo CAM de frango oferece muitas vantagens que abordam as questões acima mencionadas. Um modelo popular para estudar angiogênese^5,6, invasão celular tumoral^7,8, e metástase^7,9, o modelo de cam de embrião filhote já foi usado para estudar muitas formas de câncer, incluindo glioma^10,11,12, carcinoma celular cabeça e pescoço^13,14, leucemia^15,16, câncer pancreático¹⁷, e câncer colorretal¹⁸. Além disso, os modelos CAM foram gerados para neuroblastoma^19,linfoma burkitt^20,melanoma²¹e fibrosarcoma felina²². Estudos anteriores também apresentaram enenxerto de câncer de bexiga²³ e linhas de células cancerígenas de próstata^24,mas com detalhes limitados do protocolo. Não só os ovos são muito mais baratos que os ratos, mas também produzem resultados altamente reprodutíveis^25,26. Eles mostram o desenvolvimento rápido da vasculatura, e o enenxerto tumoral pode ocorrer tão rapidamente quanto alguns dias e ser visualizado longitudinalmente pela janela aberta. Com o período de 21 dias entre fertilização de óvulos e eclosão, os experimentos podem ser concluídos dentro de algumas semanas. Além disso, as necessidades de moradia limitadas de baixo custo, e o pequeno tamanho prontamente permitem experimentos em larga escala que seriam proibitivos para estudos de camundongos.

Por isso, buscamos otimizar o modelo CAM para o enenxerto de cânceres ginecológicos e urológicos. Devido ao estado imunocomprometido do embrião de frango²⁷precoce, tanto o rato quanto as células humanas podem ser prontamente implantados. Como tal, temos conseguido enenxertor cânceres de ovário, rim, próstata e bexiga. Para cada um desses tipos de tumores, o CAM prontamente aceita linhas estabelecidas de murina e/ou células tumorais humanas. É importante ressaltar que os tecidos tumorais humanos primários recém-colhidos também podem enertar células digeridas ou pedaços de tecido sólido com altas taxas de sucesso. Cada um desses tipos de câncer e fontes celulares requer otimização, que compartilhamos aqui.

Protocolo

Todos os experimentos aqui apresentados foram revisados e aprovados pelos comitês éticos apropriados da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). O uso de tumores humanos primários identificados foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UCLA (protocolos 17-000037, 17-001169 e 11-001363). Na UCLA, a revisão do Comitê de Pesquisa Animal não é necessária para experimentos usando embriões de frango; aprovação do protocolo só é necessária quando os ovos serão eclodidos. No entanto, as melhores práticas, como as Diretrizes avma para a eutanásia dos animais, foram usadas para lidar com embriões de frango de forma ética e para evitar dor o máximo possível. Os pesquisadores são instados a verificar os requisitos de supervisão em sua instituição antes de iniciar estudos usando modelos CAM.

1. Preparando os ovos

1. Antes de receber os ovos, monte e equilibre a incubadora de ovos a 37,8 °C (100 °F) com 60-70% de umidade seguindo as instruções do fabricante.
   NOTA: Para minimizar os riscos de contaminação, a água autocelava pode ser usada para controlar a umidade.
2. Ao receber ovos de frango fertilizados, ovos de frango Vermelho de Rhode Island de um fornecedor de ovos de grau de laboratório certificado, enxugam a superfície das conchas com toalhas de papel. Uma toalha de papel levemente amorcada pode ser usada para remover o material aderido. Seque imediatamente.
   NOTA: O maçagem da casca com líquido abaixo de 43,3 °C pode introduzir bactérias no ovo. Se optar por lavar ou desinfetar os ovos, a temperatura do líquido deve ficar entre 43,3-48,9 °C. Temperaturas mais altas podem ferver os ovos. A escolha do desinfetante deve ser feita com base nos microrganismos que causam preocupação.
3. Use um lápis ou marcador para rotular a data no ovo. Este é considerado o dia 0 de desenvolvimento.
4. Coloque os ovos na incubadora de ovos e incuba por pelo menos 7 dias com rotação para permitir o desenvolvimento de CAM. Um rotador automático pode ser usado, ou os ovos podem ser girados 180° 2-3x por dia.

