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Artigo de método

Avaliação da função de memória em camundongos epilépticos induzidos por pilocarpina

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DOI:

10.3791/60751

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4 de junho de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta procedimentos experimentais para avaliação de prejuízos de memória em camundongos epilépticos induzidos por pilocarpina. Este protocolo pode ser usado para estudar os mecanismos fisiosiológicos do declínio cognitivo associado à epilepsia, que é uma das comorbidades mais comuns na epilepsia.

Resumo

O comprometimento cognitivo é uma das comorbidades mais comuns na epilepsia do lobo temporal. Para recapitular o declínio cognitivo associado à epilepsia em um modelo animal de epilepsia, geramos camundongos epilépticos crônicos tratados com pilocarpina. Apresentamos um protocolo para três diferentes testes comportamentais usando esses camundongos epilépticos: localização de objetos novos (NL), reconhecimento de objetos novos (NO) e testes de separação de padrões (PS) para avaliar o aprendizado e a memória de lugares, objetos e contextos, respectivamente. Explicamos como definir o aparelho comportamental e fornecer procedimentos experimentais para os testes de NL, NO e PS após um teste de campo aberto que mede as atividades basais locomotor dos animais. Descrevemos também as vantagens técnicas dos testes de NL, NO e PS em relação a outros testes comportamentais para avaliação da função de memória em camundongos epilépticos. Finalmente, discutimos possíveis causas e soluções para ratos epilépticos que não conseguem fazer 30 s de bom contato com os objetos durante as sessões de familiarização, o que é um passo fundamental para testes de memória bem sucedidos. Assim, este protocolo fornece informações detalhadas sobre como avaliar os prejuízos de memória associados à epilepsia usando camundongos. Os testes DE NL, NO e PS são ensaios simples e eficientes que são apropriados para a avaliação de diferentes tipos de memória em camundongos epilépticos.

Introdução

Epilepsia é uma doença crônica caracterizada por convulsões espontâneas recorrentes1,,2,3. Como convulsões repetitivas podem causar anormalidades estruturais e funcionais no cérebro1,,2,3, a atividade convulsiva anormal pode contribuir para a disfunção cognitiva, que é uma das comorbidades associadas à epilepsia mais comuns4,,5,6. Ao contrário dos eventos de convulsão crônica, que são transitórios e momentâneos, os prejuízos cognitivos podem persistir ao longo da vida dos pacientes epilépticos, deteriorando sua qualidade de vida. Por isso, é importante compreender os mecanismos fisiofiológicos do declínio cognitivo associado à epilepsia.

Vários modelos experimentais de epilepsia têm sido utilizados para demonstrar os déficits de aprendizagem e memória associados à epilepsia crônica7,,8,,9,,10,,11,12. Por exemplo, o labirinto de água morris, condicionamento de medo contextual, quadro de buracos, localização de objetos novos (NL) e novos testes de reconhecimento de objeto (NO) têm sido frequentemente usados para avaliar a disfunção da memória na epilepsia do lobo temporal (TLE). Como o hipocampo é uma das principais regiões em que a TLE mostra patologia, testes comportamentais que podem avaliar a função de memória dependente do hipocampo são muitas vezes selecionados preferencialmente. No entanto, dado que as convulsões podem induzir neurogênese hipocampal aberrante e contribuir para o declínio cognitivo associado à epilepsia10, paradigmas comportamentais para testar a função neuronal recém-nascida dento (ou seja, separação de padrão espacial, PS)8,13 também podem fornecer informações valiosas sobre os mecanismos celulares de prejuízos de memória na epilepsia.

Neste artigo, demonstramos uma bateria de testes de memória, NL, NO e PS, para ratos epilépticos. Os testes são simples e de fácil acesso e não exigem um sistema sofisticado.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Católica da Coreia e foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NNI Publicações nº 80-23).

