Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.
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Artigo de método
Etiquetagem Dextran e Captação em Células Capilares Murina Coclear
Neste artigo
Resumo
Resumo
O canal de mecanotransção de células para cabelo (MET) desempenha um papel importante na audição. No entanto, a identidade molecular e as informações estruturais do MET permanecem desconhecidas. Estudos eletrofisiológicos de células ciliadas revelaram que o canal MET tem uma grande condução e é permeável a moléculas cationic fluorescentes relativamente grandes, incluindo alguns corantes isofiis e antibióticos de aminoglicolado com rótulo vermelho do Texas. Neste protocolo, descrevemos um método para visualizar e avaliar a captação de dextrans fluorescente em células ciliadas do órgão de corti explantas que podem ser usadas para ensaio para canais MET funcionais. Descobrimos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran especificamente rotula células ciliadas auditivas funcionais após 1-2 h de incubação. Em particular, 3 kDa dextran rotula as duas linhas de estereoilia mais curtas e se acumula no corpo celular em um padrão difuso quando os canais MET funcionais estão presentes. Um padrão adicional de rotulagem semelhante a vesícula foi observado no corpo celular das células ciliadas e nas células de suporte circundantes. Nossos dados sugerem que 3 kDa Texas-Red dextran pode ser usado para visualizar e estudar duas vias para a captação de tinta celular; uma rota de entrada específica para células para celular através de canais MET funcionais e endocitose, um padrão também disponível para dextran maior.
Introdução
As células ciliadas do ouvido interno são as células sensoriais que detectam som e encobrem os estímulos mecanicamente em sinais elétricos, que são finalmente interpretados pelo nosso cérebro. Essas células têm um feixe em forma de escadaria de três fileiras de filamentos à base de actin, conhecidos como estereoilia, que se projetam de sua região apical1,2. Os estímulos mecânicos desviam os filamentos estereoilia em direção à linha mais longa e desencadeiam a abertura dos canais de mecanotransdução (MET)3. A abertura dos canais MET leva a um fluxo de cárinos que despolariza a célula e, ....
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Protocolo
Os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados seguindo as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais, que foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (Protocolo Animal #1336 ao KJS).
1. Ratos
- Coloque um par de pares de c57BL/6J do tipo selvagem para procriar na instalação animal para controlar a data de nascimento das ninhadas e acompanhar a idade dos filhotes.
2. Dissecção de Cochleae
- Coloque um espaço limpo perto de um estereótipo para realizar as dissecções....
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Resultados
Observamos rotulagem robusta e específica de células ciliadas após 2h de incubação de órgão séti de camundongos pós-parto-6 (P6) do tipo selvagem com 3 kDa dextran fluorescente rotulados com Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). A rotulagem Dextran foi observada em células capilares internas e externas (IHC e OHC) nas regiões basal, média e apical do órgão de Corti (Figura 2B).
A phalloidina rotulada .......
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Discussão
Este protocolo descreve como realizar experimentos de captação em órgão surina de explants corti com 3 kDa dextran Texas Red. O objetivo deste método é testar se moléculas maiores do que outras testadas anteriormente também foram capazes de rotular especificamente células ciliadas auditivas e permear através do canal MET. Protocolos experimentais semelhantes foram usados anteriormente para avaliar a permeabilidade das células ciliadas para outros corantes fluorescentes, como FM1-43 (0,56 kDa)12
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Vincent Schram, do núcleo de microscopia e imagem nichd, por ajudar na aquisição de imagens confocais, e tsg-Hui Chang por ajuda inestimável com a gestão de colônias e cuidados com ratos. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, Bethesda, MD, para K.J.S. A.B. foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, e por uma Bolsa de Pós-Doutorado Robert Wenthold do programa de pesquisa intramural do NIDCD.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #1.5 lamínulas de vidro 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Faloidina | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Faloidina | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Óleo Corr M27 objetiva | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Cloridrato de amilorida | EMD MILLIPORE | ||
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks científico | B3D5000 | |
| C57BL / 6J linhagem de camundongos do tipo selvagem | 000664 | A célula do laboratório | |
| impermeou o sal tetrapotássico BAPTA | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluoresceína, 10.000 MW, aniônico, lisina fixável | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10.000 MW, Lisina Fixável | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lisina Fixável | ThermoFisher | D3328 | |
| Solução Aquosa de Formaldeído Grau EM | Ciência da microscopia eletrônica | 15710 | |
| HBSS, cálcio, magnésio, sem vermelho de fenol | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J ou FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F meio de imersão em óleo | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Suplemento | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomicina trisulfato de sal hidratado | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Faloidina-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mídia de montagem | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus lâmina de microscópio | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
Referências
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 2....
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Reimpressões e permissões
