Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.
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Artigo de método
Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Descrevemos uma técnica para rotulagem retrógrada de neurônios motores em Drosophila. Usamos um corante lipofílico dissolvido em óleo e entregamos uma pequena gota para uma preparação de filé embrionário por um microinjetor. Cada neurônio motor cuja membrana é contatada pela gotícula pode então ser rapidamente rotulado. Neurônios motores individuais são continuamente rotulados, permitindo que detalhes estruturais finos sejam claramente visualizados. Dado que os corantes lipofílicos vêm em várias cores, a técnica também fornece um meio para obter neurônios adjacentes rotulados em multicolor. Esta técnica de rastreamento é, portanto, útil para estudar morgênese neuronal e conectividade sináptica no sistema de neurônios motores de Drosophila.
Introdução
O sistema de neurônio motor embrionário de Drosophila oferece um poderoso modelo experimental para analisar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)1,2,3. O sistema de neurônios motores é passível de técnicas bioquímicas, genéticas, de imagem e eletrofisiológicas. Usando as técnicas, manipulações genéticas e análises funcionais podem ser realizadas no nível dos neurônios motores individuais2,4,5,6.
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Protocolo
1. Equipamentos e Suprimentos
- Materiais para a coleta de embriões e treinamento de adultos para pôr ovos
- Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mL e abrindo um buraco na tampa para definir um filtro de malha com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)entre o tubo e a tampa.
NOTA: Alternativamente, filtros celulares com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)podem ser usados para a etapa de filtragem da coleta de embriões. - Faça pratos de ágar com premix de ágar de uva(Mesa de Materiais)de acordo com as instruções listadas. Resumidamente, mexa suavemente 1 pacote da mistura de pó em....
- Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mL e abrindo um buraco na tampa para definir um filtro de malha com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)entre o tubo e a tampa.
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Resultados
Uma imagem representativa dos neurônios motores aCC e RP3 é mostrada na Figura 3C para demonstrar a rotulagem multicolorida dos neurônios motores a 15 h AEL. Suas morfologias dendríticas são em grande parte invariáveis entre embriões. O padrão de coloração obtido com anticorpo anti-HRP é mostrado em cinza. Uma pequena gota de DiO ou DiD foi depositada no NMJ do músculo 1 ou 6/7, respectivamente. A Figura 4 demonstra a capacidade de medir quantit.......
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Discussão
O uso de rotulagem de corante para estudar morfologia neuronal tem várias vantagens sobre as técnicas genéticas de rotulagem de células. A técnica de rotulagem de corante pode minimizar a quantidade de tempo necessário para rotular e imaginar as morfologias dos neurônios motores. O processo de rotulagem de corante é bastante rápido, pois é preciso menos de 2 h e nos permite definir o contorno das projeções neuronais. Como alternativa, pode-se visualizar o neurônio motor aCC escolhendo uma linha GAL4 que expressa o fator .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do Laboratório Kamiyama por comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 NS107558 (para M.I., K.B., e D.K.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lente objetiva 10x | Nikon | Plan | |
| Lente de imersão em água 40x | Nikon | NIR Apo | |
| Tubo capilar | Frederick Haer& Co | 27-31-1 | |
| Microscópio confocal | Andor | N/A | Libélula Unidade confocal de disco giratório |
| Vidro de cobertura | Corning | 22x22 mm Quadrado # | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Microscópio de dissecação | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Fita Dupla Face | Scotch | 665 | |
| Dow Corning Graxa de Alto Vácuo | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Fórceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Gaiola de coleta de ovos | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | descontinuado | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Software de processamento de imagem | |
| Micromanipulador | Sutter | MP-225 | |
| Chanfrador de micropipetas | Sutter | BV-10-B | |
| Extrator de agulhas | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Ágar Uva em Pó Pacotes de Pré-mistura FlyStuff | 47-102 | ||
| Filtro de Rede | Nylon Millipore | ||
| Paraformaldeído 16% Solução, Microscopia Eletrônica de grau EM | Ciências | 15710 | Qualquer grau EM |
| PBS | Roche | 11666789001 | Vendido em sigmaaldrich, solução 10x em caixa |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Agente umectante |
| Microscópio de fluorescência vertical | Nikon | N/A | Eclipse Ci com fonte de luz LED |
| Fita isolante de vinil | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Levedura | FlyStuff | 62-103 | Levedura seca ativa (RED STAR) |
Referências
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new te....
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Reimpressões e permissões
