Identificação de inibidores da interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio luciferase dividido

Resumo

Aqui, apresentamos um método para triagem de agentes virais anti-hepatite B que inibem a interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio lúciferase dividido. Este sistema permite a fácil detecção de interações proteína-proteína e é adequado para identificar inibidores de tais interações.

Resumo

Há uma necessidade urgente de novos agentes terapêuticos para a infecção pelo vírus da hepatite B (HBV). Embora os análogos de nucleos (t)ide atualmente disponíveis inibem potentemente a replicação viral, eles não têm efeito direto na expressão de proteínas virais transcritas de um DNA circular covalmente fechado viral (cccDNA). Como a alta carga de antígenos virais pode desempenhar um papel nessa carcinogênese crônica e relacionada ao HBV, o objetivo do tratamento com HBV é erradicar as proteínas virais. A proteína reguladora X (HBx) do HBV liga-se à proteína de ligação ao dano ao DNA do hospedeiro 1 (DDB1) proteína para degradar a manutenção estrutural dos cromossomos 5/6 (Smc5/6), resultando na ativação da transcrição viral do cccDNA. Aqui, usando um sistema de ensaio de complementação lúciferase dividido, apresentamos um sistema abrangente de triagem composta para identificar inibidores da interação HBx-DDB1. Nosso protocolo permite a fácil detecção da dinâmica de interação em tempo real dentro das células vivas. Esta técnica pode tornar-se um ensaio fundamental para descobrir novos agentes terapêuticos para o tratamento da infecção por HBV.

Introdução

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma grande preocupação de saúde pública em todo o mundo, com estimativas anuais de 240 milhões de pessoas cronicamente infectadas com HBV e 90.000 mortes devido a complicações da infecção, incluindo cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC)¹. Embora os atuais agentes terapêuticos anti-HBV, análogos nucleos (t)ide, inibem suficientemente a transcrição reversa viral, eles raramente conseguem a eliminação de proteínas virais, que é o objetivo clínico de longo prazo. Seu efeito pobre na eliminação viral da proteína é devido a sua falta do efeito direto na transcrição viral dos minicromossomos circulares cov....

Protocolo

NOTA:Uma representação esquemática do ensaio luciferase dividido é mostrada na Figura 1A,e o processo de ensaio é descrito na Figura 1B. A dinâmica de interação pode ser medida em tempo real sem lyse celular.

1. Preparação celular

1. Mantenha as células HEK293T cultivadas no meio modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco complementadas com 10% v/v soro bovino fetal (FBS), 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C em 20% O₂ e 5% CO₂.
2. Sementes 5 x 10⁶ células em um prato de 100 mm com 10 mL d....

Resultados

Os resultados representativos após o uso deste protocolo são mostrados na Figura 2A,B. A relação sinal/fundo foi superior a 80 e o fator^{Z 9} (o índice de qualidade padrão-ouro para triagem de alta taxa de produção) foi superior a 0,5, indicando que esse sistema de ensaio era aceitável para triagem de alta taxa de produção. Com o limiar definido para >40% inibição em comparação com o controle (DMSO apenas), identifica.......

Discussão

Desenvolvemos um método de triagem conveniente usando um ensaio lúciferase dividido para encontrar inibidores de ligação HBx-DDB1. A dinâmica de interação pode ser detectada em tempo real em células vivas sem a necessidade de lyse celular. A inibição da interação HBx-DDB1 leva à restauração do Smc5/6, o que resulta na supressão da transcrição viral, expressão proteica e produção de cccDNA⁷. Este novo mecanismo de ação antiviral pode superar as inadequações das terapias atuais de HBV.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplaca de cultura celular, 96 poços, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Reagente de transfecção Effectene	Qiagen	301425	Inclui tampão de condensação de DNA, solução intensificadora e reagente de transfecção
FBS	Nichirei
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx– LgBit expressando plasmídeo de DNA	Nosso laboratório		Disponível mediante solicitação
HEK293T células	Coleção de cultura American Type	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Inclui Nano-Glo Reagente de células vivas
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Descrito como "meio de cultura de células tamponadas" no manuscrito
PBS	Takara	T900
Penicilina-Estreptomicina	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well Biblioteca de medicamentos aprovada pela FDA V2 versão 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Os compostos usados aqui foram os seguintes: mequinol, hidrato de mercaptopurina, mesna, mestranol, hemissulfato de metaproterenol, bitartarato de metaraminol, metaxalone, cloreto de metacolina, metazolamida, hipurato de metenamina, metocarbamol, metotrexato, metoxsaleno, brometo de metescopolamina, metsuximida, metitotiazida, aminolevulinato de metila e middot; HCl, maleato de metilergonovina, metolazona, metirapona, mexiletina· HCl, micafungina, miconazol, midodrina· HCl, miglitol, milnacipran· HCl, mirtazapina, mitotano, moexipril e middot; HCl, furoato de mometasona, mupirocina, nadolol, nafcilina· Na, naftifine· HCl, naratriptano· HCl, natamicina, nebivolol· HCl, nelarabina, nepafenaco, nevirapina, niacina, nicotina, nilotinibe, nilutamida, nitazoxanida, nitisinona, nitrofurantoína, nizatidina, nortriptilina e middot; HCl, olsalazina· Na, orlistat, oxaprozina, oxtrifilina, cloreto de oxibutinina, oxitetraciclina· HCl, paliperidona, palonossetrom· HCl, sulfato de paromomicina, pazopanibe· HCl, pemetrexedo dissódico, pemirolaste de potássio, penicilamina, penicilina G de potássio, pentamidina isetionato, pentostatina, perindopril erbumina, permetrina, perfenazina, fenelzina sulfato, fenilefrina, fitonadiona, pimecrolimus, pitavastatina de cálcio e podofilox
SmBit– Plasmídeo de DNA expressando DDB1	Nosso laboratório		Disponível mediante solicitação
Tripsina-EDTA	Sigma Aldrich	T4049