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Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

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DOI:

10.3791/60682

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23 de junho de 2020

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of New Mexico

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

Resumo

O estresse oxidativo é um evento importante em condições fisiológicas e patológicas. Neste estudo, demonstramos como quantificar o estresse oxidativo medindo a coloração total de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando 2',7'-diclorodihiorescetina diacetato (DCFH-DA) manchando em linhas de células cancerígenas colorretais como exemplo. Este protocolo descreve etapas detalhadas, incluindo a preparação da solução DCFH-DA, a incubação de células com solução DCFH-DA e a medição da intensidade normalizada. A coloração DCFH-DA é uma maneira simples e econômica de detectar ROS nas células. Pode ser usado para medir a geração de ROS após tratamento químico ou modificações genéticas. Portanto, é útil para determinar o estresse oxidativo celular sobre o estresse ambiental, fornecendo pistas para estudos mecanicistas.

Introdução

Três grandes espécies de oxigênio reativo (ROS) produzidas pelo metabolismo celular que são de significado fisiológico são ânion de superóxido, radical hidroxis e peróxido de hidrogênio1. Em baixas concentrações, participam de processos fisiológicos celulares, mas em altas concentrações têm efeitos adversos nas vias de sinalização celular1. Nosso corpo desenvolveu sistemas antioxidantes, que são eficazes contra ros excessivos. No entanto, o estresse oxidativo pode ocorrer quando a ROS sobrecarrega a capacidade desintoxicante do nosso corpo, o que contribui para muitas condições patológicas, incluindo inflamação, câncer e doença neurodegenerativa2,,3,4. O objetivo deste método é determinar o ros celular total em células aderentes usando a coloração de diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). A lógica é que a oxidação de DCFH-DA a 2'-7'dichlororeoresceína (DCF) tem sido usada extensivamente para detecção total de ROS, incluindo radicais hidroxil (•OH) e dióxido de nitrogênio (•NO2). Mecanicamente, DCFH-DA é tomado por células onde esterase celular cleaves fora dos grupos de acetil, resultando em DCFH. A oxidação de DCFH por ROS converte a molécula em DCF, que emite fluorescência verde em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm. Comparado com a detecção de fluorescência com citometria de fluxo e outros métodos alternativos5, as vantagens deste método usando um microscópio de fluorescência e um leitor de placas são que produz imagens fluorescentes claramente visíveis, e é fácil de executar, eficiente e econômico. Este método tem sido amplamente utilizado para detectar ROS celular para estudar várias condições6,,7,8. Este protocolo é usado para detectar ros total em células aderentes. O uso deste método para detectar ROS em células de suspensão pode precisar de algumas modificações.

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Protocolo

1. Semeadura celular

  1. Semente 2 x 105 HCT116 células cancerígenas colorretal por poço em uma placa de 24 poços e manter as células no meio águia modificada (DMEM) modificado de Dulbecco durante a noite a 37 °C.
  2. Substitua o meio de cultura por ou sem sulfato ferroso de 100 μM (FS) ou 10 μM doxorubicina (DOX) contendo médio e incubado por 24 h.

2. Preparação da solução DCFH-DA

  1. Dissolva 4,85 mg de DCFH-DA em 1 mL de sulfóxido de dimetila (DMSO) para fazer uma solução de estoque de 10 mM.
  2. Diluir a solução de estoque com DMEM pré-aquecido em uma solução de trabalho de 10 μM logo antes de adicioná-la aos poços.
  3. Vórtice a solução de trabalho para 10 s.

3. Coloração DCFH-DA

  1. Remova a droga que contém meio e lave uma vez com DMEM.
  2. Adicione 500 μL da solução de trabalho DCFH-DA em cada poço e incubar a 37 °C por 30 min.
  3. Remova a solução de trabalho DCFH-DA. Lave uma vez com DMEM e 2x com soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (PBS).
  4. Adicione 500 μL de 1x PBS a cada poço.

4. Aquisição de imagens e medição de intensidade

  1. Pegue imagens fluorescentes representativas para cada poço usando o canal de proteína fluorescente verde (GFP) em um microscópio de fluorescência.
  2. Depois de tirar imagens, remova o PBS e adicione 200 μL de buffer de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) a cada poço.
  3. Incubar no gelo por 5 minutos, depois coletar lysate celular em tubos de 1,5 mL.
  4. Centrifugar a 21.130 x g por 10 min a 4 °C.
  5. Transfira 100 μL do supernante para uma placa de poço 96 preta e meça a intensidade da fluorescência usando uma fluorescência de um leitor de microplaca em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm.
  6. Transfira 1 μL do supernante para uma placa clara de 96 poços contendo 100 μL de solução de ensaio de proteína 1x para medir a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford9.
  7. Normalizar intensidades de fluorescência com concentrações proteicas.

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Resultados

As células cancerígenas colorretais HCT116 foram tratadas com 100 μM FS ou 10 μM DOX para induzir o estresse oxidativo7. Como mostrado na Figura 1,a fluorescência verde foi dramaticamente aumentada tanto por FS quanto pelo DOX, como esperado. Para quantificar a mudança de intensidade relativa, as células foram lístidas após a realização de imagens e normalizadas com concentrações proteicas. A intensidade de fluorescência quantificada foi significativamente aumentada p...

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Discussão

O protocolo experimental descrito aqui é facilmente reproduzível para medir ros total celular. As etapas críticas incluem tornar a solução DCFH-DA fresca e evitar a exposição à luz, minimizar a perturbação do estado celular e a extensa lavagem de PBS logo antes de tirar imagens. Para a preparação da solução de trabalho DCFH-DA, a solução de estoque deve ser adicionada em DMEM pré-aquecido logo antes de adicionar na placa de poço 24. A razão é que soluções antigas que geram fluorescência de fundo elevado ou exposição à lu...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (K01DK114390), um Research Scholar Grant da American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), um Projeto Piloto de Pesquisa Grant do Programa de Assinatura de Saúde Ambiental da Universidade do Novo México e Superfund (P42 ES025589), um Prêmio piloto de recursos compartilhados e um prêmio de projeto piloto de suporte ao programa de pesquisa do Centro de Câncer Abrangente unm (P30CA118100) , e um novo prêmio de pesquisador do Fundo dedicado à pesquisa em saúde da Faculdade de Medicina da Universidade do Novo México.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2',7'-Diacetato de diclorofluoresceínaCayman Chemical, Ann Arbor, MI20656
Cloridrato de doxorrubicinaTCI America, Portland, OUD4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle MediumCorning, Corning, NY45000-304
Sulfato ferroso heptahidratadoVWR, Radnor, PA97061-542
Sistema de imagem automática Invitrogen EVOS FLThermo Fisher Scientific Waltham, MAAMAFD1000ou qualquer outro microscópio de fluorescência
Ensaio de proteína Solução BradfordBio-Rad, Hercules, CA5000001
Leitor de microplacas SpectraMax M2Molecular Devices, Radnor, PA89429-532ou qualquer outro leitor de microplacas de fluorescência

Referências

  1. Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
  2. Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
  3. Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17(2014).
  4. Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
  5. Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
  6. Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
  7. Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
  8. Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235(2018).
  9. Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
  10. Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
  11. Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
  12. Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).

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