Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias

Summary

Aqui, apresentamos uma ferramenta que pode ser usada para estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em células epiteliais alveolares primárias usando um sistema de expressão indutível acoplado a uma técnica de eletroporação de pipeta.

Abstract

Estudar a regulação pós-transcricional é fundamental para compreender a modulação de um determinado RNA mensageiro (mRNA) e seu impacto na homeostase celular e no metabolismo. De fato, flutuações na expressão da transcrição poderiam modificar a eficiência de tradução e, finalmente, a atividade celular de uma transcrição. Várias abordagens experimentais foram desenvolvidas para investigar a meia-vida do mRNA, embora alguns desses métodos tenham limitações que impedem o estudo adequado da modulação pós-transcricional. Um sistema de indução de promotores pode expressar um gene de interesse o controle de um promotor sintético regulado por tetraciclina. Este método permite a estimativa de meia-vida de um determinado mRNA qualquer condição experimental sem perturbar a homeostase celular. Uma grande desvantagem desse método é a necessidade de transfect as células, o que limita o uso dessa técnica em células primárias isoladas que são altamente resistentes às técnicas convencionais de transfecção. Células epiteliais alveolares na cultura primária têm sido usadas extensivamente para estudar a biologia celular e molecular do epitélio alveolar. As características únicas e o fenótipo das células alveolares primárias tornam essencial estudar as modulações pós-transcricionais de genes de interesse nessas células. Portanto, nosso objetivo era desenvolver uma nova ferramenta para investigar as modulações pós-transcricionais de mRNAs de interesse em células epiteliais aerarelaras na cultura primária. Projetamos um protocolo de transfecção transitória rápido e eficiente para inserir um sistema de expressão plasmídea controlada transcricionalmente em células epiteliais alveolarprimárias primárias. Essa estratégia de clonagem, utilizando um epítopo viral para marcar o construto, permite a fácil discriminação da expressão construtiva a partir da de mRNAs endógenas. Usando um método modificado de ciclo de quantificação ΔΔ (Cq), a expressão da transcrição pode então ser quantificada em diferentes intervalos de tempo para medir sua meia-vida. Nossos dados demonstram a eficiência dessa nova abordagem no estudo da regulação pós-transcricional em várias condições fisiopatológicas em células epiteliais alveolarprimárias primárias.

Introduction

Várias técnicas foram desenvolvidas para determinar a meia-vida dos mRNAs. A técnica de decaibilidade de perseguição de pulso, que utiliza mRNAs rotulados, permite a avaliação simultânea de uma grande piscina de mRNAs com perturbação celular mínima. No entanto, essa abordagem não permite uma estimativa direta da meia-vida de uma única transcrição genética e não pode ser implementada para estudar a modulação pós-transcricional de um mRNA após a estimulação com fatores de crescimento, ROS, alarminas ou inflamação¹.

O uso de inibidores de transcrição, como actinomicina D e α-amanitina, é um método relativamente simples para medir a cinética da degradação do mRNA ao longo do tempo. Uma das principais vantagens dessa abordagem em relação à das técnicas anteriores, (ou seja, perseguição de pulso) depende da capacidade de estimar diretamente a meia-vida de uma determinada transcrição e comparar como diferentes tratamentos poderiam afetar sua cinética de degradação. No entanto, o impacto deletério significativo dos inibidores de transcrição na fisiologia celular representa uma grande desvantagem da abordagem². De fato, a inibição de todo o transcriptome celular com essas drogas tem o efeito colateral negativo de perturbar a síntese de elementos-chave envolvidos na estabilidade do mRNA, como microRNAs (miRNAs), bem como a expressão e síntese de proteínas de ligação de RNA, que são importantes para a degradação e estabilidade do mRNA. A perturbação severa da transcrição genética por essas drogas poderia, portanto, modificar as curvas de degradação das transcrições.

