Artigo de método

Etiquetagem Dextran e Captação em Células Capilares Murina Coclear

DOI:

10.3791/60769

⸱

8 de fevereiro de 2020

 , 
1Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O canal de mecanotransção de células para cabelo (MET) desempenha um papel importante na audição. No entanto, a identidade molecular e as informações estruturais do MET permanecem desconhecidas. Estudos eletrofisiológicos de células ciliadas revelaram que o canal MET tem uma grande condução e é permeável a moléculas cationic fluorescentes relativamente grandes, incluindo alguns corantes isofiis e antibióticos de aminoglicolado com rótulo vermelho do Texas. Neste protocolo, descrevemos um método para visualizar e avaliar a captação de dextrans fluorescente em células ciliadas do órgão de corti explantas que podem ser usadas para ensaio para canais MET funcionais. Descobrimos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran especificamente rotula células ciliadas auditivas funcionais após 1-2 h de incubação. Em particular, 3 kDa dextran rotula as duas linhas de estereoilia mais curtas e se acumula no corpo celular em um padrão difuso quando os canais MET funcionais estão presentes. Um padrão adicional de rotulagem semelhante a vesícula foi observado no corpo celular das células ciliadas e nas células de suporte circundantes. Nossos dados sugerem que 3 kDa Texas-Red dextran pode ser usado para visualizar e estudar duas vias para a captação de tinta celular; uma rota de entrada específica para células para celular através de canais MET funcionais e endocitose, um padrão também disponível para dextran maior.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células ciliadas do ouvido interno são as células sensoriais que detectam som e encobrem os estímulos mecanicamente em sinais elétricos, que são finalmente interpretados pelo nosso cérebro. Essas células têm um feixe em forma de escadaria de três fileiras de filamentos à base de actin, conhecidos como estereoilia, que se projetam de sua região apical1,2. Os estímulos mecânicos desviam os filamentos estereoilia em direção à linha mais longa e desencadeiam a abertura dos canais de mecanotransdução (MET)3. A abertura dos canais MET leva a um fluxo de cárinos que despolariza a célula e, consequentemente, sinaliza a liberação de vesículas de sinapse na região basal da célula cilia.

As propriedades biofísicas do canal MET essenciais para a audição foram extensivamente caracterizadas. Entre outras propriedades, esses canais são seletivos cationic e possuem uma realização relativamente grande (150-300 pS em baixa Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Notavelmente, grandes moléculas fluorescentes como aminoglicoglicolados de marca vermelha do Texas são bloqueadores perversos do canal MET, resultando em seu acúmulo no corpo de células ciliadas que podem ser visualizados usando microscopia de fluorescência11,12,13,14. Por outro lado, a identidade molecular e a estrutura do canal MET e seu caminho de permeação permaneceram evasivos. Evidências experimentais crescentes indicam que a proteína do canal transmembrana 1 (TMC1) é um componente do canal MET em células ciliadas maduras15,16,17,18,19. Mutações no canal 1 (TMC1) alteram as propriedades do canal MET19,20,21,22 e causam surdez. Além disso, o TMC1 localiza o site do canal MET18,23 e interage com o tip-link responsável por transmitir a força mecânica para o canal MET24,25. Além disso, a recente análise bioinformática identificou as proteínas TMC como evolutivas relacionadas aos canais mecanosensíveis TMEM63/OSCA e as proteínas TMEM16, uma família de canais de cloreto ativados com cálcio e mexidas lipídicas26,27,28. Um modelo estrutural do TMC1 baseado na relação entre essas proteínas revelou a presença de uma grande cavidade na interface protein-lipídica27. Esta cavidade abriga as duas mutações TMC1 que causam perda auditiva autossômica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e modificação seletiva de mutantes de cisteína para resíduos nas propriedades do canal met da cavidade alter28,indicando que poderia funcionar como o caminho de permeação do canal MET. O grande tamanho dessa cavidade prevista em proteínas TMC poderia explicar a capacidade de grandes moléculas de permear o canal MET. Para testar a previsão de que o canal MET contém um caminho de permeação extraordinariamente grande e para empurrar os limites do tamanho da cavidade observada no TMC1, desenvolvemos um protocolo para realizar experimentos de captação no órgão de explantas corti com uma molécula maior, 3 kDa dextran fluorescente rotulado com Texas Red.