2. Abrindo os ovos

NOTA: A abertura dos ovos deve ser feita quando o CAM tiver se desenvolvido totalmente. Isso é tipicamente no dia 7 ou 8 do desenvolvimento.

1. Desinfete um armário de biossegurança com 70% de etanol. Da mesma forma desinfetante e coloque no armário de biossegurança um rack de ovos, vela de ovo, marcador, ferramenta rotativa sem fio com uma pedra de moagem de carboneto de silício e roda de corte circular, agulha de 18 G, controlador de tubulação com tubos de 45 cm, fita de embalagem, escritório tesouras, tesouras curvas, fórceps Semken (ou similares), bolas de algodão e 6 x 7 cm de vestido de filme transparente. Sempre que possível, use ferramentas estéreis, descartáveis ou autocelavadas.
2. Desligue o rotador de ovos. Coloque aproximadamente 1-3 ovos no armário de biossegurança no rack de ovos. Enquanto estiver escuro, coloque o velador de ovos contra a casca de ovo para identificar a célula do ar. Marque a localização da célula aérea.
   NOTA: A intensidade da iluminação do candler de ovo é crucial para visualizar o interior do ovo. Se a célula de ar ou vasculatura for consistentemente difícil de ver, tente substituir as baterias de vela de ovo.
3. Mova o vela-de-ovo sobre a concha para encontrar uma grande rede de vasos sanguíneos. Gire o ovo se necessário. Uma vasculatura ideal será ramificar-se perto do meio do ovo. Use um marcador para desenhar sobre a vasculatura para ser usado para implantação.
4. Acenda a luz no capô. Usando uma ferramenta rotativa sem fio equipada com uma pedra de moagem de carboneto de silício, faça um pequeno buraco na concha diretamente sobre o centro da célula do ar. Perfurar até que a maior parte da casca tenha sido removida, mas a membrana interna branca está intacta.
   NOTA: Perfurar sobre a célula de ar antes de mirar a vasculatura permite determinar a espessura dessa casca de ovo particular sobre a célula do ar em vez de sobre a CAM e vasculatura. Se a CAM ou a vasculatura for interrompida, então o ovo não é utilizável para implantação.
5. Perfurar e abrir outro pequeno buraco onde a janela vascular será aberta como foi feito para a célula aérea (passo 2.4).
6. Usando uma agulha de 18 G, fure suavemente a membrana branca e interna sobre a célula do ar e vasculatura. Se não conseguir penetrar na casca, então perfurar um pouco mais. Certifique-se de que a membrana branca e interna (mas não a CAM) seja interrompida em toda a área perfurada. A remoção da peça de membrana não é necessária.
   NOTA: Se a CAM ou a vasculatura for interrompida durante esta etapa, descarte o ovo. O dano é evidente se há sangue ou albumina vazando de um buraco perfurado.
7. Desligue a luz do capô. Usando o candler de ovo, verifique se a célula de ar foi transferida da extremidade do ovo para a área sobre a vasculatura. Se necessário, coloque a tubulação de vácuo inserida em um controlador pipet ao redor do orifício sobre a célula de ar original e aplique suavemente a sucção em rajadas curtas para mover a célula do ar.
8. Use um marcador para delinear a nova localização da célula aérea aproximadamente 0,5 cm dentro do limite air-CAM. Affix um pedaço de fita adesiva logo acima da nova célula aérea. Se necessário, use a tesoura padrão do escritório para aparar a fita em um tamanho apropriado.
   NOTA: A fita pode interromper o fluxo de ar através da concha e não deve ser maior do que o necessário para cobrir totalmente a célula de ar.
9. Devolva os ovos à incubadora para aquecer sem rotação com a nova célula de ar virada para cima. Repita as etapas 2.2-2.9 para que os ovos restantes sejam abertos.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Se não tiver certeza da qualidade do desenvolvimento da CAM, um pequeno número de ovos deve prosseguir até a etapa 2.16 antes de abrir os ovos restantes.
10. Coloque aproximadamente 1-3 ovos com células de ar realocadas no rack de ovos no armário de biossegurança.
    NOTA: Deve-se tomar cuidado para evitar a introdução de contaminação no ovo aberto. Portanto, sempre abra ovos dentro de um armário de biossegurança, e use ferramentas e equipamentos estéreis sempre que possível.
11. Usando uma ferramenta rotativa sem fio equipada com uma roda de corte circular, corte uma pequena linha sobre o limite da célula de ar desenhada na etapa 2.8. Certifique-se de que isso seja aproximadamente 0,5 cm dentro do limite real de air-CAM para evitar interromper a CAM ou vasculatura. Corte completamente através da concha, mas tenha cuidado para não penetrar profundamente o suficiente para interromper a CAM ou vasculatura.
12. Usando uma tesoura curvada, corte em torno da célula de ar restante para criar uma janela na concha.
    NOTA: Se o sangue ou a membrana estiver presente na casca removida, então o ovo não é adequado para implantação. Se uma alta proporção dos ovos não for aberta de forma limpa, considere esperar pelo menos 1 dia adicional para abrir os ovos restantes para permitir uma melhor formação cam. Se as conchas dos ovos restantes não tiverem sido perfuradas, a rotação dos ovos dentro da incubadora deve ser retomada.
13. Verifique a viabilidade do embrião. Embriões viáveis exibirão vasculatura extensa, albumina clara, movimento de embriões ou batimentos cardíacos visíveis.
14. Usando fórceps Semken, puxe pequenos pedaços de algodão de uma bola de algodão estéril. Apagar suavemente a superfície da CAM para remover a poeira da concha e os detritos.
    NOTA: A remoção dos escombros deve ser realizada no mesmo dia em que os ovos são abertos.
15. Cubra a abertura da concha com um quarto de peça de 6 x 7 cm de filme transparente.
16. Devolva os ovos para a incubadora. Certifique-se de que o ovo se sente com a janela aberta virada para cima e a CAM não toque no vestido transparente do filme. Use um pedaço de rack de ovos, a borda do rotador de ovos ou outro item adequado para sustentar quaisquer ovos que continuem rolando.
17. Repita as etapas 2.10-2.16 para que todos os ovos restantes sejam abertos.
    NOTA: A abertura dos ovos não precisa ser concluída no mesmo dia da implantação. Esperar pelo menos 1 dia pode ajudar a eliminar ovos cuja viabilidade foi comprometida abrindo a concha.

