Artigo de método

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

DOI:

10.3791/60658

⸱

23 de fevereiro de 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um método conveniente, rápido e econômico para medir a proporção de células da população lateral em linhas de células tumorais sólidas é apresentado.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são uma importante causa de crescimento tumoral, metástase e recidiva. O isolamento e identificação dos CSCs são de grande importância para a pesquisa de tumores. Atualmente, diversas técnicas são utilizadas para a identificação e purificação de CSCs a partir de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. A separação e análise das células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados. Os métodos dependem da capacidade dos CSCs de expulsar rapidamente corantes fluorescentes, como hoechst 33342. O efflux do corante está associado aos transportadores de de ligação ATP (ABC) e pode ser inibido pelos inibidores do transporte ABC. Métodos para coloração de células tumorais cultivadas com Hoechst 33342 e análise da proporção de suas células de SP por citometria de fluxo são descritos. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Os dados gerados neste ensaio podem contribuir para uma melhor compreensão do efeito dos genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares nas propriedades de tronco das células tumorais.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são subconjuntos de células com capacidade de autoconexão e potencial de diferenciação múltipla, que desempenham um papel vital no crescimento do tumor, metástase e recidiva1,2. Atualmente, os CSCs têm sido identificados para existir em uma variedade de tumores malignos, incluindo câncer de pulmão, cérebro, pâncreas, próstata, mama e fígado3,4,5,6,7,8,9. A identificação de CSCs nesses tumores baseia-se principalmente na presença de proteínas de marcadores superficiais, como alta e/ou baixa expressão de CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, mas um marcador único que pode distinguir CSCs de não-CSCs não foi relatado até agora. Atualmente, várias técnicas são utilizadas para identificar e purificar CSCs em tecido tumoral ou linhas de células tumorais. Essas técnicas são projetadas com base nas propriedades específicas dos CSCs. Entre eles, ensaios e triagem de células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados.

As células-tronco de SP foram originalmente descobertas por Goodell et al.11, quando caracterizaram células-tronco hematopoiéticas em células de medula óssea do rato. Quando as células de medula óssea do rato foram rotuladas com o corante fluorescente Hoechst 33342, um pequeno grupo de células mal manchadas hoechst 33342 apareceu no gráfico de pontos bidimensionais de um ensaio de citometria de fluxo. Hoechst 33342 é um corante de ligação de DNA e tem pelo menos dois modos de ligação que levam a diferentes características espectrais. Ao visualizar a emissão de fluorescência em dois comprimentos de onda ao mesmo tempo, várias populações podem ser reveladas12. Em seu ensaio, o Hoechst 33342 estava animado a 350 nm e a fluorescência foi medida usando o filtro de banda-pass (BP) de 450/20 nm e o filtro de borda de 675 nm de passagem longa (EFLP)11. Comparado com toda a população de células de medula óssea, esse grupo de células foi enriquecido com células-tronco hematopoiéticas chamadas células-tronco de SP11. As células SP são capazes de expulsar rapidamente Hoechst 33342. O efflux deste corante está relacionado aos transportadores de de ligação ATP (ABC)13, que podem ser inibidos por alguns agentes como Fumitremorgin C14, Verapamil e Reserpine15,16. Depois disso, diferentes proporções de células de SP foram detectadas em uma variedade de tecidos, órgãos, tecidos tumorais e linhas de células tumorais17,18,19. Essas células de SP têm muitas características das células-tronco17,19.

Este manuscrito descreve a rotulagem e coloração de células tumorais cultivadas hoechst 33342 e a análise de células de SP por citometria de fluxo. Além disso, a otimização da concentração de Hoechst 33342 e a seleção adequada do bloqueador para uma linha celular tumoral específica usando esta abordagem são mostradas. Finalmente, os efeitos da promoção da haste ou sinais de inibição na proporção de SP nas células tumorais são demonstrados. Os exemplos experimentais demonstram que a análise de SP pode ser usada para explorar os efeitos de vários sinais, como expressão genética, pequenos inibidores, ativadores, citocinas e quimioterapias, sobre a haste tumoral. Comparado a outros métodos de isolamento e purificação de CSCs, como a classificação de CD44+/CD24– população, análise de aldeído desidrogenase (ALDH) e ensaios de formação da esfera tumoral, este método é mais fácil de manipular e é econômico.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação celular

  1. Digestão celular e neutralização
    1. Células tumorais de sementes (como células MDA-MB-231) em uma placa de 6 poços, e cultivadas em uma incubadora de 37 °C fornecida com 5% de CO2.
    2. Células de colheita quando sua densidade atinge cerca de 90%. Aspire bem o meio de cultura e lave as células 2x com 3 mL de soro fisco tamponado (PBS).
      NOTA: Para examinar os efeitos dos inibidores da via de sinalização (por exemplo, inibidor FRA1) ou ativadores FRA1 (por exemplo, ativador STAT3) sobre as características de tronco das células tumorais, as células tumorais são semeadas em uma placa de 6 poços e pré-tratadas com inibidores ou ativadores por um certo período de tempo antes da colheita.
    3. Adicione 500 μL de 0,25% trypsin-EDTA a cada poço da placa de 6 poços, coloque a placa em uma incubadora a 37 °C por 1-3 minutos (min) e bata suavemente na placa para desprender as células.
      NOTA: A digestão prolongada afetará o perfil de PS devido a alterações na viabilidade celular.
    4. Adicione 3 mL de PBS suplementado com 2% de soro bovino fetal (FBS) a cada poço da placa de 6 poços para terminar a digestão e in pipetar suavemente as células para cima e para baixo 3-5x para dispersar as aglomerados celulares.
    5. Adicione 0,5 mL de suspensão celular a um poço de uma nova placa de poço 6 e examine-a sob um microscópio. Se forem observadas aglomerações celulares, passe a suspensão celular através de um coador de células de 70 μM.
      NOTA: Este é um passo opcional.
    6. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Células centrífugas a 200 x g por 5 min para células de pelotização. Remova o supernasce e resuspensá-los em 3 mL de PBS complementados com 2% de FBS. Pipeta as células para cima e para baixo 3-5x para misturar completamente.
  2. Contagem de células
    1. Adicione 50 μL da suspensão celular em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e misture-o com uma solução azul trypan de 50 μL. Pipeta 10 μL da mistura para contar o número de células vivas usando um método padrão, como um hemócito.
    2. Diluir as células em PBS suplementadas com 2% de FBS a uma concentração final de 1 x 106 células/mL. Adicione 1 mL da suspensão celular a um tubo de teste de fundo redondo de poliestireno de 5 mL e prepare dois tubos de amostra.

2. Coloração celular com Hoechst 33342

  1. Adicione Hoechst 33342 a um tubo para alcançar uma concentração final apropriada.
    NOTA: Por exemplo, a concentração apropriada de Hoechst 33342 é de 3 μg/mL para células MDA-MB-231.
  2. Adicione um bloqueador (por exemplo, Fumitremorgin C, Verapamil ou Reserpine) a outro tubo a uma concentração final apropriada e incubar o tubo a 37 °C por 30 minutos antes de adicionar a mesma concentração de Hoechst 33342 como descrito na etapa 2.1.
    NOTA: Para células MDA-MB-231, o bloqueador apropriado é Reserpine (40 μM). A reserpina é usada como controle de bloqueio para verificar a ausência de células na área de CONTROLADORia fechada.
  3. Prepare vários tubos contendo células e adicione Hoechst 33342 a diferentes gradientes de concentração. Após um ensaio de citometria de fluxo, escolha a concentração adequada de acordo com o perfil e proporção de SP.
    NOTA: Este é um passo opcional usado para definir a concentração adequada de Hoechst 33342.
  4. Prepare vários tubos contendo células, adicione o bloqueador a diferentes gradientes de concentração, incuba os tubos a 37 °C por 30 minutos e adicione Hoechst 33342 a uma concentração apropriada. Após o ensaio de citometria de fluxo, escolha a concentração adequada de acordo com a ausência de células na área de SP fechada.
    NOTA: Esta é uma etapa opcional usada para definir a concentração adequada do bloqueador.
  5. Coloque os tubos em uma incubadora de 37 °C e incuba-os por 60 minutos, agitando os tubos a cada 10 minutos.
    NOTA: A agitação dos tubos é importante para a coloração, pois garante o contato completo entre as células e o corante para melhores resultados de coloração.
  6. Após a incubação, centrifugar as células a 200 x g, 4 °C por 5 min, e aspirar o supernasce cuidadosamente, pois as células formam pelotas muito soltas e instáveis.
  7. Células resuspend de cada tubo em 1 mL de PBS gelado suplementado com 2% de FBS e pipeta as células para cima e para baixo 3-5x para misturar completamente. Adicione 1 μL de 1 mg/mL de iodeto de propidium (PI) à suspensão de cada tubo para identificar células mortas.
    NOTA: Todos os procedimentos nesta etapa devem ser realizados a 4 °C para inibir o efflux de Hoechst 33342 das células tumorais. Os tubos devem ser protegidos da exposição direta à luz.

3. Análise por citometria de fluxo

NOTA: As instruções de uso do software do citómetro de fluxo (ver Tabela de Materiais) estão descritas nesta seção e as Figuras Suplementares 1-10.

  1. No software do citómetro de fluxo, clique no botão FOLDER. Clique no botão Experimentar e clique em Novo Experimento (Figura Suplementar 1A,B).
  2. Clique no botão OK. "Experiment_001" aparecerá na PASTA (Figura Suplementar 2A,B).
  3. Clique no botão Experiment_001 para alterar o nome da pasta para um nome específico (por exemplo, "20191118-SP"). Clique em Enter. O novo nome ("20191118-SP") aparecerá em FOLDER (Figura Suplementar 3A,B).
  4. Clique no botão Novo Espécime para adicionar um espécime à nova pasta de experimento ("20191118-SP"). Clique no botão Novo tubo para adicionar um tubo à amostra. Clique no botão Arrowhead (Figura Suplementar 4A-C).
  5. Clique no botão Parâmetros e configure os parâmetros do citômetro de fluxo(Figura Suplementar 5).
    1. Use um espelho dirómico de 610 nm de passagem curta (DMSP) para separar os comprimentos de onda de emissão. Use um filtro de 450/20 nm BP para coletar a fluorescência azul e um EFLP de 675 nm para coletar a fluorescência vermelha.
      NOTA: Hoechst 33342 está animado com um laser UV a 355 nm e PI está animado em 488 nm.
  6. Execute as amostras de células no citômetro de fluxo.
    NOTA: As células de SP podem ser classificadas por facs (células ativadas por fluorescência) em condições estéreis. Um total de 100.000-500.000 células devem ser coletadas para os experimentos de acompanhamento.
    1. Executar células manchadas com Hoechst 33342 no citómetro de fluxo.
      1. Coloque tubos contendo células manchadas com Hoechst 33342 no cítmetro.
      2. Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos e, em seguida, clique no eixo X e configure-o como " FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "PI-A". Exibir o gráfico de pontos da área de pulso de dispersão dianteira (FSC-A, eixo X definido para o modo linear) versus a fluorescência PI (conjunto do eixo Y para escala logarítmica). Ajuste as tensões para mostrar as células vivas do lado direito e as células não vivas, que estão brilhantemente manchadas com PI, no canto superior esquerdo. Em seguida, estabeleça um portão de polígono para excluir células mortas e detritos celulares(Figura 1A) clicando no botão Polygon Gate para portão do subconjunto P1, também conhecido como FSC-A, subconjunto PI-A(Figura Suplementar 6A,B).
      3. Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "FSC-W". Exibir o gráfico de pontos de FSC-A (eixo X) versus largura de pulso de dispersão para a frente (eixo FSC-W, Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão P1 sob o botão Mostrar populações. Clique no botão Portão Retangular para criar um portão retangular para fechar o subconjunto P2 (também conhecido como subconjunto FSC-A, FSC-W). Isso excluirá células com grandes volumes(Figura Suplementar 7A-C e Figura 1A).
      4. Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " SSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "SSC-W". Exibir o gráfico de pontos da área de pulso de dispersão lateral (SSC-A, eixo X) versus largura de pulso de dispersão lateral (SSC-W, eixo Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico do ponto e clique no botão P2 no botão Mostrar populações. Em seguida, clique no botão Portão Retangular para criar um portão retangular para fechar o subconjunto P3 (também conhecido como subconjunto SSC-A, SSC-W). Isso obterá uma população celular com granularidade uniforme (Figura Suplementar 8A-C e Figura 1A).
      5. Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " Hoechst Red-A"; clique no eixo Y e configurá-lo para "Hoechst Blue-A". Exibir o gráfico de pontos de Hoechst Red-A (eixo X) contra Hoechst Blue-A (eixo Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão P3 sob o botão Mostrar populações. Clique no botão Polygon Gate para criar um portão de polígono para fechar o subconjunto P4 (também conhecido como subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão Mostrar hierarquia populacional para mostrar a hierarquia populacional.
        NOTA: O gráfico de pontos mostrará três populações diferentes: 1) uma população de fase G0-G1 perto do centro do gráfico; 2) uma população de fase S-G2/M perto do canto superior direito; 3) o SP. Em seguida, o SP é fechado para análise posterior (Figura Suplementar 9A-D e Figura 1A). Se o gráfico de pontos de Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A não mostrar um perfil de SP semelhante ao mostrado na Figura 1A,as tensões devem ser ajustadas até que um perfil semelhante seja visto. Enquanto isso, ajuste todos os portões acima de acordo.
      6. Após determinar a região do portão das células sp, clique em Adquirir Dados para coletar 20.000-100.000 eventos de cada amostra para analisar o percentual de células de SP ( FiguraSuplementar 10).
    2. Execute as células manchadas de Hoechst 33342 tratadas com bloqueador no citômetro de fluxo.
      1. Coloque tubos contendo bloqueador no cítômetro e execute células usando as mesmas tensões e portões para verificar se as tensões e portões estão selecionados adequadamente.
        NOTA: Em comparação apenas com a mancha hoechst 33342, apenas uma proporção muito pequena de células, se houver, deve aparecer na área fechada da SP (Figura 1B).
      2. Colete 20.000-100.000 eventos de cada amostra para analisar a porcentagem de células de SP.

4. Análise de dados

NOTA: As instruções para o uso do software de análise de citometria de fluxo (ver Tabela de Materiais) estão descritas nesta seção e as Figuras Suplementares 11–16.

  1. Copie os arquivos em formato fcs para um computador, abra o software de análise de citometria de fluxo e arraste um arquivo de amostra para o software (Figura Suplementar 11A,B).
  2. Células de portão e obter a porcentagem de células de SP.
    1. Clique duas vezes neste arquivo de amostra,clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "PI-A". Em seguida, crie um portão de polígono e clique no botão OK para obter o subconjunto FSC-A, PI-A(Figura Suplementar 12A-E).
    2. Clique duas vezes no arquivo do subconjunto FSC-A, PI-A,clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "FSC-W". Em seguida, crie um portão retangular e clique no botão OK para obter o subconjunto FSC-A, FSC-W(Figura Suplementar 13A-E).
    3. Clique duas vezes no arquivo do subconjunto FSC-A, FSC-W,clique no eixo X e configure-o como "SSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "SSC-W". Em seguida, crie um portão retangular e clique no botão OK para obter o subconjunto SSC-A, SSC-W(Figura Suplementar 14A-E).
    4. Clique duas vezes no arquivo subconjunto SSC-A, SSC-W,clique no eixo X e configure-o como "Hoechst Red-A"; clique no eixo Y e configurá-lo para "Hoechst Blue-A". Em seguida, crie um portão de polígono e clique no botão OK para obter o subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A(Figura Suplementar 15A-E).
    5. Abra o Editor de layout clicando no botão Editor de layout aberto. Arraste o arquivo subconjunto SSC-A, SSC-W para o Editor de Layout e clique na janela Clique para salvar o botão de arquivo de layout para salvar os resultados da imagem ( FiguraSuplementar 16A-C).
  3. Salve o espaço de trabalho para manter as informações de gating ao fechar o software.
  4. Realizar análises de teste t com software de análise estatística para comparar a diferença entre dois grupos. Foi definido um valor de P < 0,05 como estatisticamente significante.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foram realizadas quatro análises experimentais de SP de acordo com esse método. No primeiro, detectamos a proporção de células de SP no MDA-MB-231, que é uma linha tripla negativa de células cancerígenas de mama humana, em condições normais. Após a contagem celular, Hoechst 33342 foi adicionado em um tubo contendo 1 x 106 células a uma concentração final de 3 μg/mL. Reserpine e Hoechst 33342 foram adicionados a outro tubo para concentrações finais de 40 μM e 3 μg/mL, respectivamente. Pi foi adicionado a ambos ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existem vários pontos-chave a serem mente para o ensaio de SP. A primeira é a seleção de um bloqueador adequado, como Verapamil ou Reserpine, para cada linha celular, pois a localização do "portão" das células sp é determinada de acordo com a posição em que um grande número de células de SP desaparece após a adição do bloqueador. Para a linha de células MDA-MB-231, a Reserpine funciona bem. No entanto, para outras linhas de celular, diferentes bloqueadores podem funcionar melhor.

A segunda é a...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da China 81572599, 81773124 e 81972787; Fundação de Ciência Natural da Cidade de Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundos de Pesquisa Fundamentais para as Universidades Centrais, 63191153 da Universidade de Nankai.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura de células de 6 poçosCORNING35169,5 cm2 (aprox.)
ColivelinMCEHY-P1061ASer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Soro fetal bovino (FBS)Indústrias Biológicas (BIOIND)04-001-1ACS
Citômetro de fluxoBD BiosciencesBD LSRFortessa
Software de citômetro de fluxoBD BiosciencesFACSDiva
Software de análise de citometria de fluxoBD BiosciencesFlowJo
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261bisBenzimida H 33342 tricloridrato
Tubo de ensaio de fundo redondo de poliestirenoCORNING35205412 x 75 mm, 5 mL
Propídio iodeto (PI)Sigma-AldrichP41703,8-Diamino-5- [3- (dietilmetilamônio) propil] -6-fenilfenantridínio diiodeto
ReserpinaSigma-Aldrich83580(3 β, 16 β, 17 &alfa;, 18 β, 20 &alfa;)-11,17-Dimetoxi-18-[(3,4,5-trimetoxibenzoil)oxi]ioimbano-16-ácido carboxílico éster metílico
SKLB816Fornecido pelo Dr. Shengyong Yang, Universidade
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolGibco25200072
cloridrato de VerapamilSigma-AldrichV46295-[N-(3,4-Dimetoxifeniletil)metilamino] Cloridrato de -2-(3,4-dimetoxifenil)-2-isopropilvaleronitrila
de Sichuan

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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