O DNA 3D multicolor FISH representa uma ferramenta para visualizar loci múltiplogenômico dentro de núcleos preservados em 3D, definindo inequivocamente suas interações recíprocas e localização dentro do espaço nuclear em um único nível celular. Aqui, um protocolo passo a passo é descrito para um amplo espectro de células primárias humanas.
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Artigo de método
Ferramenta de peixe de DNA Multicolor 3D para estudar arquitetura nuclear em células primárias humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma questão importante na biologia celular é a organização genômica dentro do espaço nuclear e como a arquitetura da cromatina pode influenciar processos como expressão genética, identidade celular e diferenciação. Muitas abordagens desenvolvidas para estudar a arquitetura 3D do genoma podem ser divididas em duas categorias complementares: tecnologias baseadas em captura de conformação cromossa (C-technologies) e imagem. Enquanto o primeiro é baseado na captura da conformação cromossomo e interações de DNA proximal em uma população de células fixas, este último, baseado na fluorescência de DNA na hibridização situ (FISH) em núcleos preservados em 3D, permite a visualização contemporânea de loci múltiplo em um único nível celular (multicolor), examinando suas interações e distribuição dentro do núcleo (3D multicolor DNA FISH). A técnica do DNA 3D multicolor FISH tem uma limitação de visualizar apenas alguns loci pré-determinados, não permitindo uma análise abrangente da arquitetura nuclear. No entanto, dada a robustez de seus resultados, o DNA FISH multicolorido 3D em combinação com microscopia 3D e reconstrução de imagens é um método possível para validar resultados baseados em tecnologia C e estudar inequivocamente a posição e organização de loci específico em um único nível celular. Aqui, propomos um método passo a passo de Peixe sna multicolorido 3D adequado para uma ampla gama de células primárias humanas e discutimos todas as ações práticas, passos cruciais, noções de imagem 3D e análise de dados necessárias para obter uma multicolor 3D bem sucedida e informativa Peixe de DNA em diferentes contextos biológicos.
Introdução
Os eucalitos mais altos precisam condensar sistematicamente e compactar uma enorme quantidade de informações genéticas no espaço 3D do núcleo1,2,3,4. Hoje, sabemos que o genoma é espacialmente encomendado em compartimentos e domínios topologicamente associados5 e que os múltiplos níveis de dobramento de DNA geram contatos entre diferentes regiões genômicas que podem envolver a formação de loop de cromromatina6,7. O looping dinâmico 3D da cromromatina pode infl....
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Protocolo
1. Procedimentos de preparação e rotulagem de sondas de DNA com tradução de nick
- Cromossomos artificiais bacterianos purificados e limpos (BACs), plasmídeos ou produtos PCR com kits específicos (Tabela de Materiais),resuspendem no ddH2O, verifiquem por eletroforese em gel de agarose e quantificar.
- Realize a tradução de nick em 1,5-2 μg de DNA a partir da etapa 1.1 em um volume final de 50 μL misturando todos os reagentes em um tubo de DNA de baixa ligação de 0,5 mL de acordo com a Tabela 1.
NOTA: Sondas diretamente rotuladas podem melhorar a relação sinal/ruído. Kits para produzir sondas indiretas e d....
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Resultados
O método de DNA 3D multicolorido FISH descrito neste artigo permite a visualização contemporânea de diferentes loci genômicos dentro de núcleos 3D preservados (Figura 1B). Este protocolo permite a medição de distâncias entre alelos, e diferentes loci genômicos para avaliar sua proximidade espacial, e avaliar sua localização dentro do espaço nuclear (por exemplo, a distância loci do centroide ou da periferia dos núcleos)16. No entanto, existem muitas e.......
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Discussão
O método atual descreve um protocolo passo a passo para executar peixes de DNA multicoloridos 3D em uma ampla gama de células primárias humanas. Embora o DNA FISH seja uma tecnologia em grande uso, o Peixe de DNA multicolorido 3D em núcleos interfásicos 3D preservados ainda é difícil de executar em muitos laboratórios, principalmente devido às características das amostras utilizadas23,24.
A tradução de nick de sonda é um passo fundamen.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem a assistência técnica do INM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milão, Itália), em particular C. Cordiglieri, para assistência durante imagens 3D multicolor DNA FISH Aquisição. Este trabalho tem sido apoiado pelas seguintes subvenções ao B.B.: Programa principal italiano epigen, Associação Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e Giovani Ricercatori, Ministério da Saúde italiano (GR-2011-02349383). Este trabalho tem sido apoiado pela seguinte concessão ao F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, bolsa nR 2018-0321).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de 24 poços | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| Placas de 6 poços | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenina 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoetanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotina 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (albumina de soro bovino) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-fenilidol) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Ácidos desoxirribonucléicos fita única de testículos de salmão | Sigma | D7656 | |
| Sulfato de dextrano (pó) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenina 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polimerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A / C / G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Etanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Solução de formaldeído | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamida | Sigma | F9037 | |
| Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glicerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glicogênio | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Humano Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulina Humana | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (acetato de sódio, pH 5,2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldeído | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Solução de poli-L-lisina | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & Kit Combo de Purificação PCR | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse | cocktail Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Citrato Trissódico | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
Referências
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-rang....
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Reimpressões e permissões
