Quantificação da lixiviação metálica na cromatografia imobilizada da afinidade metálica

Resumo

Apresentamos um ensaio para a fácil quantificação de metais introduzidos em amostras preparadas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada. O método utiliza hidroxinaphthol azul como o indicador de metal colorimétrico e um espectrômetro UV-Vis como o detector.

Resumo

A contaminação de enzimas com metais lixiviadas a partir de colunas de cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) representa uma grande preocupação para os enzimologistas, já que muitas das cações comuns de di e trivalente usadas em resinas iMAC têm um efeito inibitório sobre as enzimas. No entanto, a extensão da lixiviação metálica e o impacto de vários reagentes de eluting e redução são mal compreendidos em grande parte devido à ausência de protocolos simples e práticos de quantificação metálica de transição que usam equipamentos normalmente disponíveis laboratórios de bioquímica. Para resolver esse problema, desenvolvemos um protocolo para quantificar rapidamente a quantidade de contaminação de metal em amostras preparadas usando imac como uma etapa de purificação. O método utiliza o azul hidroxinaphthol (HNB) como um indicador colorimétrico para o conteúdo de caminação metálica em uma solução de amostra e espectroscopia UV-Vis como um meio de quantificar a quantidade de metal presente, na faixa de nanomolar, com base na mudança no espectro HNB em 647 nm. Embora o conteúdo metálico em uma solução tenha sido historicamente determinado usando espectroscopia de absorção atômica ou técnicas de plasma indutivamente acopladas, esses métodos exigem equipamentos especializados e treinamento fora do escopo de um laboratório típico de bioquímica. O método proposto aqui fornece uma maneira simples e rápida para que os bioquímicos determinem o índice do metal das amostras que usam o equipamento e o conhecimento existentes sem sacrificar a exatidão.

Introdução

Desde a sua criação por Porath e colegas de trabalho¹, a cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) tornou-se um método de escolha para separar rapidamente as proteínas com base em sua capacidade de se relacionar com íons de metal de transição, como Zn²⁺, Ni²⁺,²⁺, e Co²⁺. Isso é mais comumente feito através de etiquetas de poli-histidina projetadas e agora é uma das técnicas de purificação cromatográfica mais comuns para o isolamento de proteínas recombinantes^2. O IMAC também encontrou aplicações além da purificação de proteínarecombinante como uma forma de isolar quinolonas, tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrolídeos e β-lacmas para análise de amostras alimentares³ e como um passo na identificação de marcadores de proteína sangue-soro para cânceres de fígado e pâncreas^4,5. Não surpreendentemente, IMAC também se tornou um método de escolha para o isolamento de uma série de enzimas bioenergéticas nativas^6,7,8,9,10. No entanto, a implementação bem-sucedida desses métodos de purificação para estudos sobre proteínas bioenergéticas enzimáticas ativas depende da presença de níveis insignificantes de caations metálicas lixiviadas da matriz da coluna para o eluate. As caations metálicas divalentes comumente usadas no IMAC têm significado biológico patológico conhecido, mesmo em baixas concentrações^11,12. O efeito fisiológico desses metais é mais pronunciado em sistemas bioenergéticos, onde podem ser letais como inibidores da respiração celular ou fotossíntese^13,14,15. Questões semelhantes são inevitáveis para a maioria das classes de proteínas onde metais contaminantes residuais podem interferir com as funções biológicas de uma proteína ou caracterização com técnicas bioquímicas e biofísicas.

Enquanto os níveis de contaminação de metal condições oxidantes e o uso de imidazol como eluante são tipicamente baixos^16,os isolamentos proteicos realizados na presença de agentes redutores de cisteína (DTT, β-mercaptoethanol, etc.) ou com quelantes mais fortes como histidina^17,18 ou ácido etilediátetraa (EDTA) resultam em níveis muito mais altos de contaminação de metal^19,20. Da mesma forma, uma vez que os íons metálicos nas resinas iMAC são frequentemente coordenados por grupos carboxílicos, as eluções de proteínas realizadas em condições ácidas também são susceptíveis de ter níveis muito mais elevados de contaminação de metais. O conteúdo metálico em soluções pode ser avaliado usando espectroscopia de absorção atômica (AAS) e espectrometria de massa plasmática (ICP-MS) indutivamente acoplada até um limite de detecção na faixa ppb-ppt^21,22,23,24. Infelizmente, a AAS e o ICP-MS não são meios realistas para detecção em um laboratório de bioquímica tradicional, pois esses métodos exigiriam acesso a equipamentos e treinamento especializados.

