Mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina de longo alcance de neurônios de coláculo inferior com canaldopsinas de mudança azul e vermelha

David Goyer; Michael T. Roberts

doi:10.3791/60760

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Artigo de método

Mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina de longo alcance de neurônios de coláculo inferior com canaldopsinas de mudança azul e vermelha

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DOI:

10.3791/60760

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7 de fevereiro de 2020

David Goyer¹ , Michael T. Roberts¹

¹Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

Neste artigo

Resumo

O mapeamento de circuitoassistido pela canaldopsina (CRACM) é uma técnica de precisão para o mapeamento funcional de projeções neuronais de longo alcance entre grupos anatomicamente e/ou geneticamente identificados de neurônios. Aqui, descrevemos como utilizar o CRACM para mapear conexões cérebros auditivas, incluindo o uso de uma opsina de mudança vermelha, ChrimsonR.

Resumo

Ao investigar circuitos neurais, uma limitação padrão da abordagem do grampo de patch in vitro é que axônons de múltiplas fontes são frequentemente intermisturadas, dificultando a isoposição de entradas de fontes individuais com estimulação elétrica. No entanto, usando o mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina (CRACM), essa limitação agora pode ser superada. Aqui, relatamos um método para usar o CRACM para mapear entradas ascendentes de núcleos cerebrais auditivos inferiores e entradas commissivas para uma classe identificada de neurônios no colliculus inferior (IC), o núcleo do cérebro médio do sistema auditivo. No IC, axônons locais, comissários, ascendentes e descendentes estão fortemente entrelaçados e, portanto, indistinguíveis com estimulação elétrica. Injetando uma construção viral para conduzir a expressão de uma canaldopsina em um núcleo presinaptico, seguido de gravação de grampo de patch para caracterizar a presença e a fisiologia de entradas sinápticas expressando canaldopsina, projeções de uma fonte específica para uma população específica de neurônios IC pode ser mapeado com precisão específica do tipo celular. Mostramos que essa abordagem funciona com chronos, uma canaldopsina azul ativada pela luz, e ChrimsonR, uma canaldopsina de mudança vermelha. Em contraste com relatórios anteriores do cérebro anterior, descobrimos que ChrimsonR é robustamente traficado para baixo os axôngos de neurônios principais do núcleo coclear dorsal, indicando que chrimsonR pode ser uma ferramenta útil para experimentos CRACM no tronco cerebral. O protocolo aqui apresentado inclui descrições detalhadas da cirurgia intracraniana de injeção de vírus, incluindo coordenadas estereotaxicas para injeções direcionadas ao núcleo coclear dorsal e IC de camundongos, e como combinar gravação completa do grampo de patch celular com a ativação da canaldopsina para investigar projeções de longo alcance para neurônios IC. Embora este protocolo seja adaptado para caracterizar insumos auditivos para o IC, ele pode ser facilmente adaptado para investigar outras projeções de longo alcance no cérebro auditivo e além.

Introdução

As conexões sinápticas são críticas à função do circuito neural, mas a topologia precisa e a fisiologia das sinapses dentro de circuitos neurais são muitas vezes difíceis de sondar experimentalmente. Isso porque a estimulação elétrica, a ferramenta tradicional de eletrofisiologia celular, ativa indiscriminadamente axônhons perto do local de estimulação, e na maioria das regiões cerebrais, axônons de diferentes fontes (local, ascendente e/ou descendente) entrelaçam-se. No entanto, usando o mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina (CRACM)¹^,², essa limitação agora pode ser superada³