Aqui, apresentamos um método de triagem modificado que pode ser amplamente usado para triagem rapidamente de supressores de RNA em patógenos vegetais.
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Artigo de método
Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais
Neste artigo
Resumo
Resumo
O silenciamento de RNA é um mecanismo evolutivamente conservado e específico de regulação genética em eucalinos. Vários patógenos vegetais desenvolveram proteínas com a capacidade de inibir o caminho de silenciamento de RNA da planta hospedeira. Ao contrário das proteínas causadoras de vírus, apenas várias proteínas de efeito ou de efeito secreto mostraram a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em patógenos bacterianos, oomycete e fúngicos, e as funções moleculares da maioria dos efetivadores permanecem em grande parte desconhecidas. Aqui, descrevemos em detalhes uma versão ligeiramente modificada do ensaio de co-infiltração que poderia servir como um método geral para observar o silenciamento de RNA e para caracterizar proteínas ou fetos ou fetos segregados por patógenos vegetais. Os principais passos da abordagem são escolher as folhas saudáveis e totalmente desenvolvidas, ajustar a cultura das bactérias à densidade óptica apropriada (OD) a 600 nm, e observar a fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP) no momento ideal no infiltrado sai para evitar omitir efetores com fraca atividade de supressão. Este protocolo melhorado contribuirá para uma triagem rápida, precisa e extensiva de supressores de silenciamento de RNA e servirá como um excelente ponto de partida para investigar as funções moleculares dessas proteínas.
Introdução
Nas últimas duas décadas, a aceleração no sequenciamento de genomas de microrganismos que causam doenças vegetais levou a uma lacuna de conhecimento cada vez maior entre informações de sequência e as funções biológicas de proteínas codificadas1. Entre as moléculas reveladas por projetos de sequenciamento estão moléculas que suprimem imunidade inata e facilitam a colonização do hospedeiro; esses fatores são secretados por patógenos vegetais destrutivos, incluindo bactérias, nematoides e micróbios feudos. Para responder a essas ameaças, as plantas hospedeiras desenvolveram novos receptores que reconhecem esses efeitos, permitindo a restauração da....
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Protocolo
NOTA: Todas as etapas do procedimento devem ser realizadas à temperatura ambiente (TR).
ATENÇÃO: Deposite todos os meios de comunicação contendo micróbios patogênicos, bem como as plantas e tecidos vegetais utilizados no ensaio, nos recipientes de resíduos apropriados e autoclave antes de descartar.
1. Preparação de construções plasmáticas contendo efeitos putativos
- Selecione efeitos secretos putativos que são altamente expressos durante a infecção, conforme determinado pelo sequenciamento de RNA (RNA-Seq), e ainda pela técnica quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR).
- Determine o site do d....
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Resultados
Acima, descrevemos o procedimento passo a passo para um melhor ensaio de triagem para avaliar a atividade RSS dos effectores P. sojae RxLR. Ao todo, o experimento leva de 5 a 6 semanas. Posteriormente, os RSSs identificados pelo ensaio podem ser ainda mais caracterizados em termos de função e mecanismo molecular. Como exemplo de nossa abordagem, usamos o supressor P. sojae RxLR do Silencing RNA 1 (PSR1), que é secretado e entregue em células hospedeiras através da hausto.......
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Discussão
O silenciamento de RNA é um mecanismo de defesa chave empregado pelas plantas para combater patógenos virais, bacterianos, oomycete e fúngicos. Por sua vez, esses micróbios evoluíram silenciando proteínas supressoras para neutralizar o silenciamento antiviral, e esses RSSs interferem em diferentes etapas da via de silenciamento rna22,23. Vários ensaios de triagem foram desenvolvidos para identificar rsss10.
Aqui.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subsídios do "Programa Shuguang" da Fundação de Desenvolvimento educacional de Xangai e da Comissão Municipal de Educação de Xangai, do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da Chave Nacional da China ( 2018YFD0201500), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31571696 e 31660510), o Programa Mil Talentos para Jovens Profissionais da China e a Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (18DZ2260500).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-morfolifelistanossulfônico (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3- (N-morfolino) ácido propanossulfônico (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosiringona (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Indução de Ágar |
| AgrobacteriumSigma-Aldrich | A1296-1KG | LB médio | |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Eletroforese |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Imagem |
| Bacto Triptona | BD Biosciences | 211705 | LB médio |
| Extração | de levedura BactoBD Biosciences | 212750 | LB câmera média |
| Nikon | D5100 | Fotografia | |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Módulo de detecção quimioluminescente componente de kits dafa | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Detecção de luminescência |
| Cloranfenicol | Amresco | 0230-100G | Antibióticos |
| Kit de clonagem de uma etapa ClonExpress II | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Tampão de hibridização |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Extração de plasmídeo |
| EasyPure Quick Gel Extraction | TransGen Biotech | EG101-02 | Extração de gel |
| EDTA sal dissódico di-hidratado | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electroforese Fonte de Alimentação | LiuYi | DYY6D | Eletroforese de ácido nucleico. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Gel de digestão vetorial |
| Sistema de imagem | Tanon | Tanon3500 | Imagem |
| Gentamicina | Amresco | 0304-5G | Antibióticos |
| Sulfato de canamicina | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibióticos |
| LR Clonase II enzima | Invitrogen | 11791020 | reação LR |
| Membrana de borrão de nitrocelulose 0,45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south kit de rotulagem de DNA primário aleatório de biotina | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Rotulagem de biotina |
| PCR Termocicladores | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Musgo de turfa | PINDSTRUP | Ouro Escuro + argila | Plantas |
| Peters Fertilizante solúvel em água | ICE | Peter Fertilizante Profissional 20-20-20 | Phanta |
| Max Super-Fidelidade DNA Polimerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzima |
| Rifampicina | MP Biomedicals | 219549005 | Antibióticos |
| Corante de Carregamento de Gel de RNA (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | Corante de Carregamento de Gel de RNA |
| Acetato de Sódio Hidratado | Amresco / VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Cloreto de sódio | Amresco | 0241-10KG | LB médio |
| citrato trissódico | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagente | Invitrogen | 15596018 | reagente de isolamento de RNA |
| Lâmpada UV | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observação |
| UVP Hybrilinker Forno | Analytik Jena | OV2000 | Norte |
Referências
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <....
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Reimpressões e permissões