3. Preparar a suspensão celular cancerosa para transplante (opção 1)

NOTA: Isso deve ser concluído pouco antes da implantação, que deve ocorrer idealmente entre os dias 7 e 10. Consulte notas no início da etapa 5 ou 6 para obter mais informações sobre a data de implantação. Essa abordagem foi usada para todas as linhas celulares e digerir tumores de câncer de rim cultivados.

1. Descongele a solução de matriz extracelular no gelo.
2. Usando digestão mecânica e/ou enzimática, obtenha uma suspensão de uma única célula usando um método apropriado para o tipo de célula que está sendo implantado.
3. Resuspender o número total de células a serem implantadas em um meio adequado para implantação. Implantes de 1-2 x 10⁶ células por ovo são típicos.
   NOTA: O meio utilizado para a implantação das linhas celulares é tipicamente o meio completo utilizado para o culturing as células, contendo FBS ou substituição de soro. A implantação de digerir tumores normalmente utiliza o meio completo usado para o culturing linhas celulares do mesmo tipo de câncer. No entanto, ajustes na formulação média podem ser feitos se necessário experimentalmente. Os efeitos sobre o desenvolvimento e o crescimento tumoral precisariam ser empiricamente determinados.
4. Pelotas as células usando uma velocidade centrífuga e tempo apropriados para as células que estão sendo usadas. As velocidades típicas são de 250-300 x g,e os tempos são de 5-10 min.
5. Remova o supernatant das células de pelotas canalizando. Resuspender mecanicamente as células no meio residual através de flicking ou pipetting. Coloque no gelo para esfriar. Meça o volume de células e médios usando um tubo de tamanho adequado.
6. Calcule os volumes de implantação de forma que 1-2 x 10⁶ células são implantadas em um volume de 20-100 μL por ovo com uma concentração final de matriz extracelular de proteína de 2,7-4 mg/mL. Adicione fatores de crescimento médios, quaisquer fatores ou aditivos de crescimento desejados e solução de matriz extracelular de acordo com este cálculo. Mantenha o gelo até estar pronto para implantar.
   NOTA: Para os cálculos nas etapas 3.3 e 3.6, deve ser incorporado um volume extra de pelo menos meio implante de óvulos para garantir um volume adequado para todos os ovos do grupo. Para implantação das linhas celulares cancerosas de ovário (ou seja, SKOV3 e ID8), foram implantadas 10⁶ células por ovo. Para implantação da linha de células renais do carcinoma RENCA, células cultivadas derivadas de carcinoma de células renais humanas primárias digeridas, linhas de células cancerígenas de próstata (ou seja, CWR, C4-2 e MyC-CaP) e linhas de células cancerígenas de bexiga (ou seja, HT-1376 e T24), 2 x 10⁶ células foram implantadas.

