Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

Resumo

Para visualizar e quantificar as características internas dos biofilmes candida albicans, preparamos amostras intactas fixas que são esclarecidas pela correspondência de índice simétrico. Em seguida, a microscopia de secção óptica pode ser usada para obter dados de imagem tridimensionais, embora a espessura total do biofilme.

Resumo

O fungo microbiano Candida albicans pode sofrer uma mudança da colonização commensal para a virulência que está fortemente correlacionada com sua capacidade de mudar do crescimento da forma de levedura para o crescimento hiflárico. As células que estão neste processo tornam-se aderentes às superfícies, bem como umas às outras, com o desenvolvimento resultante de uma colônia de biofilmes. Isso geralmente ocorre não apenas em superfícies de tecido mucosa em infecções por leveduras, mas também em implantes médicos, como cateteres. É sabido que as células biofilme são resistentes a drogas antifúngicas, e que as células que se desfazem do biofilme podem levar a infecções sistêmicas perigosas. Os biofilmes variam de fortemente translúcidos a opacos devido à heterogeneidade refrativa. Portanto, biofilmes fúngicos são difíceis de estudar por microscopia óptica. Para visualizar características estruturais internas, celulares e subcelulares, esclarecemos biofilmes intactos fixos por troca de solventes stepwise a um ponto de correspondência ideal do índice de refração. Para os biofilmes de C. albicans, o esclarecimento suficiente é alcançado com salicilato de metila (n = 1,537) para permitir microscopia confocal do ápice à base em biofilmes de 600 μm com pouca atenuação. Neste protocolo de visualização delineamos refractometria de contraste de fase, crescimento de biofilmes laboratoriais, fixação, coloração, troca de solventes, configuração para microscopia de fluorescência confocal e resultados representativos.

Introdução

Candida albicans é um fungo microbiano que é tipicamente commensal em humanos. É de interesse fundamental para os biólogos porque o organismo tem múltiplas morfologias. Por exemplo, em resposta a certas pistas ambientais ou estressores, as células brotantes em forma de levedura mudarão para o crescimento filamentoso como cadeias septuadas de células altamente alongadas conhecidas como hifas. A transição é importante como exemplo de expressão faiotípica de uma mudança entre um programa de expressão genética unicelular e multicelular. Da mesma forma, C. albicans é de interesse biomédico porque o organismo é um patógeno oportunista bem conhecido. É responsável por infecções de levedura mucosa, como candidíase oral, infecções genitourinárias e causa de infecções invasivas ou sistêmicas perigosas em pacientes imunologicamente enfraquecidos.

O potencial de virulência deste organismo está intimamente ligado aos seus múltiplos morfotipos e outros aspectos de sua versatilidade genética^1,2,3,4. A extensão do tubo germinal, o primeiro estágio visível da transição para o crescimento hifásal, ocorre com rapidez suficiente para permitir que as células c. albicans engolidas se rompam dos fagócitos e, assim, escapem de uma fase inicial da resposta imune celular do hospedeiro⁵. Além disso, a filamento é precedida e acompanhada por um grande aumento na adesão celular-célula e celular-superfície que se deve à expressão regulada de várias classes de proteínas da parede celular conhecidas como adesinas^6,7,8,9. uma grande variedade de condições, a combinação de adesão e filamento sustrata uma mudança dramática do crescimento planctônico, unicelular para o crescimento colonial associado à superfície que forma um biofilme. Os biofilmes C. albicans podem desenvolver-se em dispositivos médicos implantados comuns, como cateteres venosos. Infecções disseminadas podem resultar quando esses biofilmes começam a brotar células em forma de levedura e despejá-las em sangue circulante. Vários estudos têm demonstrado que as células biofilme são mais resistentes a drogas antifúngicas do que as células planctônicas^10,11, que podem ser devido, em parte, ao metabolismo reduzido¹². Além disso, a alta adesão global de um biofilme pode fornecer a ancoragem necessária para o crescimento invasivo eficiente de hifas no tecido hospedeiro¹.

O esclarecimento óptico de biofilmes de C. albicans por correspondência de índice sico teve um grande impacto em nossa capacidade de visualizar a estrutura desta comunidade microbiana e descobrir relações entre expressão genética e fenótipo. Biofilmes cultivados em laboratório em superfícies de teste meio de cultura líquida por 48 h aparecem como um revestimento esbranquiçado o suficiente e espesso o suficiente para ser opaco (Figura 1). Portanto, muitas características peletípicas interessantes do biofilme estão escondidas da vista. Os biofilmes do tipo selvagem de 24 horas cultivados em YPD, RPMI-1640 ou spider com 37 °C variam até 300 μm de espessura, com 48 h biofilmes frequentemente atingindo 500 μm. A opacidade é devido à dispersão de luz, que surge da heterogeneidade refrativa: a parede celular fúngica é mais refrativa do que o meio circundante, e o citoplasma ligeiramente mais refrativo que a parede celular. A alta densidade óptica resultante de um biofilme nativo obscurece todas as estruturas com mais de 30 μm de profundidade quando vista com um microscópio convencional ou mesmo um scanner confocal(Figura 2). No entanto, um grande grau de esclarecimento pode ser alcançado infiltrando-se em biofilmes fixos com um líquido de alto índice de refração que corresponde aproximadamente à refratividade dos principais constituintes celulares. Após o esclarecimento, a imagem na resolução submicron pode ser realizada por microscopia confocal através de toda a espessura de quase qualquer biofilme C. albicans ¹³. Em espécimes do tipo selvagem, é fácil ver que os biofilmes consistem de hifas longas emaranhadas, aglomerados de células de forma de levedura brotadas ou células pseudo-hyphal, espaços vazios, e alguma quantidade de matriz extracelular. Além disso, os biofilmes geralmente são estratificados, mostrando diferenças morfológicas espacialmente variantes no tipo celular, densidade celular e a presença de células brotando ou ramificadas. Muitas variações em uma ou mais dessas características têm sido observadas em biofilmes desenvolvidos por cepas mutantes^14,15. Além disso, as cepas dos repórteres mostram in situ diferenças espaciais na expressão genética^16,9,13. O surpreendente grau de esclarecimento obtido com esta abordagem relativamente simples e barata também torna possível ver que muitos biofilmes incluem hifas apical e hifas invasivas basais que se estendem até distâncias milimétricas.

