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Artigo de método

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

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DOI:

10.3791/60687

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19 de dezembro de 2019

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Neste artigo

Resumo

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Resumo

A metástase é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e há opções terapêuticas limitadas para pacientes com doença metastática. A identificação e o teste de novos alvos terapêuticos que facilitarão o desenvolvimento de melhores tratamentos para doençametastática requer modelos in vivo pré-clínicos. Demonstrado aqui é um modelo de camundongo singênico para atribuir câncer de mama colonização metastática e crescimento subseqüente. As células cancerosas metastáticas são transinduzidas de forma estrutumsónte com vetores virais codificando protecções de vaga-lume e ZsGreen. Os genes candidatos são então manipulados de forma evigorada em células cancerosas lúciferase/ZsGreen e, em seguida, as células são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda para analisar a colonização e o crescimento metastáticos. Um dispositivo de imagem in vivo é então usado para medir a bioluminescência ou fluorescência das células tumorais nos animais vivos para quantificar as mudanças na carga metastática ao longo do tempo. A expressão da proteína fluorescente permite que o número e o tamanho das metástases nos pulmões sejam quantificados no final do experimento sem a necessidade de secção ou coloração histológica. Esta abordagem oferece uma maneira relativamente rápida e fácil de testar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento, e fornece muito mais informações do que os ensaios tradicionais de metástase da veia da cauda. Usando essa abordagem, mostramos que o knockdown sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) em células de câncer de mama leva à redução da carga metastática nos pulmões e que esta carga reduzida é o resultado de colonização metastática significativamente prejudicada e crescimento reduzido de metástases.

Introdução

O câncer continua a ser a segunda principal causa de morte em todo o mundo1 e metástase é responsável pela maioria dessas mortes2,3. No entanto, uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares que regem a colonização metastática e o crescimento subsequente tem dificultado o desenvolvimento de tratamentos eficazes para a doença metastática. A identificação de novos alvos terapêuticos requer um ensaio para testar como a expressão ou função perturbada de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Embora os modelos de mouse autrátecos tenham suas vantagens, eles são demorados e caros de gerar, tornando-os mais adequados para a validação de destino em vez de descoberta de destino. Os sistemas de modelos de transplante em que o gene candidato é perturbado nas células cancerosas in vitro e, em seguida, os efeitos sobre o potencial metastático são avaliados in vivo, são menos caros e de maior rendimento do que os modelos autótos. Além disso, os vetores virais para entrega estável de RNAi, CRISPR/CAS9 e transgenes estão amplamente disponíveis, tornando relativamente fácil perturbar praticamente qualquer gene ou genes de interesse em linhas de células cancerosas. Esta abordagem também pode ser usada para analisar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento em linhas de células cancerosas humanas, transplantando as células em camundongos imunocomprometidos ou humanizados.

Os dois tipos de ensaios utilizados para testar a formação da metástase por células cancerosas transplantadas in vivo são ensaios de metástase espontânea e ensaios de metástase experimental. Em ensaios metástase espontânea4,5, as células cancerosas são injetadas em camundongos, autorizados a formar um tumor primário, e, em seguida, a formação metástase espontânea e crescimento subseqüente são ensaios. A força deste modelo é que as células devem completar todas as etapas do processo metastático, a fim de formar tumores metastáticos. No entanto, muitas linhas de células cancerosas não metástase eficientemente em modelos de metástase espontânea, e qualquer manipulação das células que impacta o crescimento do tumor primário pode confundir os resultados do ensaio metástase. Ensaios experimentais de metástase, em que as células cancerosas são injetadas diretamente em circulação, são usados para evitar essas armadilhas. Os ensaios experimentais comuns da metástase incluem a injeção da veia da cauda6,7,8 (e demonstrado aqui), injeção intracardiac9,e injeção da veia do portal10.