4. Preparar peças tumorais para implantação (opção 2)

NOTA: Isso deve ser concluído pouco antes da implantação, que deve ocorrer idealmente entre os dias 7 e 10. Consulte notas no início da etapa 5 ou 6 para obter mais informações sobre a data de implantação. Cânceres primários de ovário e bexiga foram implantados como pedaços de tumor.

1. Descongele a solução de matriz extracelular no gelo. Diluir a uma concentração de proteína final de 2,7-4 mg/mL em um meio apropriado contendo quaisquer fatores ou aditivos de crescimento desejados. Mantenha no gelo.
   NOTA: A implantação de peças tumorais normalmente utiliza o meio completo usado para o culturing linhas celulares do mesmo tipo de câncer. No entanto, ajustes na formulação média podem ser feitos se necessário experimentalmente. Os efeitos sobre o enenxerto tumoral e o crescimento precisariam ser empiricamente determinados.
2. Usando um bisturi ou tesoura, excisse pedaços do tumor fresco. Os tamanhos ideais variam de 2-5 mm em cada lado. Mantenha os tecidos imersos no meio até que estejam prontos para implantar.

5. Implantação usando um anel antiaderente (opção 1)

NOTA: As células podem ser implantadas a partir do dia 7 de desenvolvimento se o CAM for totalmente desenvolvido. A implantação pode ocorrer a qualquer momento antes da eclosão que permite tempo adequado para o desenvolvimento do tumor e o experimento desejado, mas note que as células imunes do embrião começam a estar presentes por volta do dia 10 após a pósfertilização²⁷. A taxa de crescimento do tumor varia consideravelmente pelo tipo celular e precisa ser empiricamente determinada para o tipo de interesse celular. O câncer de ovário e as células cancerígenas da próstata foram implantados usando o método do anel antiaderente. Observe que quando um anel antiaderente não estiver disponível, uma ponta pipet pode ser cortada para um tamanho semelhante e usada.

1. Use 70% de etanol para desinfetar um armário de biossegurança e todas as ferramentas necessárias: um rack de ovos, fórceps de íris curvas, anéis antiaderente (diâmetro interno de 1/4 polegada), haste de agitação de vidro, tubos de volume apropriados e pontas, 6 x 7 cm de molho de filme transparente, tesoura de escritório e marcador ou lápis. Sempre que possível, ferramentas estéreis, descartáveis ou autocelavadas devem ser usadas.
2. Coloque os ovos a serem implantados em um rack de ovos em um armário de biossegurança. Selecione um número gerenciável de ovos. Até seis é típico. Evite permitir que os ovos esfriem substancialmente enquanto trabalham com eles.
3. Remova o curativo transparente da concha, rolando as bordas em direção à janela aberta para evitar afastar pedaços de concha. Verifique se os ovos são viáveis e saudáveis. Os ovos ideais terão um grande navio no centro da área aberta com embarcações menores ramificando-se dele.
4. Usando fórceps de íris curvas, coloque um anel estéril e antiaderente na CAM sobre a embarcação, idealmente sobre um ponto de ramo. Use uma haste de vidro estéril para abrajo suavemente o CAM.
5. Pipet a suspensão celular da etapa 3.6 para o centro do anel antiaderente. Alternativamente, use fórceps para colocar uma peça tumoral da etapa 4.2 no centro do anel antiaderente e cubra com 20-50 μL da solução de matriz extracelular gerada na etapa 4.1.
6. Selar a abertura com um quarto de peça de 6 x 7 cm de filme transparente. Rotular os ovos com uma designação de implante apropriada.
   NOTA: Numerar os ovos dentro de um grupo facilita observações longitudinal.
7. Devolva o ovo para a incubadora. Certifique-se de que a abertura da concha fique ereta e que o ovo esteja seguro.
   NOTA: Os ovos podem ser devolvidos a uma incubadora de ovos sem rotação. Alternativamente, a viabilidade pós-implante pode ser obtida utilizando uma incubadora de células 37-38 °C com o CO₂ desativado e um hidrômetro para monitorar a umidade, que deve ser de 50%-80%.