Neste protocolo de visualização, demonstramos a fixação, rotulagem, esclarecimento e imagem de um biofilme C. albicans usando um simples marcador de parede celular como uma mancha. A origem da presente versão do protocolo é a melhor clareza observada quando os biofilmes fixos de formaldeído foram infiltrados com 97% de metacrilato glicol (GMA), que foi então polimerizado para incorporar o biofilme em um plástico duro com um índice de refração moderadamente alto (n = 1,49). Em seguida, utilizou-se a microscopia de contraste de fase convencional e uma série de líquidos de referência de índice refrativo para determinar com mais precisão o ponto de reversão de contraste (máxima transparência) do biofilme (Figura 3). Para os biofilmes de C. albicans isso ocorreu perto de n = 1,530, que foi surpreendentemente alto dado que uma estrutura densa de proteína, como a queratina capilar, é apenas um pouco mais refrativa (1,54-1,55). Embora esteja na extremidade superior da faixa ideal na Figura 3,adotamos o salicilato de metila (óleo de wintergreen, n = 1,537) no protocolo atual porque tem sido usado há muito tempo como agente esclarecedor para microscopia em embriologia e histologia, tem baixa toxicidade e baixa pressão de vapor, e deu excelentes resultados em nossos ensaios usando imersões ópticas de óleo moderado-NA.

Quatro pontos devem ser feitos aqui:

(1) Com poucas exceções, a situação ideal na microscopia é que o índice de refração da amostra deve ser igual ao índice de refração do fluido de imersão da lente objetiva^17,18,13. Para estudos tridimensionais (3D) de imagem onde o foco profundo é necessário, isso é sempre importante.

(2) Nosso resultado experimental para a limpeza ideal (n = 1.525-1.535) é ligeiramente superior aos óleos de imersão padrão (n = 1.515, 1.518) e, portanto, viola o ponto (1), e, portanto, introduz uma fonte de aberração esférica ao usar a óptica padrão de imersão do óleo. Uma solução para este problema é o uso de um objetivo projetado para um índice de imersão na faixa mais alta. Devido ao ressurgimento do interesse por imagens de amostras limpas, objetivos especiais com a correção necessária estão se tornando disponíveis. A outra solução é ajustar o índice do meio esclarecedor para 1.515 ou 1.518 pela adição de uma pequena quantidade de butanol (n = 1.399) para o desempenho ideal de imersão do óleo, e aceitar a clareza ligeiramente degradada.

(3) A microscopia de biofilmes intactos (e outros espécimes nesta escala) requer uma distância de trabalho significativa para acomodar a espessura da amostra. Esta é uma grande consideração prática. Uma longa distância de trabalho limita a óptica a uma abertura numérica moderada (NA = 0,6-1,25), o que limita a resolução, mas também limita a gravidade da aberração esférica.

(4) O índice de refração ideal para esclarecimento pode ser diferente para outros tipos de amostras fixas. As amostras devem ser testadas em conformidade utilizando contraste de fase e uma série de líquidos de referência de índice refrativo, conforme mostrado na Figura 3.

Protocolo

1. Crescimento das Culturas de Biofilmes

ATENÇÃO: Candida albicans é um patógeno humano. Em algumas instituições, a cultura desse organismo requer a contenção de BSL-2.

1. Estique a tensão selecionada em uma placa de ágar extrato de levedura-peptone-dextrose (YPD) e cresça 48 h a 30 °C.
2. Selecione colônias individuais da placa para inocular 5 mL de meio YPD em tubos de cultura de 15 mL para crescimento aeróbico durante a noite (rotor de carrossel, 52-55 rpm) a 30 °C.
3. Determine a densidade celular usando uma diluição de 40 a 50 vezes da cultura noturna. Calcule o fator de diluição necessário para levar a densidade celular a 3 x 10⁶ células/mL para substratos de silicone, ou 0,6-1,2 x 10⁶ células/mL para superfícies de vidro de cobertura tratadas com concanavalin-A (ConA) ou aglutinina de germes de trigo (WGA) (ver Discussão).
4. Para o crescimento do biofilme em uma placa de 12 poços(Figura 1),dispense 2,0 mL de meio de filamento estéril em cada poço e aqueça a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada. Uma variedade de meios induzirá filamentos, mais fortemente a uma temperatura elevada (37 °C) e com soro adicionado. Recomenda-se o soro bovino fetal (FBS). As mídias recomendadas são YPD, Spider-Mannitol ou RPMI-1640.
5. Com pinças estéreis, coloque um substrato preparado em cada poço na placa aquecida e desaloque bolhas. Adicione o inóculo da cultura noturna para alcançar a densidade celular recomendada na etapa 1.3 em cada poço. Um poço sem inóculo serve como um espaço visual e controle contra a contaminação.
6. Coloque a placa em uma batedeira orbital de 60 rpm em uma incubadora de ar umidificada de 37 °C por 90 min para dar tempo para a adesão celular. Após 90 min, remova as células médias e não ligadas, lave com soro retumado médio ou fosfato tamponado (PBS) e coloque substratas inoculados em pratos de cultura ou outra placa multibem contendo meio de filamento pré-aquecido. Com placas multiwell, é muito conveniente usar uma segunda placa para a etapa de lavagem e uma terceira placa com 2,0 mL de meio pré-aquecido por poço para receber os substratas inoculados lavados. Esterilize a pinça antes de cada transferência.
7. Retorne a placa para a incubadora de ar ambiente umidificada de 37 °C e cresça os biofilmes até 48 h com mistura orbital de 60 rpm para aeração. Deve haver pouco crescimento plânctônico em cada cultura, a menos que o biofilme em desenvolvimento esteja derramando células em forma de levedura. Um biofilme cultivado desta forma é mostrado na Figura 1.