O objetivo do protocolo apresentado aqui é fornecer um ensaio de metástase experimental in vivo que permita que um pesquisador monitore a formação e o crescimento da metástase em tempo real, bem como quantificar o número e o tamanho da metástase do ponto final nos pulmões do mesmo rato. Para isso, a tradicional metástase experimental da veia da cauda conta6,7,8 são combinadas com imagens de animais vivos, utilizando um dispositivo de imagem in vivo9,11,12,13,14. As células tumorais expressando de forma evigorada tanto a luciferase quanto uma proteína fluorescente são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda e, em seguida, o dispositivo de imagem in vivo é usado para medir mudanças na carga metastática nos pulmões ao longo do tempo (Figura 1). No entanto, o dispositivo de imagem animal vivo in vivo não pode distinguir ou medir o tamanho das metástases individuais. Assim, no final do experimento, um estreoscópio fluorescente é usado para contar o número e medir o tamanho das metástases fluorescentes nos pulmões sem a necessidade de secção e histologia ou imunohistoquímica (Figura 1). Este protocolo pode ser usado para testar como alterar a expressão ou função de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Potenciais compostos terapêuticos, como pequenas moléculas ou anticorpos de bloqueio de função também podem ser testados.

Para demonstrar essa abordagem, primeiro realizamos um experimento de prova de conceito no qual o fator essencial de replicação, a proteína de replicação A3 (RPA3) é derrubado em células metastáticas de câncer de mama de camundongos. Nós mostramos que os ratos injetados com células rpa3 knockdown têm significativamente menos carga metastática em cada ponto de tempo em comparação com ratos injetados com células de controle. A análise dos pulmões contendo metástasidade mostra que essa redução da carga metastática é o resultado de uma colonização metastática significativamente reduzida e crescimento prejudicado das metástases que se formam. Para demonstrar ainda mais essa técnica, testamos se a queda sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) prejudica a colonização metastática ou o crescimento subsequente. YAP e TAZ são dois co-ativadores transcricionais relacionados que são os efetores críticos a jusante do Caminho do Hipopótamo. Nós15,16 e outros implicamos YAP e TAZ na metástase (revista em17,18,19), sugerindo que essas proteínas são bons alvos terapêuticos. Consistentemente, nós encontramos que os ratos injetados com pilhas do knockdown de YAP/TAZ tinham reduzido significativamente a carga metastática. A análise dos pulmões mostrou que as células knockdown YAP/TAZ formaram muito menos metástases e que as metástases que se formaram eram menores. Esses experimentos demonstram como os ensaios de metástase experimental permitem que um pesquisador teste rapidamente e barata o papel de um gene candidato na formação e crescimento da metástase. Eles mostram ainda como o uso combinado de imagens de animais vivos e quantificação fluorescente de metástases em pulmões inteiros permite ao pesquisador entender melhor os passos durante a colonização metastática.

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Protocolo

Este protocolo envolve o uso de camundongos e materiais bioperigosos e requer a aprovação dos comitês de segurança institucional apropriados. Todo o trabalho in vivo descrito aqui é aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Albany Medical College (IACUC).

NOTA: Para uma visão geral do protocolo, veja esquema na Figura 1.

1. Empacotando todos os retrovírus e lentivírus necessários

NOTA: O protocolo descrito usa vetores lentivirais ou retrovirais para expressar de forma etona uma enzima luciferase e proteína fluorescente, bem como para manipular a expressão de um gene candidato. Estes vírus são embalados em células HEK-293FT, conforme descrito abaixo.

  1. Dia 1: Células HEK-293FT em placas de 6 poços em 2 mL de mídia de crescimento completo (10% FBS em DMEM com 1% penicilina/estreptomicina e 2 mM L-Glutamina) para que sejam 40-60% confluentcono no dia 2. Incubar a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
  2. Dia 2: Para que cada vetor viral seja embalado, transfect um poço de confluent de 40-60% de pilhas HEK-293FT com o vetor retroviral ou lentiviral e os vetores apropriados que codificam o revestimento viral e as proteínas de empacotamento.
    NOTA: Este protocolo usa VSVG como a proteína do revestimento, psPAX2 para empacotamento lentiviral, e mordaça-pol para o empacotamento retroviral (veja a tabela suplementar 1 para a lista do vetor).
  3. Faça uma mistura de co-transfecção para cada um bem como segue:
    1. Combine 4 μL de solução lipídica para transfecções (ver Tabela de Materiais)e 96 μL de buffer de transfecção e incubar por 5 minutos.
    2. Adicione 1 μg de vetor viral, 0,5 μg de vetor de proteína de revestimento (VSVG) e 0,5 μg de vetores de proteína de embalagem (psPAX2 ou gag-pol) e incubado por 20 minutos.
    3. Adicione suavemente a mistura de co-transfecção do passo 1.3.2 às células HEK-293FT banhadas no passo 1.1 e incubam a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
  4. Dia 3: Retire os meios contendo transfecção de cada poço e adicione suavemente 2 mL de mídia de crescimento completo para cada poço. Incubar a 37 °C, 5% CO2 por aproximadamente 24 horas.
  5. Dia 4: Colete o supernatant viral de cada poço usando uma seringa de 3 mL e filtre através de um filtro de 0,45 μm em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  6. Opcional: Se a coleta de um segundo lote de vírus for desejada, adicione suavemente 2 mL de mídia de crescimento completo a cada poço e incubar em 37 °C, 5% CO2 por aproximadamente 24 horas.
  7. Dia 5 (Opcional): Recolher uma segunda rodada de supernatant viral como no passo 1.5.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado congelando o supernatant viral.

