Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

A resistência antimicrobiana (RMM) é uma crise crescente que representa uma grande ameaça à saúde humana em todo o mundo. A resistência à maioria dos antibióticos foi relatada, e infecções causadas por bactérias resistentes a todos os medicamentos clinicamente disponíveis estão surgindo. Para combater a ascensão da RMA, precisamos aumentar nossa compreensão deste fenômeno multifacetado e dos mecanismos e interações subjacentes entre antibióticos e bactérias. Um aspecto historicamente mal compreendido é a permeação de antibióticos em bactérias, juntamente com os fenômenos do acúmulo e da efflux. Esse conhecimento é crucial na concepção de novas drogas e na compreensão de mecanismos de resistência. Assim, isso desempenha um papel crítico na pesquisa da RMM.

Existem duas abordagens principais que podem ser tomadas para medir a concentração de antibióticos: medir a droga diretamente ou marcar com um moiety projetado para facilitar a quantificação. Embora a marcação do antibiótico melhore a detecção, isso pode perturbar a atividade biológica da droga, como atividade antimicrobiana e permeabilidade. Este não é um problema para métodos não marcados; no entanto, a detecção pode ser desafiadora. Nos últimos anos, os avanços tecnológicos levaram a um boom de pesquisas utilizando espectrometria de massa (MS) para medir diretamente a concentração de antibióticos em bactérias^{1,2,3,4,5,6,7}. Esses estudos mostraram que é possível estudar o acúmulo intracelular em uma variedade de bactérias, com bactérias gram-negativas as mais estudadas. A quantificação da permeabilidade das moléculas tem sido então ligada à atividade e usada para informar o desenvolvimento de medicamentos^2,3,4, embora seja preciso ter cautela ao confundir diretamente o acúmulo e a atividade-alvo⁵. Antes do desenvolvimento de EsM, os únicos antibióticos cuja concentração poderia ser diretamente medida foram aqueles que possuem fluorescência intrínseca, como tetraciclina e as quinolones^8,9,10,11. Embora obviamente limitado em escopo, acúmulo e efflux foram examinados e quantificados, ilustrando a utilidade da quantificação baseada em fluorescência.

Antibióticos marcados têm sido usados por muitas décadas para estudar distribuições, modos de ação e resistência, com tags radioativas e fluorescentes sendo comuns. Sondas marcadas por rádio têm a vantagem de serem quase idênticas ao composto pai, portanto, é improvável que a atividade biológica seja significativamente diferente. Isótopos como ³H, ¹⁴C e ¹⁵N têm sido frequentemente usados devido à proeminência desses elementos em antibióticos, e uma variedade de andaimes antibióticos foram examinados^1,10,12,13. Embora a detecção de radiosondas seja simples, há uma série de preocupações logísticas (por exemplo, segurança, isótopos de meia-vida) que limitaram o uso dessa abordagem. Outra estratégia são antibióticos fluorescentes. Essas sondas podem ser usadas para examinar a distribuição e os modos de ação e resistência da droga-mãe, usando tecnologia mais simples do que a Ems e sem os problemas logísticos da radiação⁸. A principal desvantagem para essa abordagem é que os antibióticos são geralmente moléculas relativamente pequenas, daí a introdução de um moiety fluorescente representa uma mudança química significativa. Essa alteração pode impactar propriedades fisioquímicas e atividade antibacteriana. Portanto, deve-se ter cuidado para avaliar esses fatores para gerar resultados representativos do antibiótico pai.

Neste trabalho, um método é descrito para sintetizar, avaliar e usar antibióticos fluorescentes, como em nossas publicações anteriores^14,15,16. Através de trabalhos anteriores, vários antibióticos fluorescentes foram preparados e usados para uma variedade de propósitos (ver Stone et al.⁸). Para minimizar a probabilidade de impactar a atividade biológica, fluoroforres muito pequenos são utilizados neste trabalho: nitrobenzoxadiazol (NBD, verde) e 7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl (DMACA, azul). Além disso, é descrita a avaliação da atividade antibacteriana utilizando o ensaio de concentração mínima de inibição de diluição de microbroche (MIC), para que o efeito das modificações na atividade possa ser medido. Essas sondas fluorescentes podem ser usadas em ensaios espectrofotométricos, citometria de fluxo e microscopia. A gama de aplicações possíveis é onde reside a vantagem dos antibióticos fluorescentes. O acúmulo de celular pode ser quantificado, categorizado e visualizado, algo que não é possível usando apenas esm. Espera-se que o conhecimento adquirido através do uso de antibióticos fluorescentes ajude na nossa compreensão da resistência e na luta contra a RM.