2. Processamento de amostras para imagem

ATENÇÃO: Os fixadores de aldeído são voláteis e perigosos. Prepare diluições fixas em um capuz de fumaça, não em um armário de biossegurança. Não coloque fixações em incubadoras usadas para células vivas. Trabalhe com fixações diluídas em pratos cobertos em um capô de fumaça ou uma área de bancada bem ventilada. Descarte os fixadores e as soluções de lavagem pós-fixação como resíduos perigosos.

1. Prepare fixação fresca, 4% de formaldeído ou paraformaldeído na PBS, opcionalmente com até 2% de glutaraldeído. A formalina diluída em 4% pode ser usada para trabalhos de rotina.
   NOTA: O glutaraldeído, em particular, aumentará a autofluorescência da banda larga e poderá atenuar a fluorescência de etiquetas expressíveis, como o dTomato.
2. Remova o meio de cultura da amostra e substitua por PBS para diluir proteínas sésoras, ou transfira o biofilme em seu substrato para PBS, por vários minutos.
3. Transfira o espécime para fixação e coloque o prato coberto em uma batedeira orbital lenta por 20 min. Prolongue o período de tempo ao processar espécimes mais grossos (ver Discussão). Volume fixo suficiente deve ser adicionado a cada prato para imergir todo o crescimento do biofilme, incluindo qualquer um nos lados internos do prato.
4. Retire o fixador e recarregue o prato com PBS para lavar o fixador residual. Descarte o fixador como resíduoperigoso. Repita várias lava-jatos de curto prazo, depois lava mais para dar tempo para que o fixador residual se difunde para fora do biofilme ou bloco de ágar. O período de lavagem depende do tempo permitido para fixação (ver Discussão).
5. A quantidade necessária de mancha dependerá da massa do biofilme. Remova todo o biofilme de áreas não espécimes da antena de cultura antes da coloração, ou transfira a amostra fixa para um novo prato antes da coloração. Não permita que o biofilme escorra ou seque.  Mantenha-o imerso na PBS.
6. Adicione a mancha ao prato (ver Discussão) e coloque o prato coberto em uma batedeira orbital lenta durante a noite (ver Discussão). Proteja-se da luz.
7. Pela manhã, retire a solução de coloração e recarregue o prato com PBS para diluir a mancha desvinculada. Coloque os pratos em uma batedeira orbital lenta para despor por várias horas.

3. Protocolo de Esclarecimento: Biofilmes em Substratas Impermeant

1. Biofilmes esclarecidos são difíceis de discernir visualmente. Portanto, se desejar, marque um lado de cada substrato com um arranhão para designar o lado para a inoculação.
2. Use pipetas pasteur longas rotuladas para todos os resíduos subseqüentes e transferências de solventes para evitar contaminação cruzada dos solventes.
3. Utilizando pinças, transfira o biofilme fixo de PBS para 5 mL de 50:50 PBS:metanol em um frasco de vidro de 20 mL com o biofilme voltado para cima. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de 1 min por 5 minutos (ver Discussão).
4. Remova o solvente para uma garrafa de resíduo, sendo cauteloso para evitar contato entre a pipeta e o biofilme, ou o biofilme e o frasco. Recarregue suavemente com 3 mL de metanol puro. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de 1 min por 3 minutos.
5. Remova o solvente para uma garrafa de resíduo e recarregue imediatamente com 5 mL de metanol. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de 1 min durante 5-10 min. Remova o solvente para a garrafa de resíduo e recarregue imediatamente com 3 mL de metanol. Biofilmes geralmente parecem mais opacos neste momento do que sua aparência inicial.
6. Remova o solvente para o frasco de resíduos e recarregue imediatamente o frasco com 5 mL de 50:50 metanol:salicilato de metila. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de 1 min por 5-10 min. O biofilme deve ser semitransparente neste solvente misto.
7. Remova o solvente para uma garrafa de lixo. Encha suavemente o frasco com 3 mL de salicilato de metila puro (MS). Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de 1 min por 3 minutos.
8. Remova o solvente para a garrafa de resíduo e recarregue imediatamente com 5 mL de MS puro. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de 1 min por 5-10 min. Neste ponto, o biofilme deve ser transparente. Remova o solvente para a garrafa de resíduo e recarregue imediatamente o frasco com 3 mL de MS puro. O biofilme processado é estável neste solvente.
9. Para biofilmes em ágar (ver Discussão) estender todos os períodos de tempo de troca para permitir a difusão de água e solvente através do ágar. Os períodos de tempo necessários podem ser estimados usando um microscópio de dissecação de baixa potência com iluminação de campo escuro para ver o avanço do solvente no ágar. O protocolo alcança um bom esclarecimento e nenhum grande efeito de encolhimento quando 2% de ágar é usado, mas o ágar clarificado irá condensar se espremido durante o manuseio com pinças. Recomenda-se o uso de uma espátula.