2. Geração de células cancerosas expressando luciferase e uma proteína fluorescente

NOTA: O seguinte protocolo descreve como primeiro rotular células 4T1 com lúciferase de vaga-lume e uma proteína fluorescente (ZsGreen) usando dois vetores com genes de seleção exclusivos. Em seguida, um vetor viral 3rd é usado para manipular a expressão de um gene candidato. No entanto, vetores virais que simultaneamente entregam uma proteína fluorescente e uma manipulação genética também podem ser usados como uma alternativa (como nos experimentos representativos abaixo). Outras células cancerosas podem ser usadas, mas os números celulares devem ser otimizados para as etapas 2.1 e 2.7.1.

  1. Células 4T1 de placa em 1,5 x 105 células/poço em uma placa de 12 poços em mídia de crescimento completo (10% FBS em DMEM com 1% penicilina/estreptomicina e 2 mM L-Glutamina) e incubada em 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
  2. Infectar as células 4T1 com o supernatant viral gerado na etapa 1 da seguinte forma.
    1. Ascutu os meios de crescimento das células e adicione 500 μL de supernatant viral luciferase e 500 μL de proteína fluorescente supernatant viral para infectar simultaneamente as células com ambos os supernatants viral luciferase e proteína fluorescente.
    2. Adicionar 1 μL de 8 mg/mL hexadimetrina brometo (ver Tabela de Materiais).
    3. Incubar as células a 37 °C, 5% até 75-90% confluent (tipicamente 24-48 horas).
  3. Trypsinize as células 4T1 com 500 μL de trippsina por 2-5 minutos (as células devem enxaguar livremente fora do fundo do poço). Transfira todas as células para um prato de 6 cm em 4 mL de mídia de seleção (mídia de crescimento completo contendo os antibióticos apropriados) saciando assim a tripse. Placa de um prato de 6 cm de células de controle não infectadas nos mesmos meios de seleção.
    NOTA: A concentração adequada de antibióticos deve ser determinada antes do tempo, testando várias doses. Além disso, a triagem celular ativada por fluorescência também pode ser usada para selecionar as células com rótulo fluorescente no lugar da seleção de medicamentos.
  4. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2 em meios de seleção e dividir as células quando necessário até que todas as células controle não infectadas estão mortos (dependente do gene de seleção e linha celular).
  5. Confirme que as células 4T1 infectadas estão expressando a proteína fluorescente ZsGreen usando uma excitação verde (450-490 nm)/emission (500-550 nm) filtro definido em um microscópio fluorescente invertido em ampliação 50-100x.
  6. Confirme que as células 4T1 infectadas estão expressando luciferase usando um kit de atividade de luciferase comercialmente disponível da seguinte forma.
    1. Use um volume mínimo de 1x passivo lysis buffer para lyse luciferase expressando células 4T1 e controle 4T1 células que não expressam luciferase, agitando suavemente por 30 minutos.
    2. Adicione 20 μL de lysato celular a uma placa de 96 poços de fundo branco e, em seguida, 50 μL do reagente de ensaio luciferase do kit de atividade luciferase.
    3. Use um leitor de placa para medir a luminescência das células em todos os comprimentos de onda no espectro usando a configuração de luminescência.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado congelando as células de solucionadamente transinduzidas.
  7. Manipular a expressão do gene candidato da seguinte forma:
    1. Placa 6 x 105 rotuladas 4T1 células do passo 2.6 em um prato de 60 mm em 4 mL de mídia de crescimento completo e incubar em 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
    2. Aspirar a mídia de crescimento de cada poço e adicionar 2 mL de mídia de crescimento completo contendo 4 μL de 8 mg/mL hexadimetrina brometo.
    3. Adicione 2 mL de supernatant viral do passo 1 para as células banhadas a partir do passo 2.7.2 e incubar a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
    4. Trypsinize as células 4T1 com 500 μL de trippsina por 2-5 minutos (as células devem enxaguar livremente fora do fundo do poço). Transfira todas as células para um prato de 10 cm em 10 mL de mídia de seleção (mídia de crescimento completo contendo os antibióticos apropriados) saciando assim a trippsina. Placa de alguns controle não infectadorotulado células 4T1 nos mesmos meios de seleção.
    5. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2 em meios de seleção e dividir as células quando necessário até que todas as células não infectadas estão mortos.
    6. Confirme que a expressão do gene candidato é alterada usando uma abordagem padrão, como mancha ocidental20 ou qPCR21.
    7. Ensaio luminescência e fluorescência como nos passos 2.5-2.6 para determinar o quão semelhantes eles estão no controle e células knockdown, como isso pode mudar (ver Discussão).
      NOTA: O protocolo pode ser pausado congelando as células de solucionadamente transinduzidas.