6. Implantação sem anel antiaderente (opção 2)

NOTA: As células podem ser implantadas a partir do dia 7 de desenvolvimento se o CAM for totalmente desenvolvido. A implantação pode ocorrer a qualquer momento antes da eclosão que permite tempo adequado para o desenvolvimento do tumor e o experimento desejado, mas note que as células imunes do embrião começam a estar presentes por volta do dia 10 após a pósfertilização²⁷. Este método foi usado para implantar as células cancerígenas das células renais e as células cancerígenas da bexiga.

1. Use 70% de etanol para desinfetar um armário de biossegurança e todas as ferramentas necessárias: tubos e dicas de volume apropriados, pratos estéreis de cultura de tecido de 10 cm, rack de ovos, 6 x 7 cm de molho de filme transparente, tesoura de escritório e marcador.
2. Aspirar um volume de inoculação da suspensão celular gerada na etapa 3.6 em uma ponta de tubulação de tamanho apropriado (200 μL é típico). Enquanto segura a porção superior da ponta, ejete cuidadosamente a ponta da pipet e coloque horizontalmente em um prato estéril de cultura de tecido de 10 cm.
3. Repita o passo 6.2 para todas as amostras dentro de um grupo com um prato para cada grupo.
4. Coloque dicas em uma incubadora de 37 °C por 15-30 min para permitir que a matriz extracelular polimerize parcialmente.
5. Após 15 min de incubação, comece a verificar a polimerização. Uma pequena quantidade de líquido normalmente vaza da ponta quando colocado no prato. A polimerização desse líquido pode ser usada para estimar a extensão da polimerização do líquido dentro da ponta.
6. Coloque os ovos a serem implantados em um rack de ovos em um armário de biossegurança. Selecione um número gerenciável de ovos. Até seis é típico. Evite permitir que os ovos esfriem substancialmente enquanto trabalham com eles.
7. Remova o curativo transparente da concha rolando as bordas em direção à janela aberta. Isso evita afastar pedaços de concha.
8. Verifique se os ovos são viáveis e saudáveis. Os ovos ideais terão um grande navio no centro da área aberta com embarcações menores ramificando-se dele.
9. Coloque uma ponta de pipet em um pipet de tamanho apropriado. Deprimir o êmbolo para forçar a suspensão parcial de células polimerizadas na CAM sobre um vaso grande e bem desenvolvido, idealmente sobre um ponto de ramo.
10. Selar a abertura com um quarto de peça de 6 x 7 cm de filme transparente.
11. Rotular o ovo com uma designação de implante apropriada.
    NOTA: Numerar os ovos dentro de um grupo facilita observações longitudinal.
12. Devolva o ovo para a incubadora. Certifique-se de que a abertura da concha fique ereta e que o ovo esteja seguro.
    NOTA: Os ovos podem ser devolvidos a uma incubadora dedicada de ovos sem rotação. Alternativamente, a viabilidade pós-implante pode ser obtida utilizando uma incubadora de células 37-38 °C com o CO₂ desativado e um hidrômetro para monitorar a umidade, que deve ser de 50%-80%.

7. Imagens de bioluminescência da luciferase firefly marcaram tumores

NOTA: Se as células implantadas foram transinduzidas com a luciferase de codificação genética ou outros fatores de imagem, os tumores resultantes podem ser visualizados usando imagens de bioluminescência. A imagem de fluorescência não é recomendada em ovos intactos devido ao alto fundo da casca de ovo. Esta é a análise do ponto final, pois a abertura da concha reduz drasticamente a sobrevivência. Tumores podem ser imagens a qualquer momento que seja apropriada para necessidades experimentais e a velocidade do crescimento tumoral. No entanto, em média, os ovos eclodem 21 dias após a fertilização. Portanto, o dia 18 de desenvolvimento é um ponto final apropriado para evitar a eclosão indesejada.

