Artigo de método

Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários

DOI:

10.3791/60680

⸱

18 de março de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo geral deste protocolo é instruir como extrair, manter e dissociar as células murina e microglia do sistema nervoso central, seguidas de infecção com parasitas protozoários.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrócitos e microglia são as células gliais mais abundantes. São responsáveis pelo apoio fisiológico e manutenção da homeostase no sistema nervoso central (SNC). As evidências crescentes de seu envolvimento no controle de doenças infecciosas justificam o interesse emergente no aprimoramento de metodologias para isolar astrócitos primários e microglia, a fim de avaliar suas respostas às infecções que afetam o SNC. Considerando o impacto da infecção por Trypanosoma cruzi (T. cruzi)e Toxoplasma gondii (T. gondii)no CNS, aqui fornecemos um método para extrair, manter, dissociar e infectar astrócitos de murina e células de microglia com parasitas protozoários. As células extraídas de cortices recém-nascidos são mantidas in vitro por 14 dias com substituição periódica diferencial da mídia. Astrócitos e microglias são obtidos a partir do mesmo protocolo de extração por dissociação mecânica. Após a fenotipagem por citometria de fluxo, as células são infectadas com protozoários parasitas. A taxa de infecção é determinada por microscopia de fluorescência em diferentes pontos de tempo, permitindo assim a avaliação da capacidade diferencial das células gliais para controlar a invasão e a replicação do protozoário. Essas técnicas representam métodos simples, baratos e eficientes para estudar as respostas dos astrócitos e microglia às infecções, abrindo o campo para análises neuroimunologia suplementares.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O SNC é composto principalmente por neurônios e células gliais1,2,3. Microglia e astrócitos são as células glia mais abundantes no SNC. Microglia, o macrófago residente, é a célula de glia imunocompetente e fagocítica no CNS3,4, enquanto os astrócitos são responsáveis pela manutenção da homeostase e exercem funções de apoio5.

Apesar de as células gliais serem conhecidas por serem conhecidas por serem responsáveis pelo apoio e proteção dos neurônios6,7, funções emergentes dessas células foram descritas na literatura recente, incluindo suas respostas às infecções8,9,10,11. Assim, há um empurrão para desenvolver métodos para isolar essas células gliais para entender suas funções individualmente.

Existem alguns modelos alternativos para estudar células gliais em vez de culturas primárias, como linhagens celulares imortalizadas e modelos in vivo. No entanto, as células imortalizadas são mais propensas a sofrer deriva genética e alterações morfológicas, enquanto estudos in vivo impõem condições limitadas de manipulação. Por outro lado, as culturas primárias são fáceis de manusear, se assemelham melhor às células in vivo e também nos permitem controlar fatores experimentais12,13. Aqui, descrevemos orientações sobre como extrair, manter e dissociar os astrócitos murina e as células primárias de microglia no mesmo protocolo. Além disso, também fornecemos exemplos de como trabalhar com a infecção por protozoários nessas culturas.

As células CNS extraídas de camundongos neonatais (até 3 dias de idade) foram cultivadas durante 14 dias em meios diferenciais que permitem o crescimento preferencial de astrócitos e microglias. Uma vez que a microglia está acima dos astrócitos anexados, as populações celulares foram mecanicamente dissociadas em uma incubadora orbital. Em seguida, coletamos todo o sobrenadante contendo microglia e adicionamos tripsina para desapegar os astrócitos. As células gliais isoladas foram avaliadas fenotipicamente por citometria de fluxo e banhadas de acordo com o experimento desejado.

Também fornecemos exemplos de como infectar essas microglias isoladas e astrócitos com parasitas protozoários. T. gondii é um protozoário altamente neurotrópico responsável pela toxoplasmose14, enquanto T. cruzi é responsável pela doença de Chagas que pode levar ao desenvolvimento de distúrbios neurológicos na CNS15,16. Além disso, também foi relatado que a infecção por T. gondii17,18 ou T. cruzi19,20,21 foram a causa presumida de morte em pacientes imunocomprometidos. Portanto, a elucidação do papel imunológico das células gliais do SNC no controle das infecções por protozoários é de grande importância.