3. Otimização do design experimental in vivo

  1. Otimizar o número de células apropriado e a duração do experimento para a carga metastática desejada da seguinte forma.
    1. Expandir as células 4T1 fluorescentes e bioluminescentes do passo 2.6 em mídia de crescimento completo para que as células em excesso estejam disponíveis no dia desejado de injeção.
    2. Prepare as células para injeções de veia da cauda, como descrito no passo 4.2. Para determinar o número óptimo da pilha para injeções, resuspenda as pilhas em diversas concentrações diferentes em 100 μL de 1x PBS.
      NOTA: Recomendamos testar uma variedade de números de celular / mouse de 25.000 até 500.000.
    3. Mantenha as suspensões celulares no gelo até a injeção.
    4. Injete cada diluição de células 4T1 do passo 3.1.2 em 3-4 camundongos através da veia lateral da cauda descrita no passo 4.3 (veja abaixo).
    5. Devolva o mouse à sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir uma recuperação completa. Os ratos devem ser verificados para sinais da dor ou da aflição 3x semanalmente.
    6. Monitore camundongos para formação e crescimento de metástase por 3-6 semanas (linha celular e tensão do rato dependente) usando um dispositivo de imagem animal vivo in vivo (ver etapas 5 e 6).
      1. Eutanásia ratos 3-6 semanas após a injeção da veia da cauda de acordo com diretrizes institucionais padrão.
      2. Prepare os pulmões e avalie o tamanho e o número da metástase descritos na etapa 7.
      3. Escolha o período de tempo apropriado para que as metástases cresçam para a carga metastática desejada (veja a discussão).

4. Injeção da veia da cauda de pilhas de cancro etiquetadas

NOTA: Passo 4.2.4 foi otimizado para células 4T1 que crescem em camundongos BALB/c singênicos. Se outras linhas celulares cancerosas e cepas de camundongos forem usadas, o número de células injetadas e o comprimento do ensaio devem ser otimizados primeiro.