4. Configuração de imagem para microscopia confocal

1. As seguintes etapas são para o uso de um microscópio invertido. Use um prato à prova de solventes que tenha um fundo de vidro de cobertura para segurar a amostra invertida no estágio do microscópio (ver Discussão).
2. Prepare espaçadores para apoiar o espécime invertido. Use pequenos retângulos cortados de lâminas de microscópio (1.000 μm de espessura), vidros de cobertura (170 μm) ou anéis de silicone de 13 mm (330 μm, ver Tabela de Materiais),que podem ser empilhados conforme necessário. Presoak os anéis em salicilato de metila por 1h para minimizar a deriva de foco devido ao inchaço.
3. Para um biofilme em um quadrado de silicone de grau médico, inverta o quadrado (ou seja, abaixe o biofilme) e coloque-o em um espaçador em uma piscina de salicilato de metila no prato(Figura 2). Certifique-se de evitar bolhas abaixo do espécime.
4. Monte o prato firmemente no palco do microscópio e faça o óleo imerso em contato com o objetivo (ver Discussão).
5. Ajuste a quantidade de MS no prato para que o menisco segure o espécime firmemente para baixo no espaçador por tensão superficial. Coloque uma gota de MS em cima do substrato quadrado invertido para reduzir a dispersão de luz do acabamento fosco, e cubra o prato com uma placa de vidro para limitar a evaporação. Aguarde alguns minutos para que o espécime se instale nos espaçadores antes da imagem.
6. Use a luz transmitida para inspecionar visualmente o campo de visão e localizar a posição de foco atual em relação às regiões apical e basal do biofilme invertido. Ajuste a abertura numérica iluminadora do condensador (INA) ao mínimo (feche a íris do condensador) para aumentar o contraste, caso contrário o biofilme esclarecido será quase invisível. Quando terminar, desligue a fonte de luz transmitida.
7. Mude para fluorescência confocal e defina os limites inferiores e superiores da pilha de imagem de foco seriado necessário para cobrir o biofilme. A revisão da unidade de foco ascendente, que é recomendada, primeiro mostrará células desalojadas que se instalaram no vidro da tampa e hifas apical muito longas que estão apoiadas no vidro. Na extremidade superior da seqüência, as células fundadoras devem ser vistas aderidas ao substrato na base do biofilme. Defina o diâmetro do orifício, o espaçamento de pixels no plano de imagem e o incremento da etapa de foco utilizando os critérios gerais descritos na Discussão.

Resultados

Biofilmes como esse na Figura 1 são fortemente translúcidos para opacos, mas são rotineiramente esclarecidos e imagem do uso do protocolo acima. A Figura 2 mostra a forte atenuação da fluorescência com profundidade de foco em um biofilme fixo em PBS, em comparação com o mesmo biofilme após correspondência de índice. Como mostrado na Figura 3,usando solventes seriamente miscíveis de índice refrativo crescente, o máximo em clareza pode ser rapidamente estimado. Isso é refinado pela microscopia de contraste de fase convencional para encontrar o ponto de contraste mínimo (máxima transparência). É evidente que este ideal não é alcançado pela correspondência de índices homogêneos. Isso porque as estruturas subcelulares diferem ligeiramente no índice de refração. Neste caso, a reversão de contraste ocorreu na parede celular a um índice de solvente ligeiramente menor do que no citoplasma. Para biofilmes candida albicans, o ideal ocorre perto de n = 1.530. Os biofilmes mutantes de 48 h e cak1 DX na Figura 4A tinham 500 μm de espessura, mas as células de levedura na base eram imagens quase tão nítidas quanto as células apical. Da mesma forma, como mostrado na Figura 4C,a atenuação da fluorescência não foi fortemente correlacionada com a profundidade de foco. A Figura 5 mostra hifas invasivas em ágar, centenas de micrômetros abaixo de um biofilme de superfície. Hifas invasivas maduras produzem consistentemente leveduras laterais proximais para o septo na cadeia hiphal, dando origem a subcolônias de células semelhantes à levedura em intervalos regulares ao longo de uma hifa invasiva.