1. Síntese de Alkyne-fluoroforres

1. Síntese de NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amine)
   1. Dissolva 1.031 mg de 4-chloro-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) em 60 mL de tetrahidrofurano (THF). Adicione 1.857 mg de CsCO₃ (5.696 mmol), depois 0,39 mL de propargylamina (6,1 mmol). Aqueça a reação a 50 °C por 2 h, que passará de marrom para verde, depois esfrie para temperatura ambiente (RT).
   2. Filtre a reação usando um aparelho de filtragem (ver Tabela de Materiais)e lave com acetato etílico (EA). Concentre o filtramento pressão reduzida, depois dissolva o resíduo em 150 mL de EA e passe para um funil de separação de 500 mL.
   3. Lave a solução EA com 100 mL com água e salmoura, respectivamente. Em seguida, misture as fases aquosas e lave 2x com 100 mL de EA.
   4. Seque as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de magnésio anidro, depois filtre e concentre-se pressão reduzida.
   5. Purificar o produto bruto por cromatografia flash em gel de sílica (20-30% EA em éter de petróleo [PE]), verificando a pureza por espectrometria de massa de cromatografia líquida (LCMS, [M+H]⁺ = 219,1) e/ou ressonância magnética nuclear (NMR), mudanças químicas da seguinte forma:
      ¹ H NMR (CD₃OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); ¹³ C NMR (CD₃OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76,5, 74.2, 33,4.
      NOTA: Ao realizar a purificação pela cromatografia do gel de sílica, prepare a coluna usando o menos polar dos solventes listados. O composto bruto pode ser carregado como uma solução concentrada ou adsorlado na sílica se a solubilidade não permitir. Depois que o composto foi adicionado ao topo da sílica, passe por volumes de coluna de 1-2 do mesmo solvente usado para muslica molhada. Em seguida, comece com a relação solvente listada, passando pelo volume de pelo menos 1 coluna de cada solvente, e certificando-se de não fazer grandes saltos na composição de solventes. Colete frações e verifique a pureza/identidade por LCMS ou TLC (cromatografia de camada fina). Combine frações puras e concentre-se pressão reduzida por evaporação rotativa.
2. Síntese de DMACA-alkyne (2-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide).
   1. Dissolva 5,02 g de 3-(dimetilamino)fenol (36,6 mmol) em 30 mL de etanol, em seguida, adicione 6,7 mL de diethyl 1,3-acetonedicarboxylate (36 mmol). Adicione 10,5 g de ZnCl₂ (77,2 mmol), depois refluxo a solução vermelha por 42 h. Adicione mais 9,20 g de ZnCl₂ (67,6 mmol), em seguida, refluxo para 8 h.
   2. Esfrie a reação e concentre-se pressão reduzida. Disperse o sólido vermelho resultante em 200 mL de EA, filtro, em seguida, transfira para um funil de separação de 500 mL.
   3. Lave o EA com 200 mL cada água e salmoura, depois seque sobre sulfato de magnésio de anidro. Filtre a fase orgânica seca e concentre-se pressão reduzida.
   4. Purificar o sólido vermelho (etiletilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)acetato) por cromatografia flash em gel de sílica (0-100% EA em PE), verificando a pureza por LCMS ([M+H]⁺ = 275,1) e/ou NMR, mudanças químicas da seguinte forma:
      ¹ H NMR (CDCl_3,600 MHz) δ 7.30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H).
   5. Dissolver 488 mg de etilo 2-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetato (1,18 mmol) em 10 mL de THF, em seguida, adicionar uma solução de 157 mg de LiOH· H₂O (3,74 mmol) em 15 mL de água. Mexa a reação na RT por 3 h, depois mova-se para um funil separado e dilua com mais 50 mL de água.
   6. Lave a mistura de reação 2x com 50 mL de eter diethyl (Et₂O), em seguida, lave a fase orgânica combinada 2x com 25 mL de água. Tome qualquer precipitação amarela com a camada orgânica. Concentre a fase orgânica pressão reduzida usando um evaporador rotativo.
   7. Acidifique a fase aquosa para pH = 2 com HCl concentrado, e esfrie até 4 °C durante a noite. Filtre a fase aquosa acidificada e adicione o sólido amarelo à fase orgânica concentrada.
      NOTA: O ácido acético 2-(7-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)ácido acético pode ser usado sem maior purificação, mas isso pode ser verificado por LCMS ([M+H]⁺ = 247,1) e/ou NMR, mudanças químicas da seguinte forma:
      ¹ H NMR (CDCl_3,600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); ¹³ C NMR (CDCl_3,150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98,3, 40.2, 18,5.
   8. Dissolva 466 mg de ácido acético de 2-(7-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)ácido acético (1,89 mmol) em 7 mL de Nseco,N-dimetilformamida (DMF) e coloque uma atmosfera de nitrogênio.
   9. Dissolver 0,33 mL de propargylamina (5,1 mmol) em 7 mL de DMF seco nitrogênio. Adicione 1,30 mL de amina di-isopropilethyl (DIPEA, 7,50 mmol) à solução de tintura, depois 535 mgde O-(1H-6-clororobenzotriazol-1-yl)-1,1,3-tetrametiluronium hexafluorophophophofato (HCTU, 1,29 mmolmol). Mexa a solução de tinta ativada por 15 min na RT, depois adicione a solução de amina em sentido e deixe se mexer durante a noite.
   10. No dia seguinte, diluir a reação com 35 mL de água e concentrar-se pressão reduzida.
   11. Particione o sólido laranja resultante entre EA e salmoura (100 mL cada) em um funil de separação de 250 mL. Separe as camadas (execute as duas camadas em diferentes frascos) e lave a fase aquosa com 100 mL de EA.
   12. Concentre as fases orgânicas combinadas pressão reduzida e, em seguida, redissolva o sólido laranja em 3 mL de 1:1 aceonitrila (ACN)/água (v/v). Purificar o produto bruto injetando em um sistema de cromatografia líquida de média pressão (MPLC) de fase inversa equipado com uma coluna de cartuchoC18 (solvente A: água, solvente B: ACN).
   13. Verifique as frações de pureza por LCMS ([M+H]⁺ = 284,1, alterações químicas nmr dadas abaixo), em seguida, combinar e lyofamizar frações apropriadas para dar 2-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide, nmr mudanças químicas como segue:
       ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 8.65 (t, J = 5,4Hz, 1H), 7,52 (d, J = 9,0Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3.88-3.87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 3.01 (s, 6H); ¹³ C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97,5, 80.9, 73,3, 39,7, 38.4, 28,2.