  1. Expandir as linhas de célula4T1 geradas no passo 2 em dois pratos de 15 cm em mídia de crescimento completo para que o excesso de células estejam disponíveis no dia da injeção.
  2. Prepare as células para a injeção da veia da cauda da seguinte forma:
    1. Assaa a mídia e lave as placas celulares com 1x PBS.
    2. Trypsinize as células com 5 mL de trippsina por placa de 15 cm por 2-5 minutos (as células devem enxaguar livremente fora do fundo do poço). Transfira todas as células para um tubo cônico. Lave as células restantes do prato de cultura de tecido com bastante mídia de crescimento completo para saciar a triptina e adicionar a lavagem para o mesmo tubo cônico.
    3. Conte as células usando um contador de células automatizado para determinar o número total da célula.
    4. Centrífugas as células em 122 x g por 3 minutos, aspirar o supernatant, e resuspender as células em 1x PBS na concentração desejada. Aqui, 2,5 x 104 células são injetadas em cada rato em 100 μL de PBS, de modo que as células resuspendem em 2,5 x 105 células/mL. Mantenha as suspensões celulares no gelo até a injeção.
      NOTA: é importante limitar a quantidade de tempo entre a trippsinização das células e a injeção da veia da cauda para cerca de 1 hora.
  3. Injete células 4T1 do passo 4.2.5 em camundongos através da veia lateral da cauda da seguinte forma:
    1. Trabalhando em um capuz na instalação animal, misture suavemente, mas completamente as células, invertendo o tubo ou usando uma seringa de 1 mL para garantir que eles sejam resuspensos uniformemente. Certifique-se sempre que as células sejam resuspensas antes de carregar a seringa.
    2. Carregue uma seringa de 1 mL Luer-lock com suspensão celular e expela bolhas de ar em excesso. Coloque uma agulha de 1/2 polegada, calibre 30 na seringa com o bisumo para cima e expelir bolhas de ar.
    3. Coloque suavemente o rato em um condesão de roedores.
    4. As veias laterais da cauda devem ser visíveis e dilatadas. Se não, aperte delicadamente a base da cauda e mergulhe a cauda na água morna da torneira para dilatar as veias.
      NOTA: Dilatação das veias também pode ser alcançado através da colocação da gaiola do rato uma lâmpada de aquecimento e / ou em cima de uma almofada de aquecimento.
    5. Use uma limpeza de álcool para limpar a cauda. Insira a agulha na veia da cauda, bevel lado para cima, e injetar 100 μL de suspensão celular.
      NOTA: Se a agulha é inserida corretamente na veia, deve facilmente deslizar ligeiramente para a frente e para trás, e não deve haver resistência quando o desentupidor é empurrado. Injeções bem-sucedidas também devem resultar em um "flush" em que a cor azul da veia fica branca por alguns segundos após a injeção.
  4. Lentamente remover a agulha e usando uma gaze estéril, aplicar pressão para o local da injeção para parar qualquer sangramento.
  5. Devolva o mouse à sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa. Os ratos devem ser verificados para sinais da dor ou da aflição 3x semanalmente.
  6. Monitore camundongos para formação e crescimento de metástase por 3-6 semanas (linha celular e tensão do rato dependente) usando um dispositivo de imagem animal vivo in vivo (ver etapas 5 e 6).

5. Monitorar a carga metastática por fluorescência com um dispositivo de imagem animal vivo in vivo

NOTA: Não animal de imagem para fluorescência com sinal luminescente ativo.

  1. Se apenas a bioluminescência de imagens, pule para o passo 6.
  2. Ligue o dispositivo de imagem animal vivo in vivo.
  3. Configure o sistema in vivo de anestesia de imagens de animais vivos de acordo com as diretrizes do fabricante para entregar entre 1,5% e 2% de isoflurano à câmara de anestesia e à câmara de imagem.
  4. Camundongos anestesia com metástases fluorescente rotulados a partir do passo 4, colocando-os em uma câmara de anestesia e entregando 1,5-2,5% isoflurane.
  5. Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais)e login.
  6. Clique no botão Initialize e aguarde a inicialização da máquina.
  7. Mude o Campo de Visão para D.
    NOTA: Campo de Vista C também pode ser usado se uma visão mais próxima de um mouse é necessária, mas isso limita o número de ratos que podem ser imagem sinuosamente.
  8. Uma vez que o software indicou que a câmera atingiu a temperatura adequada, clique no botão Imaging Wizard, escolha Fluorescence e, em seguida, escolha o par de filtro apropriado do menu suspenso.
    NOTA: Se o fluorofofóbico que está sendo usado não é uma opção, escolha Input EX / EM e digite a excitação e emissão necessária.
  9. Coloque o mouse na câmara como descrito no passo 3.2.4.
  10. Clique em adquirir seqüência.
  11. Após a imagem, devolva o mouse à sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa.
  12. Repita o passo 5.2 e passos 5.7-5.9 com pelo menos um mouse que não contém metástases. NOTA: Este mouse será usado para quantificar e subtrair sinal de fundo durante a análise (passo 8).
  13. Imagem 2-3 vezes por semana para a duração do experimento.