Figura 1: Culturas de biofilmes antes do esclarecimento. Um biofilme de 24 horas cultivado a partir de um isolado de uma cepa efg1 ¥/° complementada de C. albicans em uma placa de 12 poços em um quadrado de silicone em rpmi-1640 médio líquido complementado com 10% fbs. O branco estéril está no poço C4.  Inset mostra corte transversal de 96 horas de biofilme selvagem cultivado em uma placa de 6 poços em uma base de ágar de 3,75 mm no mesmo meio mostrando hifas invasivas. Ambos os painéis estão na mesma escala. Barra de escala = 2,0 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Melhoria da imagem profunda por correspondência de índice. A figura mostra projeções de visão lateral de pilhas de imagens confocais de um biofilme do tipo selvagem de 48 horas que foi fixado e manchado com ConA-Alexafluor 594. (A) O espécime foi imagem em PBS usando um objetivo de imersão direta de água 63x 1.0 NA. A atenuação foi severa a uma profundidade de foco de 30 μm. (B) Após o esclarecimento pelas etapas do protocolo 3.3-3.8, o mesmo biofilme foi filmado em salicilato de metila com atenuação mínima utilizando um objetivo de imersão de óleo de 40x 0,85 NA. Após a subtração de fundo e a projeção de visão lateral das pilhas de imagem 3D, os dados de 40x foram redimensionados espacialmente para corresponder aos dados de 63x para comparação. (C) Diagrama esquemático mostrando montagem invertida da amostra limpa (de MS) por transferência para MS em um prato de alumínio anodizado preto com fundo de vidro de cobertura cimentada (ver Discussão). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A refractometria de contraste de fase mostra a reversão de contraste das características celulares na faixa de correspondência de índice ideal. Biofilmes fixos em óculos de cobertura foram trocados de PBS em metanol, depois em xileno (n = 1,496). Esses biofilmes foram então trocados um cada um de xileno em um conjunto de líquidos de referência de índice refrativo (Série E, Laboratórios Cargille, ver Tabela de Materiais) e examinados visualmente lado a lado para determinar a faixa de índice dando maior transparência. (painel superior) Imagens de contraste de fase: Um biofilme foi trocado serialmente entre xileno e um conjunto estreito de líquidos de referência nessa faixa. Após cada troca, o mesmo campo foi realocado e visto através de um vidro de cobertura usando um objetivo de contraste de fase de imersão de óleo de 40x 0,85 NA Ph2 e condensador Ph2. Todas as imagens foram gravadas com a mesma configuração da lâmpada e exposição da câmera para exibir com precisão as mudanças. Com o aumento do índice, a reversão de contraste é vista pela primeira vez em n = 1.530 para a parede celular, seguida pelo citoplasma em n = 1.535. Barra de escala = 10 μm. (painel inferior) Gráfico mostrando o mínimo em brilho médio de biofilme no ponto de máxima transparência. A forte dispersão de luz dentro do biofilme faz com que o brilho médio exceda o campo em branco. As células isoladas parecem mais escuras que o campo em branco, até a reversão de contraste na faixa de 1.530-1.535. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens profundas de biofilmes mutantes e selvagens tipo C. albicans. Uma cepa do tipo selvagem (DAY185) e um ciclo celular relacionado à proteína quinase diminuíram a cepa de expressão(cak1 DX)¹⁴ foram cultivadas a 37 °C por 48 h em substratades de silicone no meio líquido YPD. Os biofilmes foram fixados, manchados com ConA-Alexafluor 594, e esclarecidos usando o protocolo de troca de solventes em salicilato de metila. A microscopia confocal 3D mostrou que ambos os biofilmes tinham ~500 μm de espessura. Os dados de imagem foram convertidos em formato de 32 bits em ImageJ ou Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ ou http://fiji.sc), depois processados usando a função Subtract Background com um raio de bola rolando de 50 pixels, thresholding para definir pixels negativos a zero, resfatiando e usando projeção de intensidade máxima para produzir vistas laterais. (A)Projeções axiais e de visão lateral: O biofilme do tipo selvagem cresceu a uma espessura de 502 μm, como visto na projeção de visão lateral da pilha de imagens confocal de 558 aviões. Barra de escala = 100 μm. (painéis da mão esquerda) Projeções axiais de 40 aviões do ápice (superior) à base (inferior) mostram a variação dos tipos de células em diferentes estratos do biofilme. Este exemplo mostrou estrutura de tipo selvagem característica: células aderentes na base dão origem a hifas que ascendem a uma zona média densa de células pseudo-hyphal e semelhantes à levedura. Acima da zona média, as hifas ressurgiram e deram origem a aglomerados de levedura brotante. As longas hifas vistas na zona apical provavelmente se estenderam para o meio de cultura no biofilme vivo, mas dobraram-se sobre a superfície do biofilme durante o processamento do espécime. O biofilme Cak1 DX cresceu a uma espessura de 500 μm, como visto na projeção de visão lateral da pilha de imagens de 556 aviões. Este mutante, que é conhecido por sofrer um crescimento filamentoso na ausência de indutores estresses¹⁴, produziu uma arquitetura dramaticamente diferente. Como visto tanto na visão lateral quanto nas projeções axiais (painéis da mão direita), muitas células ramificadas deram origem a crescimentos radiais. (B) Exemplos de hifas ramificadas dentro do biofilme cak1 DX. Barra de escala = 10 μm. (C) A atenuação da fluorescência com profundidade no biofilme do tipo selvagem esclarecido foi quantificada mascarando pixels de fundo e, em seguida, calculando o sinal digital médio para todos os pixels não-fundo em cada plano de imagem. Com exceção das hifas apical que são marcadas pela lectina, não houve forte tendência de atenuação com profundidade de foco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Hifas invasivas em ágar. C. albicans hyphae em um biofilme de superfície penetrará um substrato ágar a distâncias milimétricas (ver Figura 1). Após o esclarecimento, estruturas invasivas podem ser vistas para baixo através do biofilme, ou para cima a partir do lado inferior do ágar. Este último exige maior distância de trabalho. Alternativamente, após a fixação, mas antes da coloração e da troca de solventes, o ágar pode ser cortado verticalmente com um bisturi ou lâmina de barbear em lajes de 1-2 mm que, em seguida, podem ser viradas de lado e imagem diretamente na vista lateral após a coloração e esclarecimento. Este procedimento é recomendado. Nesta projeção de um campo de visão quadrado de 213 μm, uma escala de cor de arco-íris foi usada para codificar a posição axial sobre uma faixa de 75 μm: as características azuis estão próximas e as características vermelhas estão mais profundas no plano da página. Esta visão mostra que o broto de hiphae longo fora de células laterais forma de levedura em intervalos semiregulares que dão origem a subcolônias. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Avanços na microscopia de fluorescência em secção óptica, resolução, velocidade, evasão ou compensação de aberração, aquisição multicanal e em poder computacional, causaram um ressurgimento em amostras intactas de imagem. Para espécimes fixos, tanto os métodos clássicos quanto os novos de esclarecimento e expansão tiveram um grande impacto^{19,20,21,22,23,24}. Neste caso, aplicamos uma abordagem rápida e simples de correspondência de índice satisfatoriamente para estudar a estrutura de biofilmes fúngicos que são fortemente translúcidos para opacos.