O sistema de indução do promotor representa uma terceira abordagem para medir a meia-vida de um mRNA específico. Este método mede a degradação de um mRNA específico de forma semelhante aos métodos que utilizam inibidores de transcrição. Dois tipos de sistemas de indução são frequentemente utilizados: o promotor c-fos induzido pelo soro³ e o sistema induível Tet-Off⁴. Com o sistema c-fos, o uso de inibidores de transcrição que podem ser tóxicos para a célula não é necessário. No entanto, este método requer a sincronização do ciclo celular, o que impede a avaliação da estabilidade real de uma transcrição durante a interfase⁵. Em contraste, o sistema Tet-Off permite a forte expressão do gene de interesse (GOI) o controle de um promotor sintético regulado por tetraciclina. Este sistema requer a presença de dois elementos que devem ser cotransfecdos na célula para serem funcionais. O primeiro plasmídeo (pTet-Off) expressa a proteína regulatória tTA-Adv, um fator híbrido de transcrição sintética composto pelo repressor procariótico TetR (de Escherichia coli) fundido a três domínios de transativação de transcrição da proteína viral HSV VP16. O GOI é clonado no plasmídeo pTRE-Tight o controle de um promotor sintético (P_Tight),compreendendo a seqüência mínima do promotor citomegalovírus (CMV) fundido a sete repetições da seqüência do operador tetO. A transcrição do gene a jusante de P_Tight depende da interação de TetR com tetO. Na presença de tetraciclina ou sua derivada, doxiciclina, o repressor TetR perde sua afinidade com o operador de tetO, levando a uma cessação da transcrição⁴. As características do sistema Tet-Off tornam-no um modelo ideal para o estudo da expressão específica do mRNA em células eucarióticas, evitando potenciais efeitos pleiotrópicos que são secundários à ausência de seqüências regulatórias procadroticas em células eucarióticas⁶. Normalmente, linhas de células Tet-Off duplamente estáveis (HEK 293, HeLa e PC12) são usadas com este sistema para integrar cópias do regulador e plasmídeos de resposta para acesso conveniente à expressão genética controlável^7,8,9.

Vários modelos de células epiteliais aláslaras na cultura têm sido usados para estudar a biologia celular e molecular do epitélio alveolar. Durante anos, os pesquisadores utilizaram extensivamente células primárias humanas ou roedores^10,11, bem como linhas celulares imortalizadas, como células Humanas A549 ou RLE-6TN de rato^12,13. Embora geralmente sejam menos proliferativas e mais difíceis de cultura e transfect, as células epiteliais aleláscas na cultura primária continuam sendo o padrão-ouro para o estudo da função e disfunção do epitélio alveolar em condições fisiológicas e patológicas. De fato, linhas celulares imortalizadas como as células A549 não exibem as características complexas e fenótipos das células primárias, enquanto as células epiteliais alveolares na cultura primária recapitulam as principais propriedades do epitélio alveolar, em particular a capacidade de formar uma barreira polarizada e apertada^14,15. Infelizmente, essas células são muito resistentes às técnicas convencionais de transfecção, como aquelas que utilizam liposóis, tornando muito difícil o uso de um sistema induzido pelo promotor, como o Tet-Off.

A modulação pós-transcricional de mRNAs é um dos métodos mais eficazes para modular rapidamente a expressão genética de uma transcrição¹⁶. A região não traduzida do mRNA 3 'UTR' desempenha um papel importante nesse mecanismo. Foi demonstrado que, ao contrário do UTR de 5', há uma correlação exponencial entre o comprimento do UTR de 3' e as complexidades celular e morfológica de um organismo. Essa correlação sugere que o UTR de 3'', como as regiões de codificação mRNA, tem sido submetido à seleção natural para permitir uma modulação pós-transcricional cada vez mais complexa ao longo da evolução¹⁷. O UTR de 3' contém vários locais de ligação para proteínas e miRNAs que afetam a estabilidade e a tradução da transcrição.