2. Síntese de Antibióticos Fluorescentes

1. Prepare um azide-derivado de um antibiótico como descrito anteriormente^14,15,16.
   NOTA: O procedimento é específico para cada antibiótico e requer um exame cuidadoso da relação de atividade da estrutura (SAR) da molécula-mãe para garantir que o antibiótico funcional mantenha a atividade comparável ao pai. (por exemplo, ciprofloxacina¹⁶, linezolid¹⁴, e trimethoprim¹⁵). Veja a Figura 1 como exemplos de antibióticos fluorescentes publicados e o esquema geral de síntese.
2. Clique no procedimento de reação A
   NOTA: Para a maioria dos antibióticos, siga o procedimento detalhado aqui para huisgen catalisado de cobre [2+3] cicloaddition de azide (passo 2.1) e alquine fluorescente (preparado na etapa 1).
   1. Coloque o antibiótico azide em um frasco inferior redondo e adicione tert-butanol^(tBuOH) e água (1:1 v/v, 25 mL cada por azide mmol).
   2. Adicione o fluoroforre-alquina preparado na etapa 1.1 (3 eq.) e aqueça a reação a 50 °C. Em seguida, adicione sulfato de cobre (100 mM na água, 0,6 eq.) à reação, seguido de ácido ascórbico (500 mM na água, 2,4 eq.).
   3. Mexa a reação a 50 °C por 1 h, ou até análise por LCMS mediante indicação da conclusão da reação (consumo completo de azide inicial).
   4. Esfrie a reação e purificar conforme apropriado para o andaime antibiótico e proceda para purificação pela etapa 2.3 ou 2.4.
      NOTA: Vários métodos diferentes de purificação são possíveis, dependendo da polaridade e estabilidade do andaime.
3. Clique no procedimento de reação B
   NOTA: Siga este procedimento para antibióticos à base de peptídeos, para fornecer condições de reação mais fortes (trabalho inédito, Phetsang, 2019).
   1. Coloque o peptídeo azida-antibiótico em um frasco inferior redondo e adicione DMF suficiente (750 mL/mmol azide) para dissolver.
   2. Adicione o fluorofófo-alquina preparado na etapa 1 (5 eq.) e aqueça a reação a 50 °C por 1 h.
   3. Adicione cobre (I) iodeto (20 q.), depois DIPEA (120 q.), depois ácido acético (240 q.).
   4. Mexa a reação a 50 °C por 1 h, ou até que a análise por LCMS indique conclusão de reação (ou seja, consumo completo de azide inicial). Esfrie a reação e prossiga para purificação pelo método 1 (ver passo 2.3).
4. Método de purificação 1 (usado para ciprofloxacina, trimetoprim e linezolid)
   1. Injete a reação do clique resfriado diretamente em uma coluna de cartuchos MPLC C18.
   2. Incorpore uma longa fase de lavagem (cerca de 10 min) no início da corrida (100% solvente A), em seguida, execute um gradiente até 100% solvente B, seguido de um retorno ao solvente A.
      NOTA: Solvente A pode ser escolhido a partir de água, 0,05-0,1% ácido fórmico (FA) na água, 0,05-0,1% ácido trifluorocético (TFA) na água, dependendo da solubilidade, estabilidade e da melhor resolução dos picos. Solvente B pode ser escolhido entre acetonitrila (ACN), 0,05-0,1% FA na ACN, 0,05-0,1% TFA na ACN, para igualar solvente A. Se a elusão se mostrar difícil, o metanol pode ser usado no lugar da ACN.
   3. Coletar e combinar frações apropriadas, como indicado pela LCMS e cor (massa correta vista, pico singular), então liofilize para dar o (semi)puro antibiótico fluorescente.
   4. Purificar ainda mais o produto, se necessário. Avalie a pureza por NMR e/ou LCMS e a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), utilizando uma coluna e método apropriados para o andaime.
5. Método de purificação 2
   NOTA: Se a solubilidade permitir, a preepurificação pode ser realizada pelo trabalho aquoso (usado para macrolides, trabalho inédito, Pedra 2019).
   1. Diluir a reação de clique resfriado com água e Et₂O (1:1 v/v, aproximadamente 10 vezes diluição do volume inicial de reação), transferindo-se para um funil separador de tamanho apropriado.
   2. Separe as camadas e lave a fase aquosa duas vezes com Et₂O.
   3. Lave as fases orgânicas combinadas 2x com água (volume igual com fase orgânica), depois seque sobre Na₂SO₄.
   4. Filtre a fase orgânica seca e concentre-se pressão reduzida.
   5. Purificar o produto bruto pela MPLC e/ou HPLC descrito na etapa 2.4.4.
      NOTA: Veja a Figura 2 como exemplos de traços LCMS de reação de clique incompletos, completos e purificados. Os rendimentos purificados típicos para as reações de clique antibiótico-fluoroforre variam de 30 a 80%.
      ATENÇÃO: A maioria dos produtos químicos usados nessas sintes possuem riscos específicos de segurança. A cautela deve ser tomada o tempo todo, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual. Et₂O, ^tBuOH, FA, ácido acético, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamina e HCTU são todos inflamáveis; evitar contato com fontes de calor ou faísca. THF, propargylamina, DIPEA, ^tBuOH, FA, DMF e PE são todos tóxicos; evitar exposição. Propargylamina, CsCO₃, ZnCl₂, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, ácido acético e HCl são todos corrosivos; evitar contato e estar atento ao contato superficial. ZnCl₂, CuSO_4,CuI e PE apresentam riscos ambientais; estar atento às condições de descarte. ThF pode formar peróxidos explosivos; tome cuidado com as condições de armazenamento. Azidas orgânicas são explosivas; tomar cuidado especialmente com a produção em larga escala.

