Utilização da membrana chorioallantoico de frango em modelo vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos

Resumo

Apresentamos o modelo de membrana chorioallantoico de frango como uma alternativa, transplantável, no modelo vivo para o enenxerto de linhas de células cancerígenas ginecológicas e urológicas e tumores derivados do paciente.

Resumo

Os modelos mouse são os testes de referência para estudos de câncer vivo. No entanto, o custo, o tempo e as considerações éticas levaram a pedidos de alternativas nos modelos de câncer vivo. O modelo de membrana chorioallantoico de frango (CAM) fornece uma alternativa barata e rápida que permite a visualização direta do desenvolvimento do tumor e é adequada para a imagem in vivo. Como tal, buscamos desenvolver um protocolo otimizado para enenxerto de tumores ginecológicos e urológicos nesse modelo, que apresentamos aqui. Aproximadamente 7 dias após a fertilização, a célula do ar é movida para o lado vascularizado do óvulo, onde uma abertura é criada na concha. Tumores de murina e linhas celulares humanas e tecidos primários podem então ser ertados. Estes são tipicamente semeados em uma mistura de matriz extracelular e meio para evitar dispersão celular e fornecer suporte de nutrientes até que as células recrutem um suprimento vascular. Os tumores podem crescer por até 14 dias adicionais antes da eclosão dos ovos. Ao implantar células stably transinduzidas com luciferase firefly, a imagem de bioluminescência pode ser usada para a detecção sensível do crescimento tumoral na membrana e células cancerígenas espalhadas pelo embrião. Esse modelo pode potencialmente ser usado para estudar tumorigenicidade, invasão, metástase e eficácia terapêutica. O modelo CAM de frango requer significativamente menos tempo e recursos financeiros em comparação com os modelos tradicionais de murina. Como os ovos são imunocomprometidos e tolerantes imunes, tecidos de qualquer organismo podem potencialmente ser implantados sem animais transgênicos caros (por exemplo, camundongos) necessários para implantação de tecidos humanos. No entanto, muitas das vantagens deste modelo poderiam potencialmente também ser limitações, incluindo o curto tempo de geração de tumores e o status imunocomprometido/imunocomprometido/tolerante imune. Além disso, embora todos os tipos de tumores apresentados aqui enerram no modelo de membrana chorioallantoico de frango, eles o fazem com diferentes graus de crescimento tumoral.

Introdução

Os camundongos serviram como o organismo modelo clássico para o estudo de doenças humanas, incluindo a malignidade. Como mamíferos, eles compartilham muitas semelhanças com os humanos. Seu alto grau de similaridade genética permitiu que a manipulação transgênica do genoma do camundongo fornecesse uma enorme visão sobre o controle genético das doenças humanas¹. A vasta experiência no manuseio e experimentação com camundongos resultou em seu ser o modelo de escolha para pesquisa biomédica. No entanto, além das preocupações éticas e científicas em relação aos modelos de murina, eles também podem ser bastante caros e demorados²

Protocolo

Todos os experimentos aqui apresentados foram revisados e aprovados pelos comitês éticos apropriados da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). O uso de tumores humanos primários identificados foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UCLA (protocolos 17-000037, 17-001169 e 11-001363). Na UCLA, a revisão do Comitê de Pesquisa Animal não é necessária para experimentos usando embriões de frango; aprovação do protocolo só é necessária quando os ovos serão eclodidos. No entanto, as melhores práticas, como as Diretrizes avma para a eutanásia dos animais, foram usadas para lidar com embriões de frango de forma ética e para evitar dor o máximo possível. ....

Resultados

Até agora, descobrimos que esse método de implantação foi bem sucedido para cânceres de ovário, rim, próstata e bexiga. Cada um foi otimizado para identificar condições específicas para implantação, embora possa haver flexibilidade. Dos tipos de tumores testados, o crescimento do câncer de ovário foi muito menos pronunciado e tipicamente não visível sem a ajuda da imagem de bioluminescência(Figura 1). No entanto, um endurecimento da CAM poderia ser sentido co.......