1. Se necessário, transporte de ovos para a instalação de imagens. Fita ovos em pratos de cultura de tecido de 10 cm. Devolvê-los a uma incubadora de ovos de 37,8 °C com o mecanismo de rotação removido ou desativado. A umidade não é crucial para o transporte e a imagem.
2. Usando fórceps de íris curvas, empurre suavemente o CAM para longe da concha até que o CAM esteja alinhado com a albumina e embrião. Usando fórceps de espécimes de ponta larga, quebre pedaços da concha para expandir adequadamente a abertura da concha para visualização tumoral.
3. Injete um mínimo de 50 μL de 30 mg/mL D-luciferin a albumina de ovos. Um volume semelhante de D-luciferina também pode ser canalizado no anel antiaderente ou na superfície da CAM na área contendo as células implantadas. Isso garante a bioluminescência ideal na ausência de um suprimento vascular ideal. Incubar por 8 min.
4. Injete 20-50 μL de isoflurano na albumina do ovo para anestesiar o ovo. Incubar por mais 2 min. Alternativamente, o ovo pode ser colocado em uma câmara de indução contendo isoflurane vaporizada de 2-2,5%. Profundidade adequada de anestesia é obtida quando o movimento embrionário cessa.
   NOTA: Maiores volumes de isoflurano (100 μL) podem ser usados para eutanásia do ovo.
5. Coloque os ovos em um dispositivo de imagem de bioluminescência e imagem usando configurações apropriadas conforme determinado pelas instruções do fabricante. Para este estudo, foi utilizado um tempo de exposição de 1 min.
6. Para imaginar o restante cam e embrião, abra o ovo em um prato de cultura de tecido de 10 cm.
   1. Segure o ovo com os dedos de ambas as mãos na parte inferior do ovo perto do meio do ovo e os polegares de ambos os lados da abertura da concha.
   2. Retire delicadamente as duas metades do ovo com os polegares enquanto pressiona suavemente o ovo com os dedos.
   3. Quando a casca estiver aproximadamente meio separada do CAM e embrião, vire o ovo de cabeça para baixo sobre um prato de cultura de tecido de 10 cm.
   4. Continue separando as metades da concha. Se o CAM gruda no interior da concha, use suavemente os dedos para afastar o CAM da concha.
   5. O embrião pode ser transformado em outro prato, se desejar.
   6. Se necessário, isoflurano adicional pode ser administrado como na etapa 7.4.

8. Colheita de tumores

NOTA: Os tumores podem ser colhidos a qualquer momento que seja apropriado para as necessidades experimentais e a velocidade do crescimento do tumor. No entanto, em média, os ovos eclodem 21 dias após a fertilização. Portanto, o dia 18 de desenvolvimento é um ponto final apropriado para evitar a eclosão indesejada.

1. Compreenda o tumor com fórceps. Usando tesouras (tesoura de mola funciona bem) ou um bisturi, cuidadosamente excisse tumor de CAM.
2. Se o tumor foi transacionado com o gene da luciferase firefly, a reimagem pode ser realizada para verificar a remoção bem sucedida de tumores difíceis de visualizar.
   NOTA: Tumores excidados podem ser analisados por qualquer método apropriado para um experimento específico. Tumores também podem ser reimplantados em CAM ou camundongos. Para confirmar a identidade do tumor, os tumores podem ser fixos, parafina embutidas e examinados com hematoxilina e eosina ou coloração imunohistoquímica.

Resultados

Até agora, descobrimos que esse método de implantação foi bem sucedido para cânceres de ovário, rim, próstata e bexiga. Cada um foi otimizado para identificar condições específicas para implantação, embora possa haver flexibilidade. Dos tipos de tumores testados, o crescimento do câncer de ovário foi muito menos pronunciado e tipicamente não visível sem a ajuda da imagem de bioluminescência(Figura 1). No entanto, um endurecimento da CAM poderia ser sentido co...