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Protocolo

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Todos os procedimentos experimentais envolvendo camundongos foram realizados de acordo com a Lei Nacional (11.794/2008) e aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso animal (IACUC) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).

1. Extração, Manutenção e Dissociação de Células Gliais

NOTA: O número de camundongos utilizados para a extração de células gliais depende da quantidade de células necessárias para realizar os experimentos desejados. Neste protocolo, foram obtidos um total de 2,7 x 107 astrócitos e 4 x 106 microglias de seis camundongos c57BL/6 neonatais. Todos os procedimentos foram realizados em condições estéreis em um gabinete de biossegurança classe II.

  1. Dia 1º
    1. Prepare a solução de sal balanceado de Hank puro (HBSS) e HBSS + 10% do soro bovino fetal inativado pelo calor (FBS) (ver Tabela de Materiais).
    2. Prepare o Suplemento Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicilina + 0,09 mM Estreptomicina + 12,5 mM HEPES + 30 mM bicarbonato de sódio, pH 7,2) e filtrar com um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Todas as mídias de cultura devem ser armazenadas a 4 °C, mas é necessário pré-aquecê-las a 37 °C por 20 min antes de iniciar o experimento.
    3. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos (tesoura, espátula e pinça) em uma autoclave e use 70% de etanol durante o procedimento.
    4. Coloque os camundongos recém-nascidos (até 3 dias de idade) em uma câmara selada contendo algodão encharcado com isoflurano por 5 min para anestesia profunda.
    5. Borrife o filhote de rato com 70% de etanol e decapite o animal com uma tesoura.
    6. Faça corte sagital (posterior a anterior) com tesoura ao longo do crânio para abri-lo e expor o cérebro. Separe o crânio do cérebro usando pinças. Remova o cérebro usando uma micro espátula para manter a integridade cerebral.
    7. Coloque o cérebro em uma placa de Petri seca (6 cm de diâmetro). Remova a lâmpada olfativa e o cerebelo usando uma micro espátula. Mova o córtex para outra placa de Petri (6 cm de diâmetro) contendo HBSS + 10% FBS (placa de 2 mL/Petri).
    8. Corte o tecido cerebral em pequenos pedaços com uma tesoura estéril e usando uma micropipete p1000 transfira cada tecido cerebral com HBSS + 10% FBS para diferentes tubos cônicos de 15 mL. Certifique-se de que o volume final é de 2 mL/tubo. Caso assim, completo com HBSS + 10% FBS.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Nesse caso, tubos cônicos com tecido CNS devem ser colocados no gelo até 1h.
    9. Lave o tecido cerebral cortado com 3 mL de HBSS + 10% FBS (por tubo) e após a decantação. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes.
      NOTA: Esta etapa visa remover os detritos e recuperar o tecido extraído.
    10. Lave o tecido cerebral cortado com 3 mL de HBSS puro (por tubo) e após a decantação, remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes.
      NOTA: Esta etapa visa remover o soro restante das lavadoras anteriores, pois as células serão trippsinizadas na próxima etapa.
    11. Adicione 3 mL de tripsina por tubo e coloque em banho-maria a 37 °C por 30 min, agitando suavemente os tubos a cada 5 min. Evite bolhas invertendo ou misturando abruptamente os tubos.
      NOTA: Esta etapa visa digerir o tecido coletado.
    12. Para inativar a tripsina, lave o tecido com 3 mL por tubo de HBSS + 10% FBS e, após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes.
    13. Lave o tecido com 3 mL por tubo de HBSS puro e remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 2 vezes.
    14. Adicionar 7 mL por tubo de HBSS puro e homogeneizar o tecido através de sucessivas passagens em pipetas: primeiro com a pipeta sorológica de 10 mL, seguido pelo 5 mL e, finalmente, com a micropipette p1000.
    15. Após a homogeneização, os tubos de centrífuga a 450 x g para 5 min a 4 °C.
    16. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 4 mL de HBSS + 10% FBS por tubo.
    17. Transferir células para um frasco T-75 pré-tratado para adesão ideal da cultura celular (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Processe tecido de cada animal por frasco.
    18. Coloque o frasco na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min para adesão.
    19. Adicione 10 mL de DMEM/F12 suplementado por frasco e incubar a 37 °C e 5% CO2.
      NOTA: O volume final é de 14 mL por frasco.
  2. Dia 3.
    1. Remova 7 mL de meio de cultura do frasco T-75 e adicione 7 mL de DMEM/F12 fresco.
      NOTA: Os frascos conterão muitos detritos celulares e uma aparência nebulosa.
  3. Dia 5
    1. Remova todo o meio do frasco T-75 e adicione 14 mL de DMEM/F12 recém-suplementado.
      NOTA: O meio é substituído dos frascos para remover detritos e células não aderentes.