3. Avaliação da Atividade Antimicrobiana

NOTA: Todo o trabalho envolvendo bactérias deve ser realizado em condições estéreis para evitar a contaminação do ensaio ou do laboratório. Todos os meios de comunicação devem ser autolavados antes do uso, e o plástico e equipamentos como pipetas devem ser mantidos estéreis. Recomenda-se que o trabalho seja feito em um capô de biocontenção (tipo 2).

1. Os estoques de glicerol de raia de cepas bacterianas apropriadas para o andaime antibiótico no ágar de caldo lisogeniano (LB, preparado pelas instruções do fabricante) e crescem durante a noite a 37 °C.
   NOTA: A escolha das bactérias para testar a atividade antibacteriana deve ser feita com base no andaime antibiótico que está sendo usado. Uma faixa representativa de 5 a 10 bactérias deve ser escolhida a partir da espécie que é conhecida por ser suscetível ao antibiótico, considerando-se as capacidades logísticas do laboratório. Se possível, bactérias resistentes também devem ser testadas. O protocolo dado abaixo funcionará na maioria das bactérias, mas verifique se são necessárias condições especiais (por exemplo, CO_2,mídia especial) e faça alterações conforme necessário. As bactérias com sucesso que usam essas condições incluem Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecium.
2. Escolha uma única colônia da placa, e cultura durante a noite em 5 mL de caldo Mueller-Hinton ajustado (CAMHB, preparado pelas instruções do fabricante) a 37 °C.
3. Diluir as culturas durante a noite ~40 vezes em CAMHB e crescer até uma fase média de log, densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) = 0,4-0,8, volume 5 mL).
4. Prepare as soluções de estoque de cada antibiótico fluorescente a 1,28 mg/mL em água estéril, e pipette 10 μL de antibiótico para a primeira coluna de uma placa de poço de 96.
5. Adicione 90 μL de CAMHB à primeira coluna e 50 μL a todos os outros poços. Em seguida, realize diluição serial de duas vezes através da placa.
6. Misture completamente, em seguida, diluir as culturas de fase de tronco médio para ~10⁶ unidades de formação de colônia (CFU)/mL e adicionar 50 μL a todos os poços, para fornecer uma concentração final de ~5 x 10⁵ CFU/mL.
   
   volume de cultura (mL) = (volume de mídia em mL)/(OD₆₀₀ x 1.000)
   
   por exemplo, para uma cultura OD₆₀₀ = 0,5 em um volume de mídia desejado de 12 mL, adicione (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 mL de cultura para 12 mL de mídia
7. Cubra as placas com tampas e incuba a 37 °C por 18-24 h sem tremer.
8. Inspecione visualmente as placas, com o MIC sendo a menor concentração bem sem crescimento visível.
   NOTA: Consulte a Tabela 1 para alguns exemplos de antibióticos fluorescentes ativos e inativos.

4. Análise do Acúmulo de Sondas por Espectrofotometria e Citometria de Fluxo

NOTA: Esses tempos de centrífuga foram otimizados para E. coli,de modo que pequenas alterações podem ser necessárias para outras espécies. Dados representativos para acúmulo de sondas são relatados para a sonda ciprofloxacina com rótulo NBD.