Dextran é um complexo polissacarídeo ramificado composto por muitas moléculas de glicose D amarradas por ligações glicosídicas alfa-1,6. Sua alta solubilidade em água, baixa toxicidade celular e bioinertidade fazem dela uma ferramenta versátil para estudar vários processos celulares. Além disso, o dextran está disponível em uma ampla gama de tamanhos e fluorescentemente rotulado com fluoroforres de várias cores. Dextrans rotulado fluorescente são comumente utilizados na pesquisa de permeabilidade celular e tecidual33,34, para estudar endocitose em múltiplos sistemas celulares35,36, e para rastreamento neural37,38. No campo auditivo, moléculas dextran também têm sido usadas para avaliar a interrupção da junção celular-célula e perda da integridade auditiva sensorial de epitélio após exposição ao ruído intenso no órgão chinchilla de Corti39,40.

Neste trabalho, exploramos as propriedades de algumas das menores (3 e 10 kDa) fluorescentes dextrans para realizar experimentos de captação em células de ouvido internos de murina e explorar o tamanho da via de permeação do canal MET da célula capilar interna do ouvido. Além disso, usamos um microscópio confocal de varredura a laser (LSM) 880 equipado com um detector de airyscan para visualizar e localizar dextran fluorescente na estereoilia e no corpo celular de células cilias auditivas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados seguindo as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais, que foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (Protocolo Animal #1336 ao KJS).

1. Ratos

  1. Coloque um par de pares de c57BL/6J do tipo selvagem para procriar na instalação animal para controlar a data de nascimento das ninhadas e acompanhar a idade dos filhotes.

2. Dissecção de Cochleae

  1. Coloque um espaço limpo perto de um estereótipo para realizar as dissecções (Figura 1A). Use 70% de etanol para limpar o espaço e o ambiente e coloque uma almofada de banco limpa. Um saco plástico de Resíduos Patológicos Médicos (MPW) seria necessário para descartar as carcaças dos animais.
  2. Prepare vários pratos de 35 mm com alguns meios de Leibovitz L15.
    NOTA: A mídia celular L-15 de Leibovitz contém 1-2 mM Ca2+, que é necessário para manter a integridade dos links de ponta, e contém aminoácidos essenciais, vitaminas e piruvate de sódio para melhorar a saúde e a sobrevivência das células. O soro foi excluído para evitar a variabilidade experimental devido à sua composição mal definida e potencial interferência com o dextran.
  3. Eutanize ratos pós-natal-6 (P6) por decapitação.
    NOTA: Ratos velhos de 6 dias são um pouco resistentes a anestésicos inaladores. Embora exposições de ISoflurane ou CO2 prolongadas (até 50 min) possam ser usadas para eutanásia, recomenda-se um método físico secundário para garantir a morte.
  4. Use tesouras cirúrgicas para remover a pele do crânio fazendo um corte superficial do anterior para a extremidade posterior e através dos canais auditivos externos.
  5. Dobre a pele em direção ao nariz para expor o crânio (Figura 2B).
  6. Faça uma incisão da parte de trás para a frente do crânio e através da linha dos olhos(Figura 2B-C).
  7. Separe o crânio em duas metades e remova o cérebro com o uso de uma pequena espátula para expor os ossos temporais (Figura 2C-D).
  8. Com uma tesoura pequena, corte em torno dos ossos temporais, e excisse o tecido.
  9. Coloque ambos os ossos temporais em um prato de 35 mm e certifique-se de que eles estão cobertos com mídia L15(Figura 2E).
    NOTA: As seguintes etapas são realizadas o estereótipo. Um fundo preto geralmente ajuda a visualizar o tecido durante as finas etapas de dissecção.
  10. um estereomicroscópio equipado com um ocular de campo largo (um poder de ampliação de 10X (WF10X) e uma fonte de luz halógena de corrente alternada externa (AC), remova o tecido cochleae circundante, canais semicirculares e órgãos vestibulares com fórceps cirúrgicos(Figura 2F).
  11. Para permitir que a mídia dextran e L15 entre no duto coclear, realize dois limites de punção na cócleae dissecada, uma na janela redonda e outra na região de coclearapical.
  12. Adicione 300 mL da mídia L15 de Leibovitz em cada poço de uma placa de depressão de vidro de 9 poços.
  13. Coloque pelo menos três cochleae dissecado em cada poço.