No presente trabalho, desenvolvemos uma ferramenta para investigar o papel de domínios altamente conservados no UTR de 3' de um GOI para o controle da estabilidade da transcrição. Focamos no canal epitelial de sódio, subunidade alfa (αENaC), que desempenha um papel fundamental na fisiologia epitelial aveolar¹⁸. As células epiteliais alveolares na cultura primária foram transfecentes com sucesso com os dois componentes do sistema Tet-Off, o que permite o estudo do papel do UTR de 3' na estabilidade do mRNA com um sistema que afeta minimamente a fisiologia celular e o metabolismo em comparação com o uso de inibidores de transcrição com outros protocolos. Uma estratégia de clonagem foi desenvolvida para diferenciar a expressão do GoI da do gene endógeno utilizando um epítopo não totalmente expresso (V5). A resposta e os plasmídeos regulatórios foram então transferidos para células epiteliais aláscas usando uma técnica de eletroporação de pipeta. Posteriormente, a expressão da transcrição foi medida pela incubação das células com doxiciclina em diferentes intervalos de tempo. A meia-vida da transcrição foi avaliada por RT-qPCR com um método Cq modificado utilizando o produto transfeccionado tTA-Ad mRNA para normalização. Através do nosso protocolo, oferecemos uma maneira conveniente de estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em diferentes condições e definir o envolvimento das regiões não traduzidas com mais detalhes.

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados Com Animais e aprovados pelo Comitê de Cuidados Institucionais com Animais do Centro de Pesquisa do Centro Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).

1. Projeto e geração do plasmídeo de resposta expressando o gene de interesse (GOI)

1. Use um vetor de tetraciclina-off induível, como o pTRE-Tight.
2. Analisar a sequência do ID e o site de clonagem múltipla (MCS) do vetor para identificar os locais de restrição no MCS que não estão presentes internamente no GOI.
3. Isolar células epiteliais alveolares primárias dos pulmões de rato sprague-dawley machos como descrito anteriormente^19,20.
4. Purifique o RNA total das células epiteliais aláscas por extração de RNA usando um método padrão, como extração de fenol/clorofórmio ou o uso de colunas de giro de RNA baseadas em sílica.
5. Transcreve o mRNA em DNA complementar (cDNA) usando oligo(dT) e transcriptase reversa de alta fidelidade.
6. Use polimerase Taq de alta fidelidade e técnicas padrão de PCR de sobreposição para flanquear o GOI com dois locais de reconhecimento de enzimas de restrição selecionados usando primers projetados.
   1. Que o primer dianteiro contenha um local de ligação ribossomos de consenso Kozak²¹ para melhorar os níveis de expressão para estudar a expressão proteica em paralelo com a estabilidade do mRNA. Uma seqüência que codifica o epítopo V5 a montante do GOI deve ser incluída para distinguir a expressão do GOI transfeccionado da expressão endógena(Tabela 1).
   2. Faça com que o primer reverso contenha um sinal de polianegação após o códon de parada.
7. Mutantes podem ser gerados por exclusão seqüencial para estudar os efeitos de diferentes regiões utr de 3' sobre a estabilidade do mRNA do GOI usando primers reversos codificando um site de polianegação que gradualmente exclui o final de 3' do Goi 3' UTR (Figura 6). Alternativamente, a mutagênese dirigida ao PCR pode ser usada para atingir uma região específica de interesse no UTR²²de 3'' .
8. Digerir o vetor indutor e a inserção com as enzimas de restrição previamente escolhidas na temperatura de incubação apropriada por 1h, seguido de tratamento com fosfatase durante a reação vetorial por 30 min para evitar a auto-ligadura.
9. Separe os segmentos de vetor digerido e insira por eletroforese em um gel de agarose de 1-1,5% (concentração dependendo do tamanho da inserção).
10. Usando uma lâmina e uma luz UV, colete os fragmentos de DNA contendo a inserção desejada e vetor a ser ligado.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
11. Purifique os segmentos coletados do gel de agarose usando um kit de purificação pcr à base de sílica e meça a concentração por espectrofotometria a 260 nm.
12. Ligao o GOI e o vetor induível com ligase de DNA T4 usando uma razão vetor:inserir molar de 1:3 para aumentar a probabilidade de ligadura. Incubar a reação à temperatura ambiente (RT) por 3 h.
13. Transforme a reação de ligadura em E. coli competente (DH5α).
    1. Adicione 1-10 ng de vetor e gene a um tubo contendo 100 μL de células competentes. Incubar as células no gelo por 30 min e, em seguida, células de choque térmico a 42 °C para 45 s. Coloque o tubo no gelo por 2 min e adicione 900 μL de RT LB médio. Incubar as células por 1 h a 37 °C com agitação a 225 rpm.
    2. Espalhe 100 μL da reação em uma placa de ágar LB com um antibiótico adequado (por exemplo, ampicillin a 100 μg/mL para o vetor pTRE-Tight) para selecionar as bactérias transformadas. Incubar a placa durante a noite a 37 °C.
    3. Selecione colônias individuais usando um laço de inoculação ou uma ponta de 20 μL e incubar durante a noite em meio de 5 mL LB contendo o antibiótico adequado a 37 °C com agitação. As bactérias transformadas podem ser armazenadas em estoques de glicerol a -80 °C a uma razão de 400:600 de LB médio para glicerol.
14. Extrair o DNA plasmídeo usando colunas plasmáticas à base de sílica e medir a concentração por espectrofotometria a 260 nm. Confirmar a inserção do IGo por meio da análise de restrição e sua orientação e a ausência de mutações potencialmente introduzidas durante o TR-PCR por sequenciamento.