1. Os estoques de glicerol de raia das cepas bacterianas em ágar LB e crescem durante a noite a 37 °C.
2. Escolha uma única colônia da placa e cultura durante a noite em LB a 37 °C.
3. Diluir culturas durante a noite ~50 vezes na mídia e crescer até a fase média do log (OD₆₀₀ = 0,4-0,8).
4. Centrífuga simem as culturas a 1.470 x g por 25 min e decantam a mídia.
5. Resuspender as bactérias em 1 mL de soro soro alvejado de fosfato (PBS), depois centrífuga sacada a 1.470 x g por 15 min.
6. Decante a mídia e resuspenda as pelotas lavadas na PBS para um OD₆₀₀ = 2 final.
7. Se desejar, adicione 10,1 μL de cianeto carbonil 3-clorofenihididágua (CCCP, 10 mM em PBS) a 1 mL de bactérias (concentração final de 100 μM) e incubar a 37 °C por 10 min.
   NOTA: CCCP é um inibidor da bomba efflux. A adição da CCCP permitirá o exame do impacto da efflux.
8. Centrífuga sicule as culturas a 18.000 x g por 4 min a 20 °C e decante a mídia.
9. Adicione 1 mL de solução de antibiótico fluorescente (10-100 μM em PBS) à pelota, e incuba a 37 °C por 30 min.
10. Centrífuga sicule as culturas a 18.000 x g por 7 min a 4 °C e decante a mídia.
11. Resuspender as bactérias em 1 mL de PBS frio, e repita a etapa 4.9.
12. Repita o passo 4.10 um total de 4x.
13. Se desejar, as bactérias lise adicionando 180 μL de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 2 mM edta de sódio) em seguida 70 μL de lysozyme (72 mg/mL em H₂O).
14. Incuba-se a 37°C por 30 min, depois congele-degelo 3x (-78 °C para 5 min, depois 34 °C para 15 min).
15. Sone as amostras por 20 min, depois aqueça até 65 °C por 30 min.
16. Centrífuga sed amostras (18.000 x g, 8 min), em seguida, filtrar através de uma membrana de filtro de 10 kDa.
17. Lave o filtro o 4x com 100 μL de água.
18. Transfira o lysato para uma placa preta de fundo plano 96 e meça a intensidade da fluorescência em um leitor de placa com comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados para o fluoroforre (ou seja, DMACA: λ_ex = 400 nm, λ_em = 490 nm; NBD: λ_ex = 475 nm, λ_em = 545 nm).
    NOTA: Veja a Figura 3 como exemplos de análises espectrofotométricas de bactérias usando o antibiótico de ciprofloxacina com rótulo NBD fluorescente.
19. Para análise por citometria de fluxo, podem ser utilizadas as mesmas condições de crescimento e coloração (etapas 4.1-4,17), com mudanças exclusivamente na preparação final.
    1. Leve o volume total para 1 mL de PBS.
    2. Leia amostras em um címetro de fluxo a uma taxa de fluxo de aproximadamente 60 μL/min, utilizando amplificação logarítmica para aquisição de dados (excitação de F1 = 488 nm; emissão = 525/20 nm).
    3. Registre um total de 10.000 eventos e, em seguida, analise os dados usando software apropriado.
    4. Traçar a intensidade da fluorescência da F1 contra o número de ocorrências, estimando a intensidade mediana da fluorescência dos picos de histograma depois que a bactéria foi manchada.
       NOTA: Veja a Figura 4 como exemplos de análises de citometria de fluxo de bactérias usando o antibiótico ciprofloxacina com rótulo NBD.

5. Preparação para Análise Microscópica

1. Cresça subculturas para OD₆₀₀ = 0,4, quanto à avaliação do MIC, depois divida em 1 mL alíquotas e centrífugas em 18.000 x g por 3-5 min.
2. Decante e descarte mídia, em seguida, resuspender a pelota bacteriana em 500 μL de HBSS.
3. Centrífuga a 18.000 x g por 3 min, depois decanta e descarta mídia.
4. Prepare soluções de sondas de antibióticos no HBSS em concentrações de 1 a 100 μM.
5. Resuspender as bactérias lavadas em 500 μL da solução da sonda, e incuba a 37 °C por 30 min.
6. Repita o passo 5.3. Para um experimento de rotulagem múltipla, resuspenda a pelota em 500 μL de um corante ácido nucleiano de cor ortogonal. Para verde, use Syto9 (5 μM em HBSS); para azul, use Hoechst 33342 (20 μg/mL no HBSS). Incubar na RT por 15-30 min.
7. Repita a etapa 5.3, depois resuspenda em 500 μL de FM4-64FX (5 μg/mL no HBSS) e incuba r$ 5 min.
8. Repita a etapa 5.3, depois resuspenda em 500 μL de HBSS e repita a etapa 5.3 mais uma vez.
9. Repita a etapa 5.8, depois suspenda as bactérias lavadas e dyed em 15 μL de meio de montagem (ver Tabela de Materiais).
10. Pipette montando meio em um slide de microscópio e cubra com um deslizamento de tampa de alto desempenho, em seguida, selar bordas com esmalte claro.
    NOTA: Veja a Figura 5 como exemplos de imagens de microscopia confocal tiradas com antibióticos de ciprofloxacina e trimetoprim com rótulo de NBD, e figura 6 para antibiótico de oxazolidinona com rótulo DMACA (linezolid).