1. Novo teste de localização de objeto (NL)

  1. Prepare o epiléptico C57BL/6 ou camundongos transgênicos 4-6 semanas após a injeção de pilocarpina.
    NOTA: As convulsões agudas foram induzidas pela injeção de pilocarpina intraperitoneal (IP), seguindo o protocolo detalhado em nosso relatório anterior14.
  2. Transfira os camundongos epilépticos da sala de reprodução para a sala de comportamento um dia antes do início dos testes comportamentais. Deixe os ratos habituarem pelo menos 12h durante a noite.
  3. Na sala de comportamento, separe ratos individuais em novas gaiolas para uma única carcaça. Escreva as informações para cada animal no cartão da gaiola e mantenha os animais nas mesmas gaiolas durante os testes comportamentais. Várias gaiolas podem ser transferidas simultaneamente usando um carrinho.
  4. No dia seguinte, começam 3 dias de sessões de habituação (H1-H3) no início da manhã. Aclimate os animais à luz baixa em suas gaiolas por pelo menos 30 minutos.
  5. Prepare uma caixa de campo aberto com dimensões externas de 44 x 44 x 31 cm e dimensões internas de 43 x 43 x 30,5 cm. No primeiro dia da habituação (H1), coloque um illuminômetro no centro da caixa de campo aberto e ajuste a iluminação para 60 lux.
  6. Pulverize o chão e as paredes da caixa de campo aberto com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel limpa para remover possíveis pistas olfativas. Em seguida, espere pelo menos 1 min até que o álcool residual tenha secado completamente.
  7. Avalie a atividade locomotor de cada mouse realizando um teste de campo aberto.
    1. Para registrar e acompanhar o comportamento de cada mouse experimental, use o software de rastreamento de vídeo de comportamento animal (ver Tabela de Materiais).
    2. Uma vez aberto o software de rastreamento de vídeo, calibrar o tamanho da caixa de campo aberto. Em seguida, defina a zona para rastreamento. Ajuste 3 s de latência e 15 minutos de tempo de aquisição para evitar rastrear as mãos de um experimentador. Insira as informações sobre cada mouse experimental (grupo, sexo, idade, etc.).
    3. Em seguida, coloque suavemente um mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede. Faça isso colocando-o na tampa da gaiola para minimizar o estresse e a ansiedade associados ao manuseio. Em seguida, solte o mouse perto da parede da caixa de campo aberto que é o mais distante de onde os objetos estarão durante a sessão de familiarização (passo 1.9.3.).
      NOTA: Uma vez que o mouse esteja na caixa de campo aberto, o software de rastreamento do mouse irá detectá-lo automaticamente e começar a gravar. Para um acompanhamento ideal da exploração, a câmera pode ser colocada diretamente acima da caixa de campo aberto.
    4. Após 15 minutos de gravação, devolva o animal à gaiola, colocando-o na tampa da gaiola. Limpe a caixa de campo aberto com 70% de spray de etanol e limpe com uma toalha de papel limpa entre os ensaios. Restaure a luz brilhante e meça a distância total do animal movida usando o software de rastreamento de vídeo de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Abra o software de rastreamento de vídeo e clipes de vídeo. Em seguida, clique em Análise para calcular a distância total movida com base na calibração do tamanho da caixa de campo aberto.
  8. No dia 2 e dia 3, realize as sessões de habituação (H2, H3) repetindo as etapas 1.3 a 1.7.
  9. No dia 4, realize a sessão de familiarização (F1).
    1. Na luz fraca, coloque cada rato no campo aberto vazio por 3 minutos. Depois dessa breve reabilitação, devolva o animal para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos com 70% de etanol e limpe-os com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque dois objetos idênticos (bonecas de borracha, objeto A) na arena de campo aberto a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto, de frente para a parede mais distante dos objetos.
    4. Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração (30 s) para ambos os objetos, pare a sessão de F1 e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Se o mouse não explorar os objetos por 30 s dentro de 20 minutos, remova o mouse da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões.
    5. Depois que o animal for removido da caixa de campo aberto, limpe completamente o chão e as paredes da caixa com 70% de spray de etanol e limpe-os com uma toalha de papel.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
  10. No dia 5, realize a sessão de testes da NL.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para a área de campo aberto para reabilitação por 3 minutos. Então devolva o animal para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos com 70% de etanol e limpe-os com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Mova um objeto (boneca de borracha, objeto A) para a posição diagonal, 5 cm de distância das paredes adjacentes. Corrija o objeto com fita dupla face. Transfira o mouse experimental em sua tampa da gaiola para a área de campo aberto e coloque-o de frente para a parede da caixa de campo aberto.
      NOTA: Contrabalancear a localização do objeto movido para reduzir qualquer preferência potencial inata por uma determinada direção. Por exemplo, altere a localização do objeto preferido da sessão de familiarização para metade dos animais experimentais e, para o resto dos animais, mova o objeto menos preferido da sessão de familiarização.
    4. Permita 10 minutos de exploração gratuita e registro com um sistema de rastreamento de vídeo. Meça o tempo gasto explorando cada objeto usando dois cronômetros e calcule a razão de discriminação como
      figure-protocol-1
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    5. Pegue a cauda do rato experimental e coloque-o em sua tampa da gaiola para transferência para sua gaiola. Durante 3 dias (dias 6 a 8), deixe o mouse descansar com acesso gratuito a comida e água.
    6. Uma vez que o animal seja removido da caixa de campo aberto, limpe completamente o chão e as paredes da caixa com 70% de spray de etanol e limpe com uma toalha de papel.