Discussão

A expansão e o enenxerto tumoral usando o modelo CAM permite um crescimento tumoral mais rápido e diretamente observável do que o existente nos modelos animais vivos. Além disso, os custos são significativamente menores uma vez que a compra inicial de equipamentos é concluída, especialmente quando comparada com o custo de camundongos imunocomprometidos. O estado inicial, imunocomprometido de embriões de frango prontamente permite enenxerto de tecido humano e murina. Mesmo com esses pontos fortes, o modelo CAM tem limitaç...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
-010 Teflon (PTFE) Branco 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Anel antiaderente para semeadura de células. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Politetrafluoretileno (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Linha celular de câncer de próstata humano.
As células CWR22Rv1			CWR foram o gentil presente do Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Anticorpo de citoqueratina 8/18 (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0,02mg	Usado em uma diluição de 1:100 para análise imuno-histoquímica de tumores CAM de ovário humano.
D-Luciferina Firefly, sal de potássio	Goldbio	LUCK-1G
Tesoura de operação delicada; Curvo; Afiado-afiado; Comprimento da lâmina de 30 mm; 4-3/4 pol. Comprimento total	Roboz Surgical	RS6703	Este é fornecido como um exemplo. Qualquer tesoura curva semelhante também funcionaria.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Kit de ferramentas	Dremel	8050-N/18	Este kit contém todas as ferramentas necessárias.
Ovos de galinha fertilizados (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	Um fornecedor local de ovos precisaria ser identificado, pois esse fornecedor só entrega regionalmente.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Linha celular de câncer de bexiga humana.
Hovabator Genesis 1588 Kit Combo de Incubadora de Ovos Deluxe	Armazém de Incubadora	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Outras incubadoras de ovos podem ser usadas, mas sua confiabilidade precisaria ser verificada. Após a implantação, uma incubadora de células com o CO2 desativado também pode ser usada.
ID8			Não disponível comercialmente, consulte PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Outros candlers podem ser usados; no entanto, este é preferido entre aqueles que testamos. Este candler está incluído no kit de incubadora mencionado acima.
Fórceps de Íris, 10cm, Curvado, Serrilhado, Pontas de 0.8mm	Instrumento de Precisão Mundial	15915	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer fórceps curvo semelhante também funcionaria. Várias marcas foram usadas para este método.
Isoflurano	Clipper Distribuindo	0010250
Sistema de Imagem In Vivo IVIS Lumina II	de Membrana Perkin Elmer
Matrigel HC; Solução de	matriz extracelular	Corning	354248
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Linha celular de câncer de próstata murino.
Controlador de pipeta portátil Pipet-Aid XP	Drummond Scientific	4-000-101	Qualquer controlador de pipeta semelhante seria apropriado.
Agulhas hipodérmicas PrecisionGlide	BD	305196	Isso é fornecido como exemplo. Qualquer agulha 18G funcionaria de forma semelhante.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer fórceps semelhante ou outro estilo que se adapte à preferência do pesquisador seria apropriado.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Linha celular de câncer de ovário humano.
Pinça de amostra	Ciências de Microscopia Eletrônica	72914	Isso é fornecido como um exemplo. A pinça usada para afastar a concha para imagens de bioluminescência tem aproximadamente 12,8 cm de comprimento com pontas de 3 mm de largura.
Bolas de algodão estéreis	Fisherbrand	22-456-885	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer bola de algodão estéril seria suficiente.
Varetas de Agitação com Policial de Borracha; 5mm de diâmetro, 6 pol. de comprimento	United Scientific Supplies	GRPL06	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer haste de agitação de vidro semelhante também funcionaria.
celular de câncer de bexiga humana	T24	ATCC	HTB-4
Curativo Transparente Tegaderm Original Estilo de Moldura 2 3/8" x 2 3/4"	Placas de	21272
, 10 cm de diâmetro	Corning	353803	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer prato semelhante e estéril de 10 cm pode ser usado. O tratamento de cultura de tecidos não é necessário.
Tubulação de Laboratório Transparente Tygon - parede de 1/4 x 3/8 x 1/16 (50 pés)	Tygon	AACUN017	Isso é fornecido como exemplo. Qualquer tubulação de tamanho semelhante também funcionaria.