Figura 1 Ilustra a reação química do clique-chave (A)para a preparação dos antibióticos fluorescentes, e com (B) exemplos de estruturas de nossos antibióticos fluorescentes publicados à base de ciprofloxacina (cipro), trimethoprim (TMP) e linezolid. Todas essas sondas foram sintetizadas a partir dos antibióticos correspondentes através de um intermediário azida. Eles foram então acoplados aos fluoroforos NBD e DMACA, cada um funcionalizado com uma alquina.

A Figura 2 mostra exemplo lcms traços de uma reação de clique ciprofloxacin-N3 e NBD-alkyne, onde o azida elutou a 3,2 min e o produto a 3,8 min. Comparar 1 e 2 mostra como o progresso da reação do clique poderia ser seguido pelo desaparecimento do pico azide (por UV ou detector de MS). O Espectro 3 demonstra o impacto da purificação, com picos errôneos desaparecendo dos traços de MS e UV. Tanto o progresso da pureza quanto da reação podem ser quantificados pela integração do pico do produto e quaisquer picos de impureza.

A Figura 3 demonstra resultados típicos da avaliação do acúmulo intracelular por espectroscopia de fluorescência na presença e ausência de efflux. Neste experimento, a E. coli foi tratada com TMP-NBD com ou sem a adição da CCCP, que desaba da força motriz próton (PMF). A fluorescência intracelular da bactéria foi significativamente maior quando pré-tratada com CCCP, indicando que a efflux reduziu o acúmulo dessas bactérias. Este experimento foi repetido usando bactérias deficientes no TOLC,mostrando a capacidade deste ensaio para examinar o impacto dos componentes individuais da bomba efflux. Neste caso, embora tenha havido um aumento da fluorescência intracelular em relação às bactérias do tipo selvagem, o acúmulo de CCCP ainda aumentou. Esses achados indicam que o TOLC participa da EFFLUX inTMP, mas não é a única bomba de movimentação de PMF envolvida.

A Figura 4 mostra o resultado do mesmo experimento da Figura 2,mas com o acúmulo medido pela citometria de fluxo em vez de espectroscopia. As mesmas tendências de dados foram observadas, demonstrando que qualquer técnica pode ser usada para estudar o fenômeno do acúmulo intracelular mediado pela efflux.

A Figura 5 mostra imagens representativas de microscopia confocal de gram-positive (S. aureus) e bactérias gram-negativas(E. coli) rotuladas com TMP-NBD (1) e cipro-NBD ( 2+ 3) sondas fluorescentes, respectivamente. Em ambos os casos, foi adicionado o corantes da membrana vermelha FM4-64FX para comparar a co-localização. Para tmp-NBD, também foi utilizado o dye ácido nucleico azul Hoechst-33342. Ao sobrepor essas imagens, a localização do antibiótico na bactéria foi visualizada. Comparar painéis 2 e 3 mostra como foi examinado o impacto da efflux, com o inibidor de efflux CCCP utilizado em 2,resultando em acúmulo intracelular. No painel 3,nenhum CCCP foi adicionado. Assim, a efflux está ativa e nenhum acúmulo de sonda foi visto.

A Figura 6 mostra imagens representativas de microscopia confocal de bactérias Gram-positive (S. aureus) rotuladas com a sonda de oxazolidinona com rótulo DMACA Lz-NBD. O corante de membrana vermelha FM4-64FX foi adicionado para comparar a co-localização, e o corante ácido nucleico verde Hoechst-33342 também foi usado. Ao sobrepor essas imagens, a localização do antibiótico na bactéria foi visualizada, mostrando localização interna distinta da membrana e ácido nucleico.

