Um método conveniente, rápido e econômico para medir a proporção de células da população lateral em linhas de células tumorais sólidas é apresentado.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco cancerígenas (CSCs) são uma importante causa de crescimento tumoral, metástase e recidiva. O isolamento e identificação dos CSCs são de grande importância para a pesquisa de tumores. Atualmente, diversas técnicas são utilizadas para a identificação e purificação de CSCs a partir de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. A separação e análise das células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados. Os métodos dependem da capacidade dos CSCs de expulsar rapidamente corantes fluorescentes, como hoechst 33342. O efflux do corante está associado aos transportadores de de ligação ATP (ABC) e pode ser inibido pelos inibidores do transporte ABC. Métodos para coloração de células tumorais cultivadas com Hoechst 33342 e análise da proporção de suas células de SP por citometria de fluxo são descritos. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Os dados gerados neste ensaio podem contribuir para uma melhor compreensão do efeito dos genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares nas propriedades de tronco das células tumorais.
Introdução
As células-tronco cancerígenas (CSCs) são subconjuntos de células com capacidade de autoconexão e potencial de diferenciação múltipla, que desempenham um papel vital no crescimento do tumor, metástase e recidiva1,2. Atualmente, os CSCs têm sido identificados para existir em uma variedade de tumores malignos, incluindo câncer de pulmão, cérebro, pâncreas, próstata, mama e fígado3,4,5,6,7,8,
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação celular
- Digestão celular e neutralização
- Células tumorais de sementes (como células MDA-MB-231) em uma placa de 6 poços, e cultivadas em uma incubadora de 37 °C fornecida com 5% de CO2.
- Células de colheita quando sua densidade atinge cerca de 90%. Aspire bem o meio de cultura e lave as células 2x com 3 mL de soro fisco tamponado (PBS).
NOTA: Para examinar os efeitos dos inibidores da via de sinalização (por exemplo, inibidor FRA1) ou ativadores FRA1 (por exemplo, ativador STAT3) sobre as características de tronco das células tumorais, as células tumorais são semeadas em uma placa de 6 poços e pré-tratadas com in....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Foram realizadas quatro análises experimentais de SP de acordo com esse método. No primeiro, detectamos a proporção de células de SP no MDA-MB-231, que é uma linha tripla negativa de células cancerígenas de mama humana, em condições normais. Após a contagem celular, Hoechst 33342 foi adicionado em um tubo contendo 1 x 106 células a uma concentração final de 3 μg/mL. Reserpine e Hoechst 33342 foram adicionados a outro tubo para concentrações finais de 40 μM e 3 μg/mL, respectivamente. Pi foi adicionado a ambos .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Existem vários pontos-chave a serem mente para o ensaio de SP. A primeira é a seleção de um bloqueador adequado, como Verapamil ou Reserpine, para cada linha celular, pois a localização do "portão" das células sp é determinada de acordo com a posição em que um grande número de células de SP desaparece após a adição do bloqueador. Para a linha de células MDA-MB-231, a Reserpine funciona bem. No entanto, para outras linhas de celular, diferentes bloqueadores podem funcionar melhor.
A segunda é a.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da China 81572599, 81773124 e 81972787; Fundação de Ciência Natural da Cidade de Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundos de Pesquisa Fundamentais para as Universidades Centrais, 63191153 da Universidade de Nankai.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de células de 6 poços | CORNING | 3516 | 9,5 cm2 (aprox.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Soro fetal bovino (FBS) | Indústrias Biológicas (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Citômetro de fluxo | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Software de citômetro de fluxo | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Software de análise de citometria de fluxo | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimida H 33342 tricloridrato |
| Tubo de ensaio de fundo redondo de poliestireno | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propídio iodeto (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5- [3- (dietilmetilamônio) propil] -6-fenilfenantridínio diiodeto |
| Reserpina | Sigma-Aldrich | 83580 | (3 β, 16 β, 17 &alfa;, 18 β, 20 &alfa;)-11,17-Dimetoxi-18-[(3,4,5-trimetoxibenzoil)oxi]ioimbano-16-ácido carboxílico éster metílico |
| SKLB816 | Fornecido pelo Dr. Shengyong Yang, Universidade | ||
| Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol | Gibco | 25200072 | |
| cloridrato de Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimetoxifeniletil)metilamino] Cloridrato de -2-(3,4-dimetoxifenil)-2-isopropilvaleronitrila |
Referências
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