Os protocolos anteriores foram testados com uma gama de amostras. Em nosso laboratório, os biofilmes Candida albicans são mais frequentemente cultivados em quadrados de 14 mm cortados de uma folha de borracha de silicone de grau médico (ver Tabela de Materiais). Este substrato é usado porque o crescimento em PDMS (poli-dimetilsiloxano) submerso no meio de cultura líquida foi estabelecido como um importante modelo in vitro para infecções associadas a implantes médicos, particularmente cateteres residentes. As células estressadas que instiram filamentos aderem rapidamente a superfícies não polares, como o PDMS. Na prática, os quadrados utilizados que foram limpos e reesterilizados em uma autoclave (ciclo seco) dão os biofilmes mais consistentes para qualquer cepa particular. Biofilmes também são comumente cultivados em copos de cobertura, em pratos de cultura de fundo de vidro de cobertura, em pratos de poliestireno de grau bacteriológico padrão, e em ágar. Como as células C. albicans não aderem bem ao vidro, os vidros de cobertura devem ser tratados com uma lectina que ligará os polissacarídeos da parede celular. Aplicamos 40 μL de 1 mg/mL ou WGA em água estéril em cada superfície de deslizamento de cobertura. Após a secagem, os óculos de cobertura são tratados com 40 μL de glutaraldeído de 1% por 3 min para conectar a proteína a um filme insolúvel. Em seguida, são lavadas com água destilada estéril para remover a lectina solúvel e qualquer lectina solúvel e seca ao ar. Se necessário, os copos ou pratos de capa tratada são reesterilizados uma lâmpada UV germicida por 10 min.

A espessura da amostra afetará os períodos de incubação exigidos nos protocolos. A difusão fixa em um biofilme de 300 μm requer vários minutos para se equilibrar. Este período de tempo aumenta conforme o quadrado da espessura da amostra, e deve ser estendido para uma hora ou mais para biofilmes muito espessos ou espécimes de blocos de ágar que podem ter de 2 a 3 mm de espessura. O período de equilíbrio para a coloração também depende da espessura da amostra, conforme descrito para fixação e lavagem. No entanto, como as lectinas se difundem mais lentamente do que os fixadores de baixo MW, especialmente dentro de um gel de ágar, a coloração deve ser estendida durante a noite. O mesmo deve ser feito para a lavagem do excesso de manchas.

Manchas de vários tipos podem ser incorporadas aos protocolos. Usamos uma mancha de parede celular para imagens estruturais, mais comumente Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) ou uma lectina com tinque de corante, como ConA-Alexafluor 594 ou WGA-Alexafluor 594. Deve-se prestar atenção à valência da proteína. O tetramer pode causar crosslinking de hifas altamente flexíveis na região apical de um biofilme. Isso é menos aparente com o dimer WGA. As especificidades canônicas desses marcadores são Calcofluor para chitin, para resíduos de mannose, e WGA para N-acetil-D-glicosamina e resíduos de ácido sílico.

Como o protocolo de troca de solventes é classificado a partir de PBS ou água embora metanol em salicilato de metila, os recipientes de amostras devem ser resistentes a solventes. O salicilato de metila (MS) amolecerá rapidamente o plástico de poliestireno e amolece lentamente outros plásticos. O protocolo intensifica o uso do metanol puro pode ser realizado em plásticos, mas nesse ponto do protocolo geralmente mudamos para frascos de cintilação de vidro padrão de 20 mL com tampas de parafuso resistentes a solventes. Os frascos são convenientes para biofilmes em substratos quadrados de silicone, pois os quadrados podem ser recolhidos e transferidos usando pinças finas. Além disso, um frasco pode ser drenado e recarregado com o quadrado plano descansando na superfície curva interna para que o biofilme não entre em contato com o vidro. O substrato deve ser biofilme-up quando está imerso no frasco vertical. Os frascos são excelentes para armazenamento de amostras a longo prazo.