6. Monitorando a carga metastática pela bioluminescência com um dispositivo vivo in vivo da imagem latente animal

  1. Ligue o dispositivo de imagem animal vivo in vivo in vivo e configure o programa da seguinte forma.
    1. Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais)e login. Clique no botão Initialize e aguarde a inicialização da máquina. Mude o Campo de Visão para D.
      NOTA: Campo de Vista C pode ser usado para uma visão mais próxima da imagem do corpo do mouse completo; no entanto, isso limita o número de ratos que podem ser imagemdes ao mesmo tempo.
    2. Para uso pela primeira vez, eite as configurações de exposição da seguinte forma: clique em Eit | Preferências | Aquisição | Auto Exposição e alterar o tempo máximo de exposição do padrão de 60 segundos para 300 segundos e clique em OK.
      NOTA: Não altere quaisquer outros parâmetros na guia de exposição automática.
  2. Configure o sistema de anestesia de acordo com as diretrizes do fabricante para entregar entre 1,5% e 2% de isoflurano à câmara de anestesia e à câmara de imagem.
  3. Certifique-se de que a câmera atingiu a temperatura adequada antes de prosseguir para o passo 6.4.
  4. Camundongos contendo metástase do passo 4, colocando-os em uma câmara de anestesia e entregando isoflurano de 1,5-2,5%.
  5. Prepare os camundongos para imagens de bioluminescência da seguinte forma.
    1. Carregue uma seringa de 1 mL com D-luciferin (30 mg/mL em D-PBS) e adicione uma agulha de calibre 30 de 1/2 polegada singada à seringa e expela bolhas de ar.
    2. Medir e registrar a massa do rato anestesiado.
    3. Contenha o rato beliscando a nuca usando os dedos do polegar e ponteiro e agarrando a cauda entre o dedo mindinho e a base da mão. Inverter o mouse em um ângulo de 45 graus, com a cabeça apontada para baixo.
    4. Insira a agulha, do lado do bislado para cima, no espaço intraperitoneal (IP) do lado esquerdo do rato. Confirme a entrada no espaço IP, retirando um pequeno volume. Não deve haver cor na base da agulha ao desenhar de volta no espaço IP.
    5. Injete o volume adequado de D-luciferin para uma dose de 150 mg/kg.
    6. Imediatamente após a administração D-luciferin, iniciar um temporizador e colocar o mouse plana em suas costas no dispositivo de imagem com o nariz no cone do nariz e garantir que 1,5-2,5% isoflurane está sendo administrado. Coloque divisores entre cada rato se a imagem de vários ratos. Certifique-se de que os ratos estejam posicionados o mais plano possível (ou seja, não se inclinando para um lado).
    7. Clique nas caixas luminescentes e de fotografia e, em seguida, clique em Adquirir no Painel de Controle de Aquisição.
  6. Adquirir continuamente imagens bioluminescentes até que o sinal de pico seja alcançado e use a imagem com o sinal bioluminescente de pico para análise.
  7. Após a imagem, devolva o mouse à sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa.
  8. Imagem 2-3 vezes por semana para a duração do experimento.

7. Quantificação do número e tamanho das metástases

NOTA: O período de tempo que as metástases são permitidas crescer devem ser determinados para cada linha de pilha e tensão do rato, e serão influenciados pelo número de pilhas injetadas.

  1. Eutanásia os ratos de acordo com diretrizes institucionais padrão.
  2. Isolar e remover os pulmões de cada rato e enxaguar em 1x PBS para remover o excesso de sangue.
  3. Delicadamente separar os pulmões em lobos.
  4. Adquirir imagens de metástases ZsGreen nos lobos em 10x em campo brilhante e fluorescência usando um estereoscópio fluorescente com um filtro de banda larga GFP (excitação 470/40x).
    NOTA: Mantenha a mesma ampliação e brilho para todas as amostras. A ampliação utilizada pode variar dependendo do tamanho, número e brilho das metástases, bem como do campo de visão para o microscópio utilizado.
  5. Use o software de análise de imagem para quantificar o tamanho e o número de metástases das imagens.
    NOTA: O protocolo para análise de imagem é dependente de software e pode ser otimizado com tumores a partir do step3. Alternativamente, conte o número de metástases em cada pulmão usando manualmente o estereoscópio fluorescente. O protocolo pode ser pausado aqui e a etapa 8 pode ser feita em qualquer ponto depois que todas as imagens in vivo foram coletadas.