2. Transfecção do plasmídeo de resposta expressando o gene de interesse (IGo) em células epiteliais alveolares primárias

1. Isole células epiteliais alveolar tipo II dos pulmões de ratos.
2. Semeie as células a uma densidade de 1 x 10⁶ células/cm² em placas de Petri de 100 mm com meio essencial mínimo completo (MEM completo). MEM completo é suplementado com 10% de FBS, 0,08 mg/L tobramicina, Septra (3 μg/mL trimetoprim e 17 μg/mL sulfametoxazol), 0,2% NaHCO₃, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) e 2 mM L-glutamina. Cultura as células para 24h a 37 °C em 5% CO₂ em uma incubadora umidificada.
3. No dia seguinte, coloque 500 μL de MEM completo sem antibiótico em cada poço de uma nova placa de 12 poços e pré-aqueça a placa a 37 °C por 30 min. Durante esta etapa, é importante usar o soro bovino fetal livre de tetraciclinas contaminantes ou com um nível muito baixo para interferir na inducibilidade.
4. Preparar tubos de 1,5 mL contendo o plasmídeo com o INDÁVEL (plasmídeo GOI) e o vetor regulatório (por exemplo, pTet-Off) adicionando 1 μg de plasmídeo GOI e 1 μg de vetor regulatório por poço na RT. Para experimentos de coexpressão com proteínas de ligação de RNA (RBP), 1 μg de um vetor constitutivo (por exemplo, pcDNA3) expressando o RPB de interesse é adicionado à mistura de DNA(Figura 7).
5. Aspirar o meio e enxaguar suavemente as células com PBS (sem cálcio e magnésio) pré-aquecido a 37 °C.
6. Adicione 5 mL de 0,05% de tripsina pré-aquecida a 37 °C e incubar as células até que as células estejam separadas (2-4 min). Neutralizar a tripsina adicionando 10 mL de MEM completo sem antibiótico.
7. Recolher a suspensão celular em um tubo de 50 mL, lavar a placa de Petri com 4 mL de meio para coletar o maior número possível de células restantes e, em seguida, centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 5 min.
8. Aspirar suavemente e descartar o sobrenadante e resuspender a pelota em 1 mL de PBS. Conte e calcule o número de células usando um hemocímetro.
9. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min. Aspirar suavemente o sobrenadante e resuspender a pelota em tampão de resuspensão a uma concentração de 4 x 10⁷ células/mL. Adicione as células do tubo de 1,5 mL preparados na etapa 2.4 a uma concentração de 400.000 células por poço e misture-as suavemente, pipetando para cima e para baixo.
10. Coloque o tubo no dispositivo de eletroporação e encha-o com 3,5 mL de tampão eletrolítico.
11. Insira uma ponta de eletrodo banhada a ouro em uma pipeta pressionando completamente o pistão. Misture suavemente o conteúdo do tubo de 1,5 mL e apiratee cuidadosamente as células com a pipeta. Tenha cuidado para evitar que bolhas de ar entrem na ponta, pois isso causará arco elétrico durante a eletroporação e levará à diminuição da eficiência de transfecção.
12. Insira a pipeta na estação de eletroporação até que haja um som de clique.
13. Selecione o protocolo de eletroporação apropriado para células epiteliais alveolares, correspondente a uma tensão de pulso de 1.450 V e 2 pulsos com largura de 20 ms, e pressione Iniciar na tela sensível ao toque.
14. Imediatamente após a transfecção, remova a pipeta e transfira as células para um poço previamente preenchido com MEM completo sem antibiótico que tenha sido pré-aquecido a 37 °C.
15. Repita as etapas 2.11-2.14 para as demais amostras.
16. Agite suavemente a placa para espalhar as células uniformemente sobre a superfície do poço. Incubar as células a 37 °C em 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada. Após 2 dias, substitua o meio por MEM completo por antibióticos.
17. Confirme o sucesso da transfecção observando a expressão de eGFP um microscópio de fluorescência ou por citometria de fluxo usando um vetor de controle (Figura 1).
    NOTA: Esta etapa é opcional e requer uma etapa adicional de transfecção usando um eGFP de expressação plasmid diferente, como pcDNA3-EGFP.