Trabalhos anteriores de Brittain^25,26 investigaram o uso de hidroxinaphthol azul (HNB) como forma de identificar a presença de metais de transição em solução. No entanto, houve várias contradições internas nos dados²⁰ e essas obras não ofereceram um protocolo adequado. Estudos de Temel et al.²⁷ e Ferreira et al.²⁸ expandiram o trabalho de Brittain com a HNB como um potencial indicador de metal. No entanto, Temel desenvolveu um protocolo que faz uso de AAS para análise de amostras, usando HNB apenas como agente quelante. O estudo de Ferreira utilizou a mudança nos espectros de absorção de HNB a 563 nm, região dos espectros HNB de corlivre que se sobrepõe fortemente aos espectros de complexos de metais HNB no pH 5.7, tornando a sensibilidade ao ensaio bastante baixa, bem como resultando em afinidade de ligação metálica relativamente fraca²⁰. Para abordar problemas em nosso próprio laboratório com a lixiviação Ni²⁺ da IMAC, expandimos o trabalho feito pela Brittain^25,26 e Ferreria²⁸ para desenvolver um ensaio fácil capaz de detectar níveis de nanomolar de vários metais de transição. Mostramos que a HNB liga níquel e outros comuns para metais IMAC com afinidades de ligação subnamolar e formam 1:1 complexo em uma ampla gama de valores de pH²⁰. O ensaio aqui relatado é baseado nestes resultados e utiliza mudanças do absorveance no espectro de HNB em 647 nm para o quantification do metal. O ensaio pode ser realizado na faixa de pH fisiológico usando amortecedores comuns e instrumentação encontrada em um laboratório típico de bioquímica usando detecção colorimétrica e quantificação de complexos de corante metálico e a mudança associada na absorção do corante livre quando se liga ao metal.

Protocolo

1. Preparação de componentes de ensaio

1. Determine as frações de cromatografia a serem atentas usando absorção óptica a 280 nm ou métodos alternativos de quantificação de proteínapara identificar as frações enriquecidas com proteínas.
   NOTA: Para este trabalho, usamos uma matriz de diodo UV-Vis espectrômetro. Para aumentar a entrada, um leitor de placa capaz de medir a absorção UV-Vis pode ser usado.
2. Preparação dos componentes necessários do ensaio
   1. Prepare ou obtenha 10-100 mM buffer ("Buffer de amostra") com um pH entre 7 e 12.
      NOTA: Amortecedores bioquímicos comuns, como Tris, HEPES, MOPS e fosfato em pH neutro ou básico são todos aceitáveis para o ensaio. Tricine e histidina podem ser usados, mas exigirão curvas de calibração, pois ambos substancialmente chelate íons de metal. Um exemplo de calibração para histidina é mostrado na referência²⁰.
   2. Prepare uma solução de 12% w/v (20 vezes concentrada) de dispersão de hidroxinaphthol azul (HNB) no Buffer de amostra usando 120 mg de reagente HNB para cada mililitro de solução de estoque preparada.
      CUIDADO: A exposição de HNB ao olho pode causar sérios danos e irritação. A proteção ocular deve ser usada ao manusear hnb e as mãos devem ser lavadas cuidadosamente após o manuseio.
      NOTA: HNB é vendido como uma dispersão em KCl por fornecedores principais de reagents científicos. Como tal, a concentração real na solução variará de diferentes fabricantes, lotes, e onde na garrafa a dispersão HNB é retirado. Idealmente, uma absorção entre 0,5-0,8 em 647 nm após 20 vezes a diluição do estoque deve ser alcançado.