2. Novo teste de reconhecimento de objeto (NÃO)

  1. No dia 9, realize uma sessão de habituação de 15 minutos repetindo as etapas 1.2-1.7.
  2. No dia 10, realize a sessão de familiarização (F1).
    1. Em luz fraca, coloque o mouse no campo aberto vazio por 3 minutos. Depois de reabilitar o rato para a área de campo aberto, devolvê-lo temporariamente para sua gaiola doméstica.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque dois objetos idênticos (tubos plásticos de 50 mL cheios com 40 mL de água, objeto B) no campo aberto a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede mais distante dos objetos.
    4. À medida que o animal é exposto aos dois objetos diferentes (tubo plástico de 50 mL cheio com 40 mL de água, objeto B; jarra de vidro Coplin, objeto C) no teste NO, contrabalancear o objeto durante a sessão de F1. Por exemplo, apresentar dois objetos idênticos (frascos de vidro Coplin, objeto C) para metade dos animais do grupo.
    5. Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração (30 s) para ambos os objetos, pare a sessão de F1 e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Se o mouse não explorar os objetos por 30 s dentro de 20 minutos, remova-o da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões.
    6. Depois que o animal for removido da caixa de campo aberto, limpe completamente o chão e as paredes da caixa com 70% de spray de etanol e limpe-os com uma toalha de papel.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
  3. No dia seguinte (dia 11), realize a sessão de testes NO.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para o campo aberto para reabilitação por 3 minutos, e depois devolva o animal para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Substitua um objeto (tubo plástico de 50 mL cheio com 40 mL de água, objeto B) por outro objeto (frasco de vidro Coplin, objeto C) 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Transfira o mouse experimental na tampa da gaiola para o campo aberto, e coloque-o de frente para a parede. Contrabalancear os objetos apresentados juntos durante o teste NO. Por exemplo, substitua um frasco de vidro Coplin (objeto C) por um tubo plástico de 50 mL preenchido com 40 mL de água (objeto B) para os ratos expostos aos dois frascos de vidro Coplin (objeto C) durante a sessão de familiarização.
      NOTA: O contrabalamento da localização do objeto substituído também pode ser realizado para reduzir a preferência potencial inata por uma determinada direção. Por exemplo, para cada coorte dos animais expostos ao conjunto de dois objetos (objeto B ou objeto C), altere o objeto preferido na sessão de familiarização para metade dos animais experimentais e, para o resto dos animais, substitua o objeto menos preferido na sessão de familiarização.
    4. Permita 10 minutos de exploração gratuita e grave-o usando um sistema de rastreamento de vídeo. Meça o tempo gasto explorando cada objeto usando dois cronômetros e calcule a razão de discriminação.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    5. Pegue a cauda do rato experimental e coloque-o na tampa da gaiola para transferência para sua gaiola. Durante 3 dias (dias 12 a 14), deixe o rato descansar com acesso gratuito a comida e água.
    6. Uma vez que o animal seja removido da caixa de campo aberto, limpe completamente o chão e as paredes da caixa de campo aberto com 70% de spray de etanol e limpe com uma toalha de papel.