3. Rotulagem Dextran

  1. Reconstituir o dextran na solução de sal equilibrado de Hanks sem Ca2+ e Mg2+ (HBSS-CFM) em uma concentração final de 10 mg/mL. Esta solução de estoque deve ser citada em tubos pretos opacos (protegidos contra a luz) e armazenadas a -30 °C até o uso.
    NOTA: O uso de dextran fixável de lysine é fundamental para um resultado bem-sucedido deste protocolo.
  2. Prepare cada dextran a uma concentração final de 2 mg/mL em 500 mL da mídia L15 de Leibovitz.
  3. Remova a mídia da cóchlê e adicione a mídia L15 de Leibovitz contendo o dextran de interesse em uma concentração final de 2 mg/mL.
    NOTA: Embora uma proporção dos canais MET estejam abertas em repouso41,42, a incubação dextran foi realizada com um suave tremor das explants para aumentar a probabilidade aberta do canal MET.
  4. Incubar à temperatura ambiente por 2 h com agitação suave (25 rpm) usando um agitador tridimensional com um ângulo inclinado de 25°.
    NOTA: Dextran rotulado fluorescentemente deve ser protegido da luz quando possível. Para proteger o dextran durante a incubação de 2 h, coloque a placa de vidro de 9 poços dentro de um prato P150 de cultura celular envolto em papel alumínio.

4. Preparação de amostras para imagem

  1. Após a incubação com o dextran, lave o tecido por 2 minutos duas vezes com mídia e uma vez com HBSS.
  2. Incubar o tecido em temperatura ambiente por 30 min com 4% de paraformaldeído na solução de sal balanceada de Hanks (HBSS).
    ATENÇÃO: A exposição ao formaldeído pode ser irritante para os olhos, nariz e trato respiratório superior. Em certos indivíduos, a exposição repetida da pele ao formaldeído pode causar sensibilização que pode resultar em dermatite alérgica. Formaldeído é um conhecido cancerígeno humano e um suposto risco reprodutivo.
  3. Lave o tecido fixo duas vezes com HBSS para remover o paraformaldeído.
    NOTA: A decalcificação dos ossos temporais não é necessária nesta fase de desenvolvimento da cócla.
  4. Retire o ligamento espiral e a membrana tectorial com fórceps de ponta fina para dissecar o órgão de Corti (Figura 2G).
  5. Remova todos os pequenos pedaços de tecido e lave o tecido com HBSS.
  6. Permeabilizar o tecido em 0,5% Triton X-100 em PBS contendo phalloidin fluorescente (conjugado para verde ou vermelho ao testar a absorção de dextran rotulado por TR ou FITC, respectivamente) em uma diluição de 1:200 por 30 min para rotular F-actin e visualizar o estereocilia baseada em actin.
  7. Lave o tecido 2-3 vezes por 2 min cada vez com tampão HBSS para remover o excesso de tritão e faloide, e uma vez com PBS para remover os sais.
  8. Monte o órgão de tecidos Corti em um slide de microscópio e cubra-o com mídia de montagem.
    NOTA: Ao montar o tecido, certifique-se de que o lado do tecido contendo a estereoilia da célula do cabelo está voltado para o deslizamento de cobertura.
  9. Remova quaisquer bolhas potenciais geradas durante a adição da mídia de montagem e evite a geração de novas bolhas durante a colocação do deslizamento de cobertura.
    NOTA: Aspirar com uma pipeta qualquer bolha gerada durante a adição da mídia de montagem. Para evitar que bolhas de ar sejam presas o deslizamento de cobertura, coloque uma borda do deslizamento de cobertura perto da amostra e abaixe cuidadosamente e lentamente o deslizamento de cobertura sobre o tecido usando fórceps ou uma ponta de pipeta.
  10. Cubra o tecido na mídia de montagem com um deslizamento de cobertura de vidro (Figura 2H).
    NOTA: Os objetivos com abertura numérica acima de 0,4 são projetados para usar #1,5 deslizamentos de cobertura (espessura de 0,17 mm). O uso do contracheque errado pode ter sérias implicações para a intensidade e qualidade das imagens.
  11. Incubar o tecido montado durante a noite à temperatura ambiente para deixar a mídia de montagem secar e armazenar os slides a 4 °C até a imagem.

5. Aquisição de imagem e processamento de imagens

NOTA: As imagens confocais foram tiradas com um microscópio confocal LSM 880 equipado com um detector de 32 canais airyscan no modo super resolução (SR)43 e um objetivo de 63x.