No protocolo de esclarecimento, as etapas de troca de solventes mais classificadas minimizam o risco de deformação da amostra devido aos efeitos da mistura de solventes. Para velocidade e conveniência no protocolo básico, há quatro etapas: 1) etapa 3.3, PBS a 50:50 PBS:metanol; 2) passos 3.4 e 3.5, PBS:metanol para metanol puro, 3) passo 3.6, puro metanol até 50:50 metanol:MS; e 4) passos 3.7 e 3.8, metanol:MS para MS puro. Metanol proporciona a miscibilidade transitória. No entanto, como a água e a ESM são quase imiscíveis, é essencial que toda a água seja deslocada por metanol antes da introdução de qualquer MS. Da mesma forma, como o metanol é altamente volátil, é importante deslocar todo o metanol por MS. Caso contrário, o continuado a evaporação do metanol residual causará variações do índice de refração dentro da amostra. Dentro da seqüência de quatro passos, repetir o segundo e quarto passos adicionando outra mudança de solvente puro, ou mesmo uma terceira mudança, é aconselhável. Para espécimes particularmente frágeis, alterações de solventes poderiam ser formuladas em passos menores.

Com espécimes de blocos de ágar, as etapas 3.4 e 3.5 (metanol puro) podem causar o aparecimento de cristais de sal dentro do ágar devido à insolubilidade dos sais residuais de PBS no metanol. Isto pode ser evitado usando água destilada (DW) na primeira etapa de solvente misto no lugar da PBS para diluir sais durante a troca de água:metanol. A seqüência alternativa de troca de solventes para biofilmes fixos consiste então nestas etapas: 1) passo 3.3, transferir a amostra de PBS para 50:50 DW:metanol (permitir tempo extra para difusão através de ágar); 2) etapa 3.4, transferir a amostra de 50:50 DW:metanol para metanol puro (repetir 2x com metanol como na etapa 3.5); 3) etapa 3.6, transferir a amostra de metanol para 50:50 metanol:salicilato de metila; e 4) etapa 3.7, transferir a amostra de 50:50 metanol:MS para mS puro (repetir 2x com MS como na etapa 3.8).

Como o salicilato de metila amolece rapidamente o plástico de poliestireno, usamos uma placa de alumínio anodizado com fundo de vidro de tampa para segurar o biofilme esclarecido no palco de um microscópio invertido. O vidro da tampa é mantido no lugar usando cimento óptico de cura UV (Norland Optical Adhesive #61, ver Tabela de Materiais). Desde que o MS seja removido no final do dia lavando o prato com isopropanol seguido de água com sabão e enxaguando, o vidro de cobertura cimentada servirá por muitos meses.

A seleção objetiva das lentes é extremamente importante na imagem em larga escala de espécimes esclarecidos devido à importância de minimizar a aberração esférica e a necessidade de distância de trabalho suficiente. Temos experiência com três objetivos nesses estudos. Na configuração do microscópio invertido, utilizamos uma longa distância de trabalho, óleo objetivo de abertura numérica moderada (NA) imerso abaixo do vidro de cobertura com o biofilme imerso em salicilato de metila no prato acima do vidro da tampa. A maior parte do nosso trabalho foi feito com um objetivo acromático da série Zeiss Universal, tipo 461708, 40x 0,85NA Oel 160/1.5, usado com um adaptador focal de distância focal de 160 mm negativo para compatibilidade nominal infinita-conjugada (IC). Este objetivo foi originalmente projetado para a visualização imersa em óleo através de lâminas de microscópio de 1,5 mm com distância de trabalho de 0,35 mm²⁵. Quando usado com um vidro de cobertura padrão (0,17 mm), a distância de trabalho é muito maior: 1,5 + 0,35-0,17 = 1,68 mm = 1.680 μm. Também utilizamos um novo objetivo de multi-imersão Zeiss, tipo 420852, 25x 0,8NA LD LCI Plan-apochromat com uma distância de trabalho superior a 540 μm, com a correção de imersão definida para o lado alto do 'óleo'. Este objetivo é altamente corrigido e produz uma imagem soberba. Em um suporte de microscópio vertical, usamos um novo objetivo de multi-imersão Nikon, tipo MRD71120, 10x 0,5NA CFI Plan-apochromat com uma distância de trabalho superior a 5.000 μm (5 mm), também com a correção de imersão definida para o lado alto do 'óleo' (n = 1.518). Embora este objetivo tenha um NA menor do que os outros, ele tem a vantagem de ser diretamente imersível em salicilato de metila.

Para otimizar a aquisição de dados em termos de velocidade e resolução, as configurações de microscópio confocal idealmente devem atender tanto às densidades de amostragem transversa e axial de Nyquist¹⁸. Utilizando critérios convencionais, defina nominalmente o diâmetro do orifício confocal para 1 unidade arenosa. Em coordenadas ampliadas,

d_P (μm) = 1,22 x ampliação x (comprimento de onda de emissão em μm) / NA

A amostragem transversal (espaçamento de pixels) não deve exceder (1/2) x o limite de resolução de Abbe. Em coordenadas de espaço-objeto,

♦x, ¥y = (comprimento de onda de emissão em nm) / (4 NA)

A amostragem axial (incremento de foco) não deve exceder a largura de banda axial inversa,

♦z = (índice de imersão) x (comprimento de onda de emissão em nm) / (NA²)

O sistema óptico confocal expande a largura de banda do microscópio e aguça a resolução transversal e axial em pelo menos 1/⁄2.

Para o objetivo de 40x 0,85 NA que utilizamos com mais frequência, consulte a Tabela 1 para obter os resultados dessas fórmulas para um comprimento de onda de emissão de 600 nm (Alexa Fluor 594).