8. Processamento e análise dos dados das imagens adquiridas com o dispositivo de imagem animal vivo in vivo in vivo

  1. Abra todos os arquivos de imagem para cada mouse no software de imagem.
    NOTA: Use a imagem com o sinal bioluminescente máximo para análise
  2. Certifique-se de que as unidades estão em Radiance para dados bioluminescentes e eficiência para dados fluorescentes clicando na seta no canto superior esquerdo da janela de imagem e mudando-a para a unidade apropriada.
  3. Use a imagem do último ponto de tempo para criar uma região de interesse (ROI) da seguinte forma.
    1. Clique em ferramentas ROI na janela da paleta de ferramentas. Insira um ROI clicando na seta e selecionando 1.
    2. Clique na fronteira do ROI e mova-o sobre o peito do mouse. Ajuste o tamanho do ROI para que ele cubra o baú do mouse e não exclui o sinal.
  4. Clique em medir ROIs e copiar ou digitar o número bruto em uma folha de excel.
    NOTA: Para dados bioluminescentes selecione o fluxo total (fótons/segundo), que é a soma de todo o brilho no ROI. Uma vez que as metástases não crescem necessariamente uniformemente, o fluxo total é preferido em vez de brilho médio, pois mede a soma da carga metastática. Da mesma forma, para dados fluorescentes, o % de eficiência total (luz de emissão (fótons/segundo)/luz de excitação (fótons/segundo)) deve ser usado em vez da eficiência média.
  5. Clique direito no arquivo de imagem para copiar o ROI usado na etapa 8.3 e colá-lo em cada arquivo de imagem.
    NOTA: Ao quantificar imagens fluorescentes, quantificar a mesma região em um mouse que foi imagemda sem metástase. Use este sinal como sinal de fundo e subtraia-o de cada imagem de rato contendo metástase fluorescente adquirida.
  6. Mova ROIs colados sobre a mesma região selecionada na etapa 8.3.4 para cada imagem e repita a etapa 8.4.
  7. Traçar e analisar os dados brutos da seguinte forma (ver Tabela Suplementar 2).
    1. Faça um registro10 transformação dos dados brutos para cada mouse usando a fórmula indicada(Tabela Suplementar 2)e enredo como na Figura 2D e Figura 4F. A transformação do log10 lineariza a curva de crescimento que tende a ser geométrica e minimiza a heteroscedasticidade.
    2. Usando regressão linear, calcule a inclinação da linha equipada para o registro10 dados transformados para cada mouse traçado na etapa 8.7.1(Tabela Suplementar 2). Consulte a fórmula na Tabela Suplementar 2 para se adequar à linha e calcular a inclinação em uma etapa.
    3. Traçar os valores numéricos das pistas como na Figura 2E e Figura 4G. Use o teste t de um aluno ou a Nova ANOVA de sentido único (para mais de 2 grupos) nas pistas para determinar o significado estatístico.

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Resultados

Para demonstrar a abordagem acima, realizamos um experimento de prova de conceito no qual um fator crítico de replicação, o RPA3 foi derrubado em uma linha de células carcinoma mamária samária do camundongo metastático (4T122). Enquanto o protocolo descreve a rotulagem das células com proteínas luciferase e fluorescentes antes da manipulação genética, usamos uma abordagem modificada porque os vetores RNAi também entregam ZsGreen (Figura 2A). Primeiro,...