  1. Adicione uma pequena gota de óleo de imersão no objetivo.
  2. Coloque o slide do microscópio contendo a amostra de tecido montada no estágio do microscópio com o deslizamento de vidro voltado para o óleo de imersão.
  3. Concentre-se na amostra e defina os parâmetros de imagem usando o software de aquisição de imagens.
  4. Use configurações idênticas de aquisição de imagem e parâmetros ideais para resolução x, y e z para cada experimento independente. Um sistema de foco orientado por piezo é necessário para mover o objetivo de forma rápida e precisa ao adquirir a pilha z de imagens.
    NOTA: Para visualizar toda a região apical das células cilias, colete uma pilha z de imagens da estereocilia até a metade apical do corpo da célula capilar usando as configurações ideais. É crucial coletar uma grande pilha z ao longo da célula ciliapara garantir a imagem das partículas semelhantes ao vesículo.
  5. Use o software de aquisição de imagens para processar as imagens cruas confocais usando o algoritmo de reconstrução 3D airyscan com as configurações automáticas do filtro de deconvolução padrão.
  6. Abra as imagens confocais em um software de processamento de imagens para ajustar o brilho e o contraste, adicionar a barra de escala e exportar as imagens para os números finais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Observamos rotulagem robusta e específica de células ciliadas após 2h de incubação de órgão séti de camundongos pós-parto-6 (P6) do tipo selvagem com 3 kDa dextran fluorescente rotulados com Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). A rotulagem Dextran foi observada em células capilares internas e externas (IHC e OHC) nas regiões basal, média e apical do órgão de Corti (Figura 2B).

A phalloidina rotulada ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve como realizar experimentos de captação em órgão surina de explants corti com 3 kDa dextran Texas Red. O objetivo deste método é testar se moléculas maiores do que outras testadas anteriormente também foram capazes de rotular especificamente células ciliadas auditivas e permear através do canal MET. Protocolos experimentais semelhantes foram usados anteriormente para avaliar a permeabilidade das células ciliadas para outros corantes fluorescentes, como FM1-43 (0,56 kDa)12

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Vincent Schram, do núcleo de microscopia e imagem nichd, por ajudar na aquisição de imagens confocais, e tsg-Hui Chang por ajuda inestimável com a gestão de colônias e cuidados com ratos. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, Bethesda, MD, para K.J.S. A.B. foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, e por uma Bolsa de Pós-Doutorado Robert Wenthold do programa de pesquisa intramural do NIDCD.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#1.5 lamínulas de vidro 18mmWarner Instruments64-0714
Alexa Fluor 488 FaloidinaThermoFisherA12379
Alexa Fluor 594 FaloidinaThermoFisherA12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Óleo Corr M27 objetivaCarl Zeiss420780-9970-000
Cloridrato de amiloridaEMD MILLIPORE
Benchwaver 3-dimensional RockerBenchmarks científicoB3D5000
C57BL / 6J linhagem de camundongos do tipo selvagem000664A célula do laboratório
impermeou o sal tetrapotássico BAPTAThermoFisherB1204
Dextran, Fluoresceína, 10.000 MW, aniônico, lisina fixávelThermoFisherD1820
Dextran, Texas Red, 10.000 MW, Lisina FixávelThermoFisherD1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lisina FixávelThermoFisherD3328
Solução Aquosa de Formaldeído Grau EMCiência da microscopia eletrônica15710
HBSS, cálcio, magnésio, sem vermelho de fenolThermoFisher14025
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenolThermoFisher14170
Image J ou FIJINIHhttp://fiji.sc/
Immersol 518F meio de imersão em óleoCarl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX SuplementoThermoFisher31415029
neomicina trisulfato de sal hidratadoSigmaN6386
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011069
Faloidina-CF405MBiotium00034
ProLong Diamond antifade mídia de montagemThermoFisherP36970
superfrost plus lâmina de microscópioFisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Zen Black 2.3 SP1 softwareCarl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
129876Jackson

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347(2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326(2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851(2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71(2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583(2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185(2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561(2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559(2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20(1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41(2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Capta o por C lulas CiliadasCanal de Mecanotransdu oDextrano Texas Redrg o de CortiMicroscopia ConfocalDextrano FluorescenteMarca o de Estereoc liosVia de Endocitose

Artigos relacionados