2. Preparação e medição da amostra

1. Preparação do espectrômetro para coleta de dados
   1. Ligue e aqueça o espectrômetro UV-Vis. Defina o espectrômetro para coletar dados em 647 nm.
      NOTA: Se o espectrômetro permitir, também coletar dados em 850 nm, ou algum outro comprimento de onda sem alterações significativas relacionadas com os espectros de corantes e corantes, seja usado para uma correção de linha de base.
   2. Em branco o espectrômetro usando o buffer de amostra.
      NOTA: Quartzo ou cuvettes de plástico descartáveis podem ser usados. Cuvettes de quartzo são preferidos para análise quantitativa, pois permitirão maior precisão e precisão sobre cuvettes de plástico descartáveis. No entanto, as cuvettes de plástico bloqueiam a luz UV, que pode estar presente nos feixes de medição de alguns espectrômetros de matriz de diodo. A exposição de HNB à luz UV intensa causa degradação notável do corante e uma diminuição de absorção lenta indesejada que pode ser confundida com a ligação de metal lento (por exemplo, ver a Figura 1 em Informações de Apoio à Referência 20).
2. Medida de preparação e absorção do controle
   1. Prepare uma solução de controle contendo 50 μL de ações HNB por mililitro de volume total de ensaios. Para garantir uma boa mistura de todas as amostras, pipeta os pequenos volumes em primeiro lugar, em seguida, adicione o buffer de amostra seguido por mistura por pipetting. A solução diluída de HNB deve ser preparada fresca mas os estoques de HNB podem ser armazenados em 4 °C e protegidos da luz por semanas sem degradação significativa.
   2. Permita que o controle incubar por um mínimo de 3 min à temperatura ambiente.
      NOTA: Um tempo de incubação mais longo pode ser necessário para amostras no pH alcalino ou na presença de fosfato devido à formação de complexos metálicos pouco solúveis, resultando em equilíbrio mais lento.
   3. Medir e registrar a absorção em 647 nm para a amostra de controle.
3. Medida de preparação e absorção de amostras
   1. Prepare as amostras de ensaio misturando 50 μL de caldo hnb com 950 μL de frações de proteína devidamente diluídas com o buffer de amostra.
      NOTA: Uma vez que os níveis de contaminação do metal relatados na literatura variam em um fator de mais de 1000, dependendo das condições de elução^16,20, pode ser necessário tentar algumas diluições das frações de proteína sumed com o Buffer amostra (ver passo 1.2.1 acima) para alcançar mudanças de absorção dentro da faixa dinâmica do ensaio.
      CUIDADO: Níquel e outros metais usados no IMAC são conhecidos irritantes da pele, suspeitos de serem cancerígenos, e são capazes de danificar os rins e sangue após exposição prolongada. Luvas e proteção ocular devem ser usadas no manuseio de amostras de proteína preparadas com IMAC.
   2. Permita que a amostra incuba por um mínimo de 3 min à temperatura ambiente e medir absorveções em 647 nm.
      NOTA: O passo limitante do ensaio em termos de tempo investido é a etapa de incubação. Os dados para este papel foram coletados usando um único cuvette de quartzo que fosse lavado com cuidado entre cada amostra. Mesmo com o tempo de lavagem adicionado e preparação do estoque HNB, coleta de dados para 14 amostras e o controle levou aproximadamente uma hora e meia e, como tal, o protocolo pode ser facilmente concluído sem a necessidade de interrupção.
   3. Repita os passos 2.3.1 e 2.3.2 para cada fração que será medida.
      NOTA: Se vários cuvettes serão usados para várias amostras, as amostras devem ser preparadas de uma forma que permita tempo de incubação comparável e exposição à luz ambiente.

3. Quantificação de metal

1. Determinar a concentração de metal em cada amostra
   1. Encontre a diferença de cada absorção da amostra em 647 nm do controle de HNB.
   2. Determinar a concentração de metal (em μM) usando a fórmula abaixo:
      
      
      
      onde df é o fator de diluição para a fração de ensaio, ΔAbs₆₄₇ é a mudança de absorção em 647 nm, 3.65x10^-2 representa o coeficiente de extinção de HNB (ε =36.5 mM^-1·cm^-1 ver Referência²⁰ para mais detalhes) e l é o caminho óptico da cuvette em cm.

Resultados

O espectro de HNB livre em pH neutro (linha preta) e espectros representativos de frações afiguradas para Ni²⁺ do isolamento de MSP1E3D1²⁹ são mostrados na Figura 2. Uma série bem-sucedida do ensaio deve demonstrar uma absorção diminuída em 647 nm comparado ao controle de HNB, que corresponde à formação de complexos de HNB na presença de um metal da transição. Um ensaio falhado seria indicado por um aumento na absorção em 647 nm. Alternativamente, mais de 9...

Discussão

A detecção colorimétrica de metais usando HNB fornece uma maneira simples de quantificar o grau de contaminação por proteínas por íons metálicos de transição de resinas IMAC. Como estabelecemos em Ref. 20, o Ni²⁺ se liga à HNB com 1:1 stoichiometria e a constante de dissociação para as mudanças complexas de Ni-HNB com pH. No entanto, o complexo K_d está na faixa sub-nM para todos os valores recomendados (7-12) de pH. Em termos práticos, isso significa que todos os Ni^{2 +} em todas as frações...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2xYT caldo	Fisher Scientific	BP9743-500	mídia para crescimento de E.coli
HEPES, ácido livre	BioBasic	HB0264	tampão alternativo
Resina HisPur Ni-NTA Thermo	Scientific	88222
Hidroxinaftol azul disoidum sal	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazol	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazol	BioBasic	IB0277
MOPS, ácido livre	BioBasic	MB0360	tampão alternativo
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	S271-500
Fosfato de sódio	Fisher Scientific	S369-500	tampão alternativo
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500