	Fórmula	x 1/⁄2	conjunto (típico)
dP (μm)	34,5 μm	-	25 ou 50 μm
♦x, ¥y	176 nm	125 nm	161 nm
♦z	1200 nm	848 nm	900 nm

Tabela 1: Diâmetro do orifício confocal, amostragem transversal e valores de amostragem axial para um comprimento de onda de emissão de 600 nm.

Usando um scanner confocal de disco giratório com essas configurações e um campo de varredura de 1.392 x 1.040 pixels, os dados das amostras de biofilme podem ser adquiridos com velocidade e resolução razoáveis. As pilhas de imagens 3D típicas de cor única são executadas entre 0,35 e 1,55 GB.

Os meios de comunicação de amplo uso abrangem uma faixa significativa de índice de refração. Por iluminação de campo escuro e inspeção visual, descobrimos que os biofilmes fixos C. albicans eram mais transparentes acima de n = 1,5. Esta foi refinada por microscopia de contraste de fase para n = 1.530-1.535. Por uma série de razões práticas, utilizamos salicilato de metila (n = 1,537) como solvente de correspondência de índice final. Embora a troca de solventes traga o risco de deformação de espécimes ou outros artefatos, as células em espécimes fixos e esclarecidos têm dimensões corporais semelhantes, diâmetro do hipha e dimensões do comprimento interseptal como espécimes vivos.

Muitas variações no processo de troca de solventes são possíveis (por exemplo, usando um solvente transitório diferente, ou um solvente final diferente). O metanol foi escolhido por sua alta polaridade e difusão rápida, mas o etanol mostrou-se melhor para preservar melhor o rendimento quântico da proteína fluorescente vermelha (RFP)²⁶ como solvente transitório. O salicilato de metila foi selecionado por seu índice, polaridade moderada, baixa pressão de vapor e compatibilidade com muitas manchas, corantes e proteínas fluorescentes. No entanto, um solvente final com índice ligeiramente menor, ou uma mistura de salicilato de metila e um solvente de índice mais baixo, como butanol, pode servir melhor.

Inesperadamente, a capacidade de ver através de um biofilme revela não apenas suas características internas estratificadas, mas também auxilia na visualização da origem de estruturas estendidas como hifas apical longas, não emaranhadas e hifaes basais invasivas em certos substratados. A virulência oportunista em C. albicans depende de sua versatilidade genética (ou seja, mudança para crescimento hifal, regulação do substrato celular e adesão celular-célula, geração de osmólitos para brotação celular e alongamento, e uso de nutrientes alternativos). A extensão hifábula permite a fuga de células c. albicans individuais de células imunes fagocíticas, mas também é essencial para a invasão. A adesão ao biofilme e o entrelaçamento hifal parecem fornecer a ancoragem de superfície necessária para que as hifas invadam eficientemente um substrato. Quando esse substrato é tecido hospedeiro, o aumento da virulência pode resultar.

Biofilmes intactos de imagens permitem um grande número de experimentos informativos utilizando cepas de repórteres para expressão genética, substrata de tecido modelo e a inclusão de outros organismos, como bactérias encontradas em biofilmes naturais. Mesmo no caso mais simples de imagens puramente estruturais com uma mancha de parede celular, são revelados fenótipos in situ que, em seguida, podem ser quantificados e geneticamente analisados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			resíduos de risco biológico
Armário de biossegurança com lâmpada
Calcofluor White M2R (2,5 mg/mL em metanol)
Concanavalina A - Alexafluor-594 ou outro conjugado
Água			destilada
Água destilada estéril
Etanol, EtOH absoluto
Soro bovino fetal (FBS), estéril
Frasco de resíduos fixadores em contenção
Formaldeído 20% em água, ampolas	Microscopia Eletrônica Ciências
Alternativas de formaldeído: paraformaldeído em pó, formalina 37%	Microscopia Eletrônica Ciências
Hotte
Glutaraldeído 25% em água, ampolas	Incubadora de Ciências
- 30 ° C, com misturador rotativo (60 rpm) para tubos de
Incubadora - 37 & C, com misturador orbital para placas
Isopropanol 70%			iPrOH 70%
Lâmpada UV de ondas longas (365 nm), 5 W	Cole-Parmer Scientific		para cura de cimento NOA-61
Folha de silicone de grau médico, 0,060 "(1,52 mm) de espessura	Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/		Folha de silicone de grau médico não reforçada
Metanol 99,9%
Salicilato de metila MeOH 99%
MS Millipore Swinnex 13 mm juntas de anel de silicone branco	Millipore Corp.
Adesivo óptico de cura UV Norland - tipo NOA-61	Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com	NOA-61
Misturador orbital, bancada
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), líquidos padrão estéreis
com índice de refração, n = 1,500 a 1,640 (29 líquidos, incremento de 0,005)	Cargille Laboratories, https://cargille.com	Série E	Cedar Grove, NJ 07009, EUA
RPMI-1640 base média, HEPES tamponado,
, 20 mL - Wheaton, Tampa de ureia Forro de tampa de cone PE	Fisher Scientific Co.	03-341-25H	para processamento e armazenamento de amostras
Frasco de resíduos de solvente em contenção
Meio de aranha com manitol, estéril (1% de caldo nutriente Difco, 0,2% K2HPO4, 1% D-Manitol)
Aglutinina de gérmen de trigo - Alexafluor-594 ou outro conjugado
Placas de ágar levedura-peptona-dextrose (YPD), estéreis (1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona, 2% de dextrose, 2% de ágar Bacto)
Meio YPD, líquido, estéril (1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona, 2% de dextrose)