3. Indução da inibição de transcrição do GoI

NOTA: As células podem ser pré-tratadas com os tratamentos desejados antes da indução de doxiciclina para avaliar seu impacto na estabilidade do mRNA (Figura 5).

1. Prepare uma solução de estoque de doxiciclina de 1 mg/mL em água desionizada. Armazene a solução de estoque a -20 °C protegida da luz. A doxiciclina, uma derivada tetraciclina, é usada em vez de tetraciclina porque tem uma meia-vida mais longa (2x) do que a tetraciclina. Além disso, é necessária uma menor concentração de doxiciclina para a inativação completa do operon tet ²³.
   NOTA: A doxiciclina pode afetar a expressão mRNA do GOI endógeno. Para verificar isso, o efeito de um tratamento de 24 h com doxiciclina em células alveolares deve ser testado para confirmar a ausência de alterações na expressão de GOI (Figura 2).
2. Prepare uma solução de doxiciclina fresca de 1 μg/mL em completa pós-transfecção MEM 72 h e aqueça-a a 37 °C.
3. Substitua o meio por 1 mL de MEM completo contendo 1 μg/mL de doxiciclina por poço para inibir a transcrição do GOI.
4. Incubar múltiplos poços a 37 °C em 5% de CO₂ para diferentes quantidades de tempo de 15 min-6 h para avaliar a meia-vida mRNA do GOI.
5. No final do tratamento, lave as células com PBS frio e lyse--com um kit de extração de RNA fenol-clorofórmio comercialmente disponível adicionando 500 μL de tampão por poço e agitando a placa para homogeneizar as células.
6. Isole o RNA de acordo com o protocolo do fabricante. Determine o rendimento e a pureza do RNA por espectrofotometria em 230, 260 e 280 nm. As amostras de RNA com 260:230 e 260:280 de 1,8 e 2,0, respectivamente, são consideradas puras.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. Determinando a estabilidade do mRNA do GOI

