Utilização da membrana chorioallantoico de frango em modelo vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos

O engrafamento de tumores na membrana corioallantóica do frango, ou CAM, pode ser usado para estudos de tumorigenicidade, eficácia do tratamento ou crosstalk celular. Este método permite um crescimento rápido e econômico do tumor em um ambiente in vivo imunotolerante. Usando o modelo CAM, novas abordagens terapêuticas podem ser rapidamente testadas usando linhas celulares ou até mesmo amostras de tumores do paciente.

Os aspectos mais cruciais deste protocolo são garantir a formação adequada do CAM e não interromper a CAM ou vasculatura durante a abertura dos ovos. No dia do desenvolvimento sete ou oito, quando a CAM se desenvolveu totalmente, desligue o rotador de ovos e coloque aproximadamente um a três ovos no rack de ovos no armário de biossegurança. Com as luzes apagadas, coloque um gemada contra a casca do ovo para identificar e marcar a localização da célula de ar de um ovo, em seguida, mova o gemada de ovo sobre a casca para encontrar uma grande rede de vasos sanguíneos, girando o ovo conforme necessário.

Uma vasculatura ideal se ramificará perto do meio do ovo. Use um marcador para rastrear a vasculatura a ser usada para implantação. Depois de voltar a acender a luz no capô, use uma ferramenta rotativa sem fio equipada com uma pedra de moagem de carboneto de silício para fazer um pequeno buraco na concha diretamente sobre o centro da célula de ar.

Quando a maior parte da concha tiver sido removida, mas com a membrana interna branca intacta, faça outro pequeno buraco onde a janela vascular será aberta como apenas demonstrado. Quando o segundo orifício estiver pronto, use uma agulha de calibre 18 para perfurar suavemente a membrana interna branca sobre a célula de ar e vasculatura tomando cuidado para que a membrana interna branca, mas não a CAM, seja interrompida em toda a área perfurada. Com a luz do capô desligada novamente, use o candler de ovo para verificar se a célula de ar foi transferida do final do ovo para a área sobre a vasculatura.

Se necessário, coloque tubos de vácuo inseridos em um controlador de pipeta ao redor do orifício sobre a célula de ar original e aplique suavemente sucção em rajadas curtas para mover a célula de ar. Marque o contorno da nova localização da célula de ar aproximadamente 0,5 centímetros dentro do limite do CAM de ar e fixe um pedaço de fita de embalagem apenas grande o suficiente para cobrir o buraco sobre a nova célula de ar. Depois de preparar os outros dois ovos como acabou de demonstrar, devolva os ovos à incubadora e abra quaisquer ovos adicionais para o experimento em grupos de um a três, como demonstrado.

Quando todos os ovos forem abertos, transfira de um a três ovos com células de ar realocadas para o rack de ovos em um armário de biossegurança e use uma ferramenta rotativa sem fio equipada com uma roda de corte circular para cortar uma pequena linha sobre o limite da célula de ar completamente através da célula sem interromper a CAM ou vasculatura. Usando uma tesoura curva, corte ao redor da célula de ar restante para criar uma janela na concha e verificar a viabilidade do embrião. Embriões viáveis exibirão uma vasculatura extensa, albumina clara, movimento de embriões e/ou batimentos cardíacos visíveis.

Em embriões não viáveis, a CAM pode parecer opaca com poucos, se houver, vasos presentes e os embriões podem ser pequenos ou ausentes sem movimento ou batimento cardíaco. Usando fórceps Semkin, puxe pequenos pedaços de algodão de uma bola de algodão estéril e limpe suavemente a superfície CAM dos embriões viáveis para remover qualquer pó de concha e detritos, em seguida, cubra a abertura da casca com um pedaço de seis por sete centímetros transparente de filme sem tocar na CAM e retornar os ovos para a incubadora com a janela aberta voltada para cima. Use um pedaço de rack de ovos, a borda do rotador de ovos ou outro item adequado para sustentar todos os ovos que continuam rolando.

Para preparar a suspensão celular cancerígena para transplante, colher as células da cultura celular cancerígena de interesse e sedimentar as células por centrifugação. Aspire o supernasce e mecanicamente resuspenda as células no meio residual. Coloque a suspensão celular no gelo e use uma pipeta para medir o volume de células em média.

Em seguida, resuspengou as células a uma concentração de um a dois milhões de células em 20 a 100 microlitres de médio suplementado com 2,7 a 4 miligramas por matriz extracelular mililitro e quaisquer fatores de crescimento ou outros aditivos de interesse. Para implantação de células cancerígenas, usando um anel antiaderente, coloque até seis ovos para serem implantados no rack de ovos e role as bordas do curativo transparente do filme em direção à janela aberta para remover o filme das conchas. Verifique se os ovos são viáveis e saudáveis.

Os ovos ideais terão um grande vaso com vasos de ramificação menores dentro do centro da área aberta. Usando fórceps de íris curvas, coloque um anel antiaderente estéril sobre a CAM sobre o vaso idealmente sobre um ponto de ramificação. Use uma haste de vidro estéril para arrotar suavemente a CAM e pipetar a suspensão da célula cancerosa no centro do anel.

Quando todas as células tiverem sido entregues, sele a abertura com um quarto de seis por sete centímetros transparentes e rotule o ovo com uma designação de implante apropriada. Em seguida, coloque os ovos firmemente na incubadora com a abertura da casca virada para cima. Para implantar células cancerígenas sem o uso de um anel antiaderente, aspire a suspensão celular em uma ponta de pipeta de tamanho apropriado e segurando a porção superior da ponta cuidadosamente ejetar a ponta pipeta e colocar a ponta horizontalmente em um prato de cultura de tecido estéril de 10 centímetros.

Depois que as pontas tiverem sido carregadas, coloque o prato em uma incubadora Celsius de 37 graus por 15 a 30 minutos, verificando se há polimerização após 15 minutos. Uma pequena quantidade de líquido normalmente vazará à medida que cada ponta é colocada no prato. Use este líquido para estimar a extensão da polimerização dentro da ponta.

Quando a matriz estiver pronta, coloque uma ponta sobre uma pipeta de tamanho apropriado e deprimir o êmbolo para forçar a suspensão parcialmente polimerizada da célula sobre a CAM idealmente sobre o ponto ramificado de um vaso grande e bem desenvolvido. Utilizando esses métodos, tanto linhas de células cancerígenas humanas quanto murinas e peças tumorais primárias resultaram no enxerto bem sucedido de tumores com morfologias consistentes com as observadas em outros modelos in vivo. Dos tipos de tumores testados, o crescimento do câncer de ovário foi muito menos pronunciado e tipicamente não visível sem a assistência de imagens de bioluminescência.

Os efeitos da adição de fatores de crescimento ou hormônios no momento da implantação também podem ser testados usando esses métodos. Para o câncer de rim, a implantação de células cancerígenas de células claras de células claras a partir de linhas celulares estabelecidas ou pedaços de tumores renais humanos primários produz formação tumoral rápida e robusta. Além disso, várias linhas de células cancerígenas de próstata humana e murina e linhas de células cancerígenas da bexiga humana e peças tumorais primárias foram usadas para estabelecer tumores usando esse modelo.

É crucial evitar interromper o CAM e a vasculatura e garantir que o CAM não adere à concha ao abrir a janela. Após o enxerto bem-sucedido, o modelo CAM pode ser usado para avaliar a eficácia terapêutica de tratamentos de interesse ou interações entre diferentes tipos de células dentro de um tumor.