A Tabela 1 mostra valores MIC para três séries de antibióticos fluorescentes, ciprofloxacina, trimetoprim (TMP) e linezolid (Lz), com dados apresentados para os derivados do antibiótico pai, NBD e DMACA de cada um. Espécies representativas para cada antibiótico foram escolhidas, incluindo grama-positivo e grama negativo. Para a série ciprofloxacina, ambas as sondas fluorescentes perderam a atividade antibiótica em comparação com a droga-mãe, mas mantiveram alguma atividade contra todas as espécies. Da mesma forma, as sondas linezolid perderam alguma atividade, mas permaneceram um antibiótico moderado a fraco. As sondas TMP perderam quase toda a atividade contra bactérias do tipo selvagem, mas estavam ativas contra efflux deficiente E. coli,indicando que a perda de atividade antibacteriana foi devido à falta de acúmulo.

Figura 1: Síntese e estruturas de sondas derivadas de antibióticos. (A)O esquema de reação geral para a síntese de sondas de antibióticos fluorescentes de antibióticos azidas e alquine-fluoroforres. (B)As estruturas de nossas sondas publicadas baseadas em ciprofloxacina, trimetoprim e linezolid. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Medição da pureza da sonda derivada de antibióticos pela LCMS. LcMS analítico traça de (1) incompleto, (2) completo, e (3) HPLC purificado ciprofloxacin-N3 + NBD-alkyne clique reações demonstrando o desaparecimento do material inicial após a conclusão da reação, e picos diversos sobre a purificação. A = traço UV-Vis (absorção a 250 nm), B = traço MS (modo positivo e negativo). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 3: Medição do leitor de placas de acúmulo de sondas derivadas de antibióticos. Fluorescência espectroscópica medição do acúmulo celular de TMP-NBD (50 μM) em tipo selvagem (1, ATCC 25922) e ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli incubado(A) com e(B) sem adição de CCCP (100 μM). A significância estatística (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) é mostrada entre a ausência ou presença de CCCP e entre o tipo selvagem e δtolCE. coli. Os dados relatados são a média ± SD para três experimentos. Esse número é adaptado da nossa publicação anterior15, e ilustra o uso da espectroscopia para elucidar o papel da efflux no acúmulo intracelular. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 4: Medição de citometria de fluxo do acúmulo de sondas derivadas de antibióticos. Medição de citometria de fluxo de acúmulo celular utilizando TMP-NBD em tipo selvagem (1, ATCC 25922) e ΔtolC (2, ATCC 25922) E. colicubado com e sem adição de CCCP (100 μM). A atividade mediana de fluorescência é mostrada a partir de 10.000 eventos bacterianos, significância estatística (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) é mostrada entre a ausência e presença de CCCP e entre o tipo selvagem e δtolCE. coli. Os dados relatados são a média ± SD para três experimentos. Esse número é adaptado da nossa publicação anterior15, e ilustra o uso da citometria de fluxo para elucidar o papel da efflux no acúmulo intracelular. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 5: Visualização de microscopia confocal da localização da sonda NBD. Imagens de microscopia confocal de 1) S. aureus ao vivo rotuladas com Hoechst-33342 (ácido azul, nucleico), TMP-NBD (verde), FM4-64FX (vermelho, membrana) e sobreposto; 2) E. coli vivo tratado com CCCP (inibidor efflux) rotulado com cipro-NBD (verde), FM4-64FX (vermelho, membrana) e sobreposto; 3) E. coli ao vivo rotulado com cipro-NBD (verde), FM4-64FX (vermelho, membrana) e sobreposto. Esse número é adaptado de nossas publicações anteriores15,16, e ilustra o uso de microscopia para examinar a localização da sonda, incluindo o impacto da efflux. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 6: Visualização de microscopia confocal da localização da sonda DMACA. Imagens de microscopia confocal de S. aureus vivos rotulados com sonda de oxazolidinona Lz-DMACA (azul), verde Sytox (verde, ácido nucleico) e FM4-64FX (vermelho, membrana). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Mesa 1. Atividades antibióticos de sondas de antibióticos fluorescentes baseadas em ciprofloxacina, trimetoprim e linezolid contra cepas bacterianas clinicamente relevantes apropriadas, medida por ensaios mic de microdiluição caldo. Na maioria dos casos, as sondas perderam alguma atividade em comparação com a droga-mãe, mas retiveram alguma potência antibiótico mensurável (suficiente para ser útil em estudos posteriores).

Os autores não têm nada a declarar.