1. Tratamento de 1 μg de RNA total com DNAse I livre de RNAse (grau de amplificação) para remover qualquer traço de DNA plasmático que possa interferir com a amplificação subsequente do DNA.
   1. Em um tubo PCR de 0,2 mL, combine 1 μg de RNA total, 1 μL de 10x de tampão de reação DNase I, 1 μL de DNAse I (1 U/μL) e água sem RNAse para obter um volume total de 10 μL.
   2. Incubar a reação em RT por 20 min.
   3. Desativar o DNAse I adicionando 1 μL de 25 mM EDTA à mistura de reação de 10 μL e incubando a reação a 70 °C por 10 min.
2. Transcreve o RNA total esgotado de DNA em cDNA usando um kit de síntese de CDNA comercialmente disponível com uma mistura de oligo(dT) e primers hexamer aleatórios para melhorar a eficiência da transcrição reversa.
   1. Resumidamente, adicione 4 μL de mistura de reação de 5x, 1 μL de transcriptase reversa e 4 μL de água livre de RNAse a 11 μL da mistura total de RNA empobrecida por DNA para obter um volume de reação total de 20 μL. Misture bem a reação encanando-a para cima e para baixo.
   2. Incubar a reação por 5 min a 25 °C, seguido por 20 min a 46 °C, e depois inativar a reação incubando-a a 95 °C por 1 min. Cada reação produzirá 50 ng/μL de produto cDNA.
   3. Diluir a reação do CDNA a uma concentração de 5 ng/μL adicionando 180 μL de água de grau de biologia molecular à mistura de reação de 20 μL. Armazene os produtos de cDNA a -80 °C ou proceda imediatamente para realizar pcr quantitativo em tempo real (qPCR).
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Projete primers qPCR reversos para frente e para trás específicos do GOI.
   1. Devido à expressão endógena do GOI nas células, os primers devem ser projetados para amplificar um amplicon de 100-150 bp do epítopo V5 acoplado ao GOI (Tabela 1).
   2. Primers de genes de referência interna também devem ser usados como controles de normalização. Normalmente, genes de limpeza, como os genes beta-actina e hipoxantina fosforibosyltransferase 1, são usados como genes de referência. No entanto, estes não podem ser utilizados com este sistema de indução devido à variação da eficiência da transfecção. Em vez disso, a expressão da transcrição tTA-Ad é avaliada para fins de normalização, pois sua expressão é constitutiva nas células devido à atividade do promotor do citomegalovírus. Qualquer variação em sua expressão medida pelo qPCR será representativa da eficiência de transfecção (primers: forward 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' e reverso 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) e permitirá a normalização da expressão dos clones transinfectados(Figura 3).
4. Prepare cada reação qPCR em triplicado usando uma mistura de mestre de tine verde SYBR.
   1. Diluir a mistura de cDNA de 5 ng/μL para uma concentração de 1,25 ng/μL usando água de grau de biologia molecular.
   2. Combine 5 μL de mistura de mestre de tine verde SYBR (2x), 0,1 μL de água de grau de biologia molecular, 0,45 μL de 7,5 μM de primer dianteiro, 0,45 μL de primer reverso de 7,5 μM e 4 μL de 1,25 ng/μL cDNA para obter um volume de reação total de 10 μL. Misture bem, pipetando para cima e para baixo em uma placa PCR de 96 poços. Use filme adesivo óptico para garantir que a tampa da placa esteja selada e para evitar contaminação e evaporação.
   3. Gire a mistura de reação brevemente por centrifugação e coloque a placa em um termociclador qPCR.
5. Amplie os amplicons GOI e tTA-Ad com etiqueta V5 usando as seguintes condições qPCR: 95 °C para 10 min como etapa de desnaturação, seguido por 40 ciclos de 95 °C para 10 s, 58 °C para 15 s e 72 °C para 20 s. Uma curva de fusão de alta resolução deve ser gerada após a realização dos ciclos de amplificação para avaliar as temperaturas específicas de fusão dos amplicons desejados e para garantir a ausência de picos de ruído amplicon.
   1. Inclua controles negativos para o qRT-PCR realizando qPCR com RNA como modelo sem transcrição reversa para servir como um controle para contaminação potencial de DNA plasmídeo e qPCR sem cDNA adicionado à mistura qPCR para garantir a falta de dimers primer ou Contaminantes.
   2. A concentração ideal de CDNA, a eficiência do primer e a concentração devem ser otimizadas de acordo com o IDI por um ensaio de curva padrão. Para isso, realize uma diluição serial usando cDNA de células não tratadas (cultivadas sem doxiciclina). A curva padrão é gerada plotando os valores de Cq em relação ao registro do fator de diluição do cDNA, e a eficiência de amplificação (E) é calculada de acordo com a inclinação da curva padrão usando a seguinte fórmula:
      E = 10^{-1/inclinação}
      NOTA: A eficiência de amplificação deve ser de aproximadamente 0,9 a 1,05. Caso contrário, os primers devem ser redesenhados.
6. Analisar os dados qPCR utilizando o método Cq comparativo normalizando os valores de expressão do IG à expressão do tTA-Ad para obter os níveis de expressão relativa do IDM e relatar sua expressão como percentual da expressão mRNA do GOI em células do mesmo animal no ponto de partida (t = 0) (Figura 4).
7. A meia-vida é determinada a partir da constante de taxa (K) da curva de degradação de GOI mRNA usando a seguinte equação:
   t_1/2 = em 2/K.

Results

Este protocolo foi utilizado com sucesso para gerar um sistema de expressão plasmídea controlado transcriptalmente tet-Off para avaliar a importância de diferentes porções do ΑENaC 3' UTR na modulação da estabilidade da transcrição em células epiteliais alveolarprimárias primárias.

O primeiro passo na implementação desse sistema foi estabelecer uma técnica de transfecção rápida, fácil e eficiente para células epiteliais alelásar...

Discussion

A baixa taxa de transfecção de células epiteliais alveolares na cultura primária tem sido uma séria limitação para o uso do sistema Tet-Off para avaliar a estabilidade do mRNA nessas células. No entanto, essa limitação foi superada pela eletroporação da pipeta, permitindo uma eficiência de transfecção de 25-30%(Figura 1 e Figura 3)²⁶.

A medição da estabilidade da transcrição é fundamental para compreender a mod...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actinomicina D	Sigma-Aldrich	A9415
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A1593
Bright-LineHemacitômetro	Sigma-Aldrich	Z359629
Clorofórmio - Grau de biologia molecular	Sigma-Aldrich	C2432
ClaI	New England Biolabs	R0197S
Cicloheximida	Microscópio invertido LED Sigma-Aldrich	C7698
DM IL com contraste de fase
I, grau de amplificação	Invitrogen	18068015
hiclato de doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (D-PBS), sem cálcio e magnésio	Wisent Bioproducts	311-425-CL
Etanol - grau de biologia molecular	Fisher Scientific	BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker	Eppendorf	1220G76
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES pH 7.3	Sigma-Aldrich	H3784
Heracell 240i	ThermoFisher Scientific	51026420
Kit de Síntese de cDNA iScript	Bio-Rad Laboratories	1708890
Isopropanol - Grau de biologia molecular	Caldo Sigma-Aldrich	I9516
LB (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB com ágar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Lipopolissacarídeos dePseudomonas aeruginosa10	Sigma-Aldrich	L9143
MEM, pó	Gibco	61100103
Placa de reação óptica de 96 poços MicroAmp	Applied Biosystems	N8010560
Filme adesivo óptico MicroAmp	Applied Biosystems	4360954
Armários de Segurança Biológica Classe II MSC-Advantage	Sistema	de
	Takara Bio	AD140
NanoDrop 2000c	ThermoFisher Scientific	ND-2000
10 µ L Kit	Invitrogen	MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack	Invitrogen	MPK5000S
NheI	New England Biolabs	R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemicamente CompetenteE. coli	Invitrogen	C854003
pcDNA3 vector	ThermoFisher Scientific	V790-20
pcDNA3-EGFP plasmídeo	Addgene	13031
PlatinumTaqDNA Polimerase Alta Fidelidade	Invitrogen	11304011
pTet-Off Vetor avançado	Takara Bio	631070
vetor pTRE-Tight	Takara Bio	631059
Células epiteliais alveolares purificadas	n.a.n.a.QIAEX
II Kit de extração de gel	QIAGEN	20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 e 7 Flex Real-Time PCR System Software	Applied Biosystems	n.a.QuantStudio
6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast	Applied Biosystems	4485697
Rata TNF-alfa Protein	R& AMP; D Systems	510-RT-010
Septra	Sigma-Aldrich	A2487
Fosfatase alcalina de camarão (rSAP)	New England Biolabs	M0371S
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725270
SuperScript IV Transcriptase reversa	Invitrogen	18090010
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0011
Tet System Aprovado FBS	Takara Bio	631367
Tobramicina	Sigma-Aldrich	T4014
TRIzol Reagente	Invitrogen	15596018
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Gibco	25300054
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
, bioprodutos	809-115-EL		Wisent