Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.
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Artigo de método
Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única
Neste artigo
Resumo
Resumo
Técnicas químicas e de bioconjugação foram desenvolvidas rapidamente nos últimos anos e permitem a construção de polímeros proteicos. No entanto, um processo controlado de polimerização proteica é sempre um desafio. Aqui, desenvolvemos uma metodologia enzimática para a construção de proteína polimerizada passo a passo em uma sequência racionalmente controlada. Neste método, o C-terminus de um monomer proteico é NGL para conjugação de