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Discussão

Etapas críticas do método
É fundamental otimizar o número de células injetadas (passo 3) para uma determinada linha celular e tensão do mouse, pois isso pode influenciar muito o número de metástases que se formam e a duração do experimento. Se muitas células são injetadas ou as metástases crescem por muito tempo, as metástases podem ser difíceis de contar tornando os efeitos da manipulação genética difíceis de avaliar. No entanto, se muito poucas células são injetadas, poucas ou nenhuma metástases pod...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos emily norton para ajudar com infecções virais e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também Ryan Kanai para ajudar a adquirir imagens dos pulmões e Kate E. Tubbesing para ajudar com a análise de imagem das metástases verdes nos pulmões. Agradecemos ao pessoal do centro de investigação animal pelo seu apoio e pela assistência na preparação deste vídeo. Este trabalho foi apoiado por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
SDS-PAGE 10%para western blot
2,5% TripsinaGibco15090-046Tripsina para cultura de tecidos
96 placa de ensaio branca de fundo plano de 96 poçosCorning3922Para medir o sinal de luciferase e renilla em células cultivadas
Toalhetescom álcool Para esterilizar o local da injeção antes das injeções da veia da cauda
Camundongos BALB/C ( fêmea, 6 semanas)TaconicBALB-FPara colonização metastática da veia da cauda e ensaios de carga
BSA regularVWR Ameresco97061-416Para western blot
Tampão de lise celularSinalizaçãoPara coletar amostras de protien
Filtros de seringa Celltreat, PES 30mm, 0,45 μ mCelltreat40-229749-CSPara filtrar o sobrenadante viral
CO2 e câmaraPara eutanásia de camundongos
Kit de ensaio repórter de luciferase duplaPromegaE1960Para medir o sinal de luciferase e renilla em células cultivadas
Dulbecco& 39; s fosfato tampolado solução salinaHimediaTS1006para PBS
EDTAVWR97061-406Usado para diluir tripsina para cultura de tecidos
FBS 100% origem dos EUAVWR97068-085Componente de mídia de crescimento completa
Fujifilm LAS-3000 gel imagerFujifilmPara western blot
GAPDH (14C10) Rabibit mAbCell Signaling2118Para anticorpo
secundário do anti-coelho IgG da cabra do blot ocidental (H+L), soldadoThermo científico31460para o western blot
Células embrionárias humanas do rim, HEK-293FTInvitrogenR70007Linha celular usada embalando o vírus
HyClone DMEM/High clucoseGE Healthcare life sciencesSH30243,01Componente de meios de crescimento completos
Hygromycin B, grau ultra puroVWR Ameresco97064-810Para a selecção de antibióticos de células infectadas
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EADispositivosPara medir o sinal de luciferase e renilla em células cultivadas
ImagejUtilizado para análise de imagens de metástases pulmonares: limiar definido para 25 & 100
Membrana PVDF Immuno-BlotBiorad1620177Para western blot
IsofluranoPara anestesia de camundongo
IVIS Lumina XRMS Sistema de imagem in vivo (dispositivo de imagem de animais vivos in vivo)PerkinElmerCLS136340Para imagens in vivo de carga metastática
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP e filtros de campo claro)Leica MicrosystemsMicroscópio e câmera para visualização, contagem e tomada de amostras de metástases nos pulmões; ampliação de 10X, exposição de 3,5 segundos, ganho de 1,4
L-GlutaminaGibco25030-081Componente de meio de crescimento completo
Lipofectamine 3000Life technologiesL3000008Para transfecção
de repórter YAP/TAZ-TEADImagem viva 3.2 (programa de software de imagem)PerkinElmer
células de câncer de mama de camundongo IVIS, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ et al., 1992Linha celular de câncer mamário metastático de camundongo
Multi-Gauge versão 3.0Fujifilmpara quantificar a intensidade da banda de western blot
Opti-MEM (tampão de transfecção)Gibco31985-062Para embalagem de vírus e transfecção
Penicilina EstreptomicinaGibco15140-122Componente de meio de crescimento completo
Kit de ensaio de proteína Pierce BCAThermo Scientific23225Para quantificar a concentração de proteína
Mini comprimidos de inibidor de fosfatase PierceThermo ScientificA32957Adicionado ao tampão de lise celular
Mini comprimidosde inibidor de protease PierceThermo ScientificA32953Adicionado ao tampão de lise celular
Polybrene (brometo de hexadimerina)Sigma-Aldrich45-H9268Para infecção
PuromicinaSigma-Aldrich45-P7255Para seleção antibiótica de células infectadas
roedoresPara conter camundongos durante a injeção da veia da cauda
TampãoPara western blot
TAZ (V3886)Anticorpo Cell Signaling4883Para western blot
TBST bufferPara western blot
TC20 contador de células automatizadoBio-RadPara contagem
de células VectoresConsulte a Tabela 1 para obter a lista completa de vectores
VWR Microscópio de Fluorescência InvertidaVWR89404-464Para visualizar a fluorescência em Células marcadas com ZSGreen
TampãoPara western blot
XenoLight D-Luciferina K + SalPerkinElmer122799Substrato injetado em camundongos para imagens IVIS bioluminescentes in vivo
Reagente de transfecção de DNA X-tremeGENE 9 (solução lipídica para transfecção)Roche6365787001Para embalagem de vírus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074Para western blot
Gel celular de eutanásia de HRP moleculares Software para Software Restrição de de corrida SDS-PAGE de transferência ocidental

Referências

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122(2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119(2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529(2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647(2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310(2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122(2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

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