3. Teste de separação de padrões (PS)

  1. No dia 15, realize a primeira sessão de familiarização (F1) para o teste de PS.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para a área de campo aberto para reabilitação por 3 minutos, e depois devolva-o para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos e a placa de piso gridded com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque a placa do piso (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) com a grade larga (5,5 x 5,5 cm) na caixa de campo aberto e coloque dois objetos idênticos (frascos T de plástico preenchidos com 50 mL de água, objeto D) no campo aberto a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede mais distante dos objetos.
    4. Como o animal é exposto a dois objetos diferentes (plástico T-flask preenchido com 50 mL de água, objeto D; garrafa de vidro, objeto E) no teste PS, contrabalancear o objeto durante as sessões de F1 e F2. Por exemplo, apresente dois objetos idênticos (garrafas de vidro, objeto E) no piso da grade larga para metade dos animais do grupo.
    5. Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração total (30 s) para ambos os objetos, pare a sessão de F1 e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Se o mouse não explorar os objetos por 30 s dentro de 20 minutos, remova-o da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    6. Após a conclusão da primeira sessão de familiarização (F1), limpe completamente os objetos e a placa do chão com 70% de spray de etanol e remova-os da caixa de campo aberto.
  2. No dia seguinte (dia 16), realize a segunda sessão de familiarização (F2) para o teste PS.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para a área de campo aberto para reabilitação por 3 minutos, e depois devolva o animal para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe minuciosamente os objetos e a placa de piso gridded com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque a placa do piso (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) com a grade estreita (2,75 x 2,75 cm) na caixa de campo aberto e coloque dois objetos idênticos (garrafas de vidro, objeto E) no campo aberto a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede mais distante dos objetos.
    4. Para contrabalançar, apresente dois objetos idênticos (frascos T de plástico preenchidos com 50 mL de água, objeto D) no piso estreito da grade.
    5. Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração total (30 s) para ambos os objetos, pare a sessão F2 e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Se o mouse não explorar os objetos por 30 s dentro de 20 minutos, remova-o da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    6. Após a conclusão da segunda sessão de familiarização (F2), limpe completamente os objetos e a placa do piso com 70% de spray de etanol e remova-os da caixa de campo aberto.
  3. No dia seguinte (dia 17), realize a sessão de testes ps.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para a área de campo aberto para reabilitação por 3 minutos, e depois devolva-o para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe minuciosamente os objetos e a placa de piso gridded com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque a placa do piso com a grade estreita (2,75 x 2,75 cm) na caixa de campo aberto e coloque dois objetos diferentes (plástico T-flask cheio com 50 mL de água, objeto D; garrafa de vidro, objeto E) na placa de piso a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Transfira o mouse experimental na tampa da gaiola para a área de campo aberto e coloque-o de frente para a parede.
    4. Contrabalancear os objetos apresentados juntos durante o teste PS. Por exemplo, coloque cada objeto (objeto D, objeto E) no piso de grade estreita para fazer do objeto E um novo objeto neste contexto. Contrabalaçar a localização do objeto D ou objeto E (um novo objeto no padrão de piso estreito) também pode ser realizado para reduzir o potencial de uma preferência inata por uma determinada direção. Por exemplo, substitua o objeto preferido da segunda sessão de familiarização por metade dos animais experimentais e, para o resto dos animais, substitua o objeto menos preferido da segunda sessão de familiarização.
    5. Permita 10 minutos de exploração gratuita e registro usando um sistema de rastreamento de vídeo. Meça o tempo gasto explorando cada objeto usando dois cronômetros e calcule a razão de discriminação.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    6. Pegue a cauda do rato experimental e coloque-o na tampa da gaiola para transferência para sua gaiola.

4. Mancha violeta cresyl

  1. Após completar todos os testes comportamentais, anestesia o animal injetando um coquetel (4:0.5) de cetamina (50 mg/mL) e xilazina (23,3 mg/mL) dissolvido em soro fisiológico a uma dose de 110 mL/kg de peso corporal (IP; 1 mL de seringa; agulha de 26 G). Verifique a profundidade da anestesia pela falta de uma resposta a uma pitada de dedo do dedo do sol.
  2. Uma vez que o animal esteja profundamente anestesiado, realize a perfusão transcárlica com 4% de paraformaldeído para corrigir o cérebro15.
  3. Após o término da perfusão transcárdia, decapite o animal com uma tesoura15. Então, remova o crânio usando uma tesoura de íris para expor o cérebro. Depois que o cérebro é isolado, pós-fixá-lo em 4% de paraformaldeído durante a noite, seguido de crioproteção em 30% de sacarose em 0,01 M salina tamponada com fosfato.
  4. Faça seções coronais (30 μm) do cérebro congelado por estalo usando um criostat.
  5. Monte os tecidos cerebrais em lâminas e realize uma série de passos de hidratação de 100% de etanol para água da torneira lavando por 3 min sequencialmente em 100%, 95%, 90%, 80%, 70% etanol.
  6. Incubar as lâminas de tecido em solução violeta de 0,1% por 15 min.
  7. Remova a mancha excessiva imergindo as lâminas teciduais em 95% de etanol/0,1% ácido acético glacial e, em seguida, desidratar os tecidos com soluções de 100% etanol, 50% etanol/50% xileno e 100% xileno.
  8. Cubra as lâminas de tecido usando um meio de montagem de xileno disponível comercialmente.