Discussão

A expansão e o enenxerto tumoral usando o modelo CAM permite um crescimento tumoral mais rápido e diretamente observável do que o existente nos modelos animais vivos. Além disso, os custos são significativamente menores uma vez que a compra inicial de equipamentos é concluída, especialmente quando comparada com o custo de camundongos imunocomprometidos. O estado inicial, imunocomprometido de embriões de frango prontamente permite enenxerto de tecido humano e murina. Mesmo com esses pontos fortes, o modelo CAM tem limitaç.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
-010 Teflon (PTFE) Branco 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Anel antiaderente para semeadura de células. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Politetrafluoretileno (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Linha celular de câncer de próstata humano.
As células CWR22Rv1			CWR foram o gentil presente do Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Anticorpo de citoqueratina 8/18 (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0,02mg	Usado em uma diluição de 1:100 para análise imuno-histoquímica de tumores CAM de ovário humano.
D-Luciferina Firefly, sal de potássio	Goldbio	LUCK-1G
Tesoura de operação delicada; Curvo; Afiado-afiado; Comprimento da lâmina de 30 mm; 4-3/4 pol. Comprimento total	Roboz Surgical	RS6703	Este é fornecido como um exemplo. Qualquer tesoura curva semelhante também funcionaria.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Kit de ferramentas	Dremel	8050-N/18	Este kit contém todas as ferramentas necessárias.
Ovos de galinha fertilizados (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	Um fornecedor local de ovos precisaria ser identificado, pois esse fornecedor só entrega regionalmente.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Linha celular de câncer de bexiga humana.
Hovabator Genesis 1588 Kit Combo de Incubadora de Ovos Deluxe	Armazém de Incubadora	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Outras incubadoras de ovos podem ser usadas, mas sua confiabilidade precisaria ser verificada. Após a implantação, uma incubadora de células com o CO2 desativado também pode ser usada.
ID8			Não disponível comercialmente, consulte PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Outros candlers podem ser usados; no entanto, este é preferido entre aqueles que testamos. Este candler está incluído no kit de incubadora mencionado acima.
Fórceps de Íris, 10cm, Curvado, Serrilhado, Pontas de 0.8mm	Instrumento de Precisão Mundial	15915	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer fórceps curvo semelhante também funcionaria. Várias marcas foram usadas para este método.
Isoflurano	Clipper Distribuindo	0010250
Sistema de Imagem In Vivo IVIS Lumina II	de Membrana Perkin Elmer
Matrigel HC; Solução de	matriz extracelular	Corning	354248
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Linha celular de câncer de próstata murino.
Controlador de pipeta portátil Pipet-Aid XP	Drummond Scientific	4-000-101	Qualquer controlador de pipeta semelhante seria apropriado.
Agulhas hipodérmicas PrecisionGlide	BD	305196	Isso é fornecido como exemplo. Qualquer agulha 18G funcionaria de forma semelhante.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer fórceps semelhante ou outro estilo que se adapte à preferência do pesquisador seria apropriado.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Linha celular de câncer de ovário humano.
Pinça de amostra	Ciências de Microscopia Eletrônica	72914	Isso é fornecido como um exemplo. A pinça usada para afastar a concha para imagens de bioluminescência tem aproximadamente 12,8 cm de comprimento com pontas de 3 mm de largura.
Bolas de algodão estéreis	Fisherbrand	22-456-885	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer bola de algodão estéril seria suficiente.
Varetas de Agitação com Policial de Borracha; 5mm de diâmetro, 6 pol. de comprimento	United Scientific Supplies	GRPL06	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer haste de agitação de vidro semelhante também funcionaria.
celular de câncer de bexiga humana	T24	ATCC	HTB-4
Curativo Transparente Tegaderm Original Estilo de Moldura 2 3/8" x 2 3/4"	Placas de	21272
, 10 cm de diâmetro	Corning	353803	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer prato semelhante e estéril de 10 cm pode ser usado. O tratamento de cultura de tecidos não é necessário.
Tubulação de Laboratório Transparente Tygon - parede de 1/4 x 3/8 x 1/16 (50 pés)	Tygon	AACUN017	Isso é fornecido como exemplo. Qualquer tubulação de tamanho semelhante também funcionaria.

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