Artigo de método

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

DOI:

10.3791/60774

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5 de fevereiro de 2020

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1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Resumo

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Técnicas químicas e de bioconjugação foram desenvolvidas rapidamente nos últimos anos e permitem a construção de polímeros proteicos. No entanto, um processo controlado de polimerização proteica é sempre um desafio. Aqui, desenvolvemos uma metodologia enzimática para a construção de proteína polimerizada passo a passo em uma sequência racionalmente controlada. Neste método, o C-terminus de um monomer proteico é NGL para conjugação de proteínas usando o oaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) enquanto o N-terminus foi um site de decote tev (vírus etch de tabaco) cleavable mais um L (ENLYFQ/GL) para proteção temporária n-terminal. Consequentemente, o OaAEP1 foi capaz de adicionar apenas um monomer de proteína de cada vez, e então o TEV protease cedeu o N-terminus entre Q e G para expor o NH2-Gly-Leu. Em seguida, a unidade está pronta para a próxima ligadura OaAEP1. A poliproteína projetada é examinada por um uso do domínio proteico individual usando espectroscopia de força única baseada em microscopia atômica (AFM-SMFS). Portanto, este estudo fornece uma estratégia útil para a engenharia de poliproteínas e a imobilização.

Introdução

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Em comparação com polímeros sintéticos, proteínas naturais multidomínios têm uma estrutura uniforme com um número bem controlado e tipo de subdomínios1. Esse recurso geralmente leva a uma melhor função biológica e estabilidade2,3. Muitas abordagens, como acoplamento de ligação de dimisina à base de cisínea e tecnologia de DNA recombinante, foram desenvolvidas para a construção de uma proteína polimerizada com múltiplos domínios4,5,6,7. No entanto, o método ant....

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Protocolo

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1. Produção de proteínas

  1. Clone genético
    1. Compre genes codificando para a proteína de interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxina (RD)51, o módulo de ligação de celulose (CBM), o domínio dockerin-X (XDoc) e coesão de Ruminococcus flavefacience,protease do vírus da gravação de tabaco (TEV), polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs).
    2. Realize a reação da cadeia de polimerase e use o sistema de enzimas de digestão de três restrições BamHI-BglII-KpnI para recombinar o gene de diferentes fragmentos de proteína.
    3. Confirme todos os genes por sequenciamento de DN....

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Resultados

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Os resíduos ngl introduzidos entre proteínas adjacentes pela ligadura OaAEP1 não afetarão a estabilidade do monômero de proteína sonímero no polímero como a força desdobrada (u>), e o incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>) é comparável com o estudo anterior (Figura 1). O resultado purificatório da proteína rubredoxina é mostrado na Figura 2. Para provar a proteína após o decote TEV ser compatível com a seguinte ligadura OaAEP1 para .......

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Discussão

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Descrevemos um protocolo de biossíntese enzimática e imobilização da poliproteína e verificamos o projeto de poliproteína pela SMFS baseada em AFM. Essa metodologia fornece uma nova abordagem para a construção do polímero proteico em uma sequência projetada, que complementa métodos anteriores para engenharia de poliproteína e imobilização4,6,52,53,54,

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant no. 21771103, 21977047), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (Grant No. BK20160639) e Shuangchuang Program of Jiangsu.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cloreto de ferro (III) hexahidratadoEnergia química99%
Cloreto de zincoAlfa Aesar100.00%
cloreto de cálcio hidratoAlfa Aesar99.9965% agregado cristalino
L-Ácido AscórbicoSigma Life ScienceBio Xtra, ≥ 99,0%,
trietoxissilano cristalino (3-aminopropil)Sigma-Aldrich≥ 99%
sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilatoThermo Scientific90%
GlicerolMacklin99%
5,5'-dithiobis (ácido 2-nitrobenzóico)Alfa Aesar
GenesGenscript
Equipamento
Nanowizard 4 AFMJPK Alemanha
MLCT cantileverBruker Corp
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare
AKTA FPLC sistemaGE Healthcare
Glass coverslipSail Marca
Nanodrop 2000Thermo Scientific
Avanti JXN-30 CentrífugaSistema de Imagem em Gel Beckman Coulter
Tanon

Referências

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  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers.

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