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Resultados

Um cronograma experimental geral e uma configuração para avaliação da função cognitiva são mostrados na Figura 1. Seis semanas após a introdução de convulsões agudas induzidas por pilocarpina, os camundongos foram submetidos aos testes de NL, NO e PS nessa ordem separados por períodos de descanso de 3 dias entre os testes(Figura 1A). Para o teste NL, dois objetos idênticos foram colocados no campo aberto durante a sessão de familiarização (F1), e no dia seguinte...

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Discussão

Este trabalho descreve procedimentos experimentais para avaliação da função cognitiva em camundongos com epilepsia crônica. Muitos paradigmas de teste comportamental diferentes são usados para avaliar funções de aprendizagem e memória em camundongos18. O labirinto de água morris, labirinto de braço radial, labirinto Y, condicionamento de medo contextual e testes baseados em objetos são os testes comportamentais mais usados e fornecem resultados confiáveis. Entre eles, os testes de NL, NO e PS são ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Jae-Min Lee pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 1 mlCalço Sung-shimUse com a agulha de calibre 26 ou 30
70% EtanolDuksanUN1170Spray para limpar a caixa e objetos
cortinaPara evitar pistas visuais desnecessárias
Violeta CresylSigmaC5042de coloração violeta Cresil
LeicaE21040041Para tecido seccionamento
adesiva dupla facePara a colocação firme dos objetos
Meio de montagem DPXSigma06522
série de etanolDuksanUN1170Fazer 100%, 95%, 90%, 80%, 70% de soluções de etanol
placa de piso com padrões de grade estreitaLeehyo-bioEquipamento de experimento comportamental, tamanho da placa: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, tamanho da grade: 2,75 x Placa de piso de 2,75 cm
com padrões de grade largaLeehyo-bioEquipamento de experimento comportamental, tamanho da placa: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, tamanho da grade: 5,5 x 5,5 cm
iluminômetroTES Electrical Electronic Corp.1334APara a medição da iluminação da sala (60 Lux)
Unidade de terapia intensivaThermocare#W-1
cloridrato de cetaminaYuhan7003Use para anestesiar o mouse para perfusão transcárdica
Lâmpada LEDLungoP13A-0422-WW-04Iluminação para os objetos
da sala de teste comportamentalBoneca de borracha, tubo de plástico de 50 ml, frasco de vidro Coplin, frasco em T de plástico, caixa de campo aberto de garrafa de vidro
Leehyo-bioEquipamento de experimento comportamental, tamanho: 44 x 44 x 31 cm
toalha de papelYuhan-Kimberly47201Use para secar caixa de campo aberto e objetos
paraformaldeídoMerck Millipore104005Faça solução de 4%
cloridrato de pilocarpinaSigmaP6503
Use para localizar os objetos na caixa de campo aberto
escopolamina nitrato de metilaSigmaS2250Faça 10X estoque
Sistema inteligente 3.0PanlabSistema de rastreamento de vídeo
cronômetroJunsoJS-307Para a medição de atividades exploratórias de sacarose de camundongos
SigmaS9378Para crioproteção de seções de tecido
sal de hemissulfato de terbutalinaSigmaT2528Faça 10X câmera de vídeo de estoque
(câmera CCD)VisionVCE56HQ-12Coloque a câmera diretamente acima da caixa de campo aberto
xilazina (Rompun)Bayer coréiaKR10381Use para anestesiar o mouse para perfusão transcárdica
xilenoDuksanUN1307Para Coloração violeta Cresyl
preta Para criótomo de fita régua

Referências

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

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