    2. Após cada 48 h, remova 6 mL do sobrenadante e adicione 7 mL de meio DMEM/F12 fresco até o dia 14 de cultura.
  4. Dia 14.
    1. Depois de remover 6 mL do sobrenadante e adicionar 7 mL de meio DMEM/F12 fresco, feche bem os frascos T-75.
    2. Coloque-os no agitador orbital do chão a 200 rpm e 37 °C durante a noite para dissociar mecanicamente a microglia dos astrócitos.
  5. Dia 15.
    1. Pegue os frascos do agitador e lave-os vigorosamente com seu próprio meio, a fim de otimizar a dissociação celular e colher o número máximo de microglia. Em seguida, colete o sobrenadante (contendo microglia) e transfira para um tubo cônico de 50 mL.
    2. Em seguida, adicione 4 mL de tripsina em cada frasco e incubar por 5 min a 37 °C, a fim de separar os astrócitos.
    3. Adicione 5 mL por frasco de DMEM/F12 suplementado para inativar a tripsina. Lave os frascos com seu próprio meio e transfira o conteúdo para um tubo cônico de 50 mL.
    4. Centrifugação de todos os tubos contendo microglia dissociada e astrócitos a 450 x g por 5 min a 4 °C.
    5. Descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota de microglia em 1 mL e os astrócitos em 10 mL de DMEM/F12 suplementado.
    6. Vá para a contagem de células em uma câmara de Neubauer ou um contador automático de células. Emplacaas as células com DMEM/F12 suplementada na densidade desejada em uma placa de cultura de célula inferior plana apropriada (pré-tratada para a fixação celular ideal; ver Tabela de Materiais). Incubar células a 37 °C e 5% CO2 por 24 h para permitir que elas se conectem.
      NOTA: Reserve 1,5 x106 de cada população celular para confirmar sua pureza por citometria de fluxo.
    7. Realizar uma análise citométrica de fluxo para verificar a pureza das populações celulares.
      NOTA: Consideramos microglia CD11b+/CD45+/GFAP- e astrócitos CD11b-/CD45-/GFAP+. A coloração iba1 e tmem119 podem ser consideradas para caracterizar totalmente a microglia22.
    8. Adicione um FMO (Fluorescência Menos Um)23 e uma amostra não manchada para cada população celular (astrócitos e microglia) como controles do ensaio de citometria de fluxo.
    9. Para cada população celular, reserve 5 x 105 células para cada amostra manchada e não manchada. Para FMO, reserve outros dois tubos de microglia contendo 2,5 x 105 células cada e também reserve outro tubo de 5 x 105 astrócitos.
      NOTA: Uma vez que os números de microglia podem ser um fator limitante, é possível usar menos células para controles não-manchados e FMO.
    10. Centrifugar todos os microtubos a 450 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 500 μL/microtubo de tampão FACS (solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2).
    11. Centrifugação de todos os microtubos a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 100 μL/microtubo de anti-CD16/CD32 (clone 93) (1:50) diluído no tampão FACS. Incubar por 10 min em temperatura ambiente.
    12. Adicione 500 μL/microtubo de tampão FACS em todos os microtubos e centrífugas a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante. Ressuspensão de tubos de coloração de microglia e também tubo fmo astrócito com 50 μL/microtubo de marcadores de superfície misturam: anti-CD45 (PE, clone 30-F11) e anti-CD11b (eFluor 450, clone M1/70) (ambos diluídos em 1: 100 no tampão FACS).
    13. Para células não manchadas, resuspenda com o mesmo volume de buffer FACS. Para microglia FMO, incubar cada tubo de microglia com anti-CD45 ou anti-CD11b. Incubar todas as amostras a 4 °C por 20 min no escuro.
    14. Adicione 500 μL de tampão FACS por microtubo. Centrifugação a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 100 μL/microtubo de tampão de fixação (ver Tabela de Materiais) por 20 min à temperatura ambiente no escuro.
    15. Adicione 500 μL/microtubo de tampão de permeabilização 1x (ver Tabela de Materiais) e incubar a 4 °C por 5 min no escuro.
    16. Centrifugar todos os microtubos a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante. Resuspender os tubos de coloração de astrocitos e microglia e também tubos de microglia FMO com 50 μL/microtubo de anticorpo intracelular anti-GFAP (APC, clone GA5) em uma diluição de 1:100 em tampão de permeabilização de 1x. Para células não manchadas e FMO astrócito, resuspenda as células com o mesmo volume de tampão FACS. Incubar todas as amostras a 4 °C por 30 min no escuro.
    17. Lave todos os tubos adicionando 500 μL/microtubo de tampão de permeabilização de 1x. Centrifugar todos os microtubos a 450 x g,por 5 min a 4 °C. Ressuspensão de cada microtubo em 200 μL de tampão FACS. Adquira 1 x 105 eventos/amostra no citómetro de fluxo.
    18. Para análise, as células devem ser fechadas primeiro em CD11b x CD45 e, em seguida, no histograma GFAP.
      NOTA: Os controles não manchados e FMO são úteis para determinar os portões.

2. Infecção e Avaliação das Taxas de Infecção

  1. Infecção de células gliais com T. gondii
    1. Placa 3 x 104 microglia ou astrócitos com DMEM/F12 suplementado a 37 °C e 5% CO2 para 24 h em uma placa plana pré-tratada de 96 poços (ver Tabela de Materiais).
    2. Infectar cada população celular com taquizoitas de T. cepa de rh gondii expressando proteína fluorescente amarela (YFP) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1:1 (parasita:célula) diluída em 200 μL/poço de RPMI suplementado (3% FBS + 0,16 mM Penicilina + 0,18 mM Estreptomicina + 12,5 mM HEPES + 30 mM bicarbonato de sódio, pH 7.2) (ver Tabela de Materiais). Incubar a 37 °C e 5% CO2 por 48 h.
    3. Em seguida, descarte o sobrenadante e fixe as células adicionando 100 μL/poço de 1% de paraformaldeído (PFA) diluído em PBS a 4 °C por 24 horas.
    4. Substitua o PFA por 100 μL/poço de PBS em pH 7.2.
    5. Remova cuidadosamente os núcleos das células de sobrenadante e de coloração, pipetando 50 μL/poço de DAPI (5 mg/mL) diluído em PBS pH 7.2 (1:1.000) por 1 min de temperatura ambiente no escuro.
    6. Substitua a solução de coloração DAPI por 100 μL/poço de PBS (pH 7.2) e analise-a por microscopia de fluorescência.
  2. Infecção de células gliais com T. cruzi
    1. Placa 3 x 104 microglia ou astrócitos com DMEM/F12 suplementado a 37 °C e 5% CO2 para 24 h em uma placa plana pré-tratada de 96 poços (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Para cada ponto de infecção, use uma placa diferente.
    2. Infectar as células gliais com trippomastigotes da cepa T. cruzi Y em um MOI de 5:1 (parasitas:células) diluídos em 200 μL/poço de RPMI suplementado e incubar a 37 °C e 5% CO2 por 2 h.
      NOTA: Este passo é importante para a invasão celular pelo parasita.
    3. Remova todo o sobrenadante e lave os poços adicionando 200 μL/poço de RPMI suplementado para remover todos os parasitas extracelulares. Remova o sobrenadante e adicione 200 μL/poço de RPMI recém-suplementado.
      NOTA: Esta etapa pretende remover todos os parasitas que não invadiram as células aderentes.
    4. Incubar células infectadas por 2h, 48h e 96 h para avaliar a replicação de T. cruzi em células gliais11.
    5. Após cada ponto de tempo, remova o sobrenadante e fixar as células com 100 μL/poço de metanol por 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, substitua o metanol por 100 μL/poço de PBS (pH 7.2).
    6. Após a fixação, prepare as células para o ensaio de imunofluorescência da seguinte forma.
      1. Para evitar a autofluorescência, trate as células com 100 μL/poço de 50 mM NH4Cl diluído em PBS (pH 8.0) por 15 min. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-a imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).
      2. Em seguida, permeabilize as células adicionando 100 μL/poço de 0,5% Triton diluído em PBS por 15 min. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).
      3. Em seguida, incubar a cultura celular com 100 μL/poço de solução de bloqueio (5% leite sem gordura + 2% BSA diluído em PBS [pH 7.2]) para 1 h à temperatura ambiente. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).
      4. Para colorir amastigotos, incubar com 30 μL/poço de anticorpo monoclonal não comercial (mAb) 2C2 proteína anti-Ssp-4 (1:200) diluída em solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.
      5. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes). Incubar a placa com 30 μL/poço de anticorpo anti-rato secundário (1:500) diluído em PBS por 1 h à temperatura ambiente.
        NOTA: A proteína anti-Ssp-4 mAb 2C2 não comercial foi um presente gentil do Prof. Dr. Renato A. Mortara do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo.
      6. Remova cuidadosamente os núcleos de sobrenadante e mancha adicionando 50 μL/poço de DAPI (5 mg/mL) diluído em PBS pH 7.2 (1:1.000) por 1 min à temperatura ambiente no escuro.
      7. Substitua a solução de coloração DAPI por 100 μL/poço de PBS pH 7.2 e analise-a por microscopia de fluorescência.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No14º dia, a cultura das células gliais (Figura 1A) sofreu dissociação mecânica. As populações de células isoladas foram analisadas por citometria de fluxo segundo marcadores CD11b, CD45 e GFAP. Observou-se uma pureza de 89,5% para a população astrócida e de 96,6% para a população de microglias (Figura 1B). Após o isolamento, as células foram banhadas em uma placa plana de 96 poços e após 24 h estavam prontas para ser...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A importância de estudar funções isoladas de células gliais em contextos biológicos distintos vem se expandindo nas últimas duas décadas. Compreender o SNC além dos neurônios ainda é um campo crescente na biologia celular, especialmente infecções ou condições inflamatórias8,9,24. As células gliais são cruciais não apenas para o suporte físico dos neurônios (como era conhecido anteriormente), mas também em muitas outras situações...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao professor Dr. Renato A. Mortara, da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), pelo mAb 2C2 anti-Ssp-4. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, na justiça, na obra). subvenção 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código financeiro 001). M.P.A. recebe bolsa do CNPq, A.L.O.P. recebe bolsa da CAPES, e I.S.F e L.Z.M.F.B. recebem bolsa da FAPESP.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
70% de etanolDinâ mica Quí mica Contemporâneaâ neaCat: 2231Esterilizar
75 cm2 FrascoCorningCat: 430720UMaterial plástico
96 poços placa de cultura de célulasGreiner CellstarCat: 655090Cultura de células
Cloreto de amônio (NH4Cl)Dinâ mica Quí mica Contemporâneaâ neaCat: C10337.01.AHRemova o anticorpo anti-GFAP de autofluorescência
AbcamCat.: ab49874Filtro superior de frasco antidoby de imunofluorescência
0,22 μ mm CACorningCat: 430513Filtro de meio de cultura
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma AldrichCat: A7906FACS Preparação do tampão
CD11b (FITC)BD PharmigenCat.: 553310Anticorpo de citometria de fluxo
CD45 (PE)InvitrogenCat.: 12-0451-83Anticorpo de citometria de fluxo
CentrífugaEppendorfCat: 5810R
Centrífuga deEppendorf5415RGabinete de
biossegurança de classe IIPachaneCat: 200Armário de biossegurança para procedimentos estéreis
CO2 IncubadoraThermoScientificModelo: 3110Manutenção de células primárias
Tubos cônicos 15 mLCorningCat: 430766Material plástico
Tubos cônicos 50 mLCorningCat: 352070Material plástico
Contador de células automatizado CountessInvitrogenCat: C10281Contador de células
DAPIInvitrogenCat.: D1306Imunofluorescência antidoby
Câmera de microscópio digitalNikonCat: DS-RI1Capturar imagens no microscópio
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoCat: 12800-058Meio de cultura celular
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma AldrichCat: E9884FACS Preparação de tampão
F12 Mistura de nutrientesGibcoCat: 21700-026Meio de cultura celular
FACS Canto IIBD BiosciencesCitômetro de fluxoindisponível
Soro bovino fetal (FBS)LGC BiotecnologiaCat: 10-bio500-1Suplemento de meio de cultura de células
Flow Jo (software)Flow JoVersão: Flow Jo_9.9.4Análise de dados
Luz intensa de fluorescênciaNikonCat: C-HGFIFonte de fluorescência
GFAP (APC)InvitrogenCat.: 50-9892-82Anticorpo de citometria de fluxo
Cabra - IgG anti-rato (FITC)Kirkeegood& Perry Lab (KPL)Cat.: 172-1806Imunofluorescência antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt SolutionGibcoCat: 14175079Meio de cultura de células
HEPESSigma AldrichCat: H4034Suplemento de meio de cultura de células
IC Fixation BufferInvitrogenCat: 00-8222-49Fixação de células para Citometria de Fluxo
Microscópio invertidoNikonModelo: ECLIPSE TS100Microscópio
IsofluranoCristá liaCat: 21.2665Anestésico inalado
MetanolSynthCat: 01A1085.01.BJFixação para Imunofluorescência
Micro espátulaABC inoxidávelcirúrgicoindisponível
Microtubo 1,5 mLAxygenCat: MCT-150-CMaterial plástico
Anticorpo monoclonal (mAb) 2C2 anti-Ssp-4Não comercialNão comercialImunofluorescência antidoby
Pipeta multicanal (p200)CorningCat: 751630124Reagentes de pipeta
Software NIS Elements NikonVersão 4.0Adquirir e analisar imagens
Leite desnatadoNestléCat: 9442405Solução de bloqueio para imunofluorescência
Incubadora Orbital ShakerThermoScientificModelo: 481 Cat: 11Dissociar micróglia de astrócitos
Paraformaldeído (PFA)Sigma AldrichCat: P6148Fixação para Imunofluorescência
PBSNão comercialNão comercialTampão neutro
Penicilina GSigma AldrichCat: P-7794Suplemento de meio de cultura de células
Tampão de permeabilização (10x)InvitrogenCat: 00-8333-56Permeabilização celular para citometria de fluxo
Placa de Petri 60 mm x 15 mm (Descartável, estéril)ProlabCat: 0303-8 Medidor dede material plástico
KasviK39-1014BCalibrar solução de pH
RPMI 1640 MédioGibcoCat: 31800-014Meio de cultura celular
TesouraABC inoxidávelCat: LO9-W4Material cirúrgico
Pipeta serológica 10 mLCorningCat: 4101Material plástico
Pipeta serológica 5 mLCorningCat: 4051Material plástico
Pipeta monocanal (p1000)Gilson PipetmanCat: F123602Reagentes de pipeta
simples Pipeta de canal (p200)Gilson PipetmanCat: F123601Reagentes de pipeta
Bicarbonato de sódioSigma AldrichCat: S6297Suplemento de meio de cultura de
células Sal de sulfato de estreptomicinaSigma AldrichCat: S9137Suplemento de meio de cultura de células
Triton X-100Sigma AldrichCat: T9284Permeabilização para imunofluorescência
TripsinaGibcoCat: 27250-018Pinça de enzima digestiva
ABC inoxidávelCat: L28-P4-172Material cirúrgico
Banho-mariaNovatecnicaModelo: 09020095Digerir tecido a 37 ° C com tripsina
centrifugação de centrifugação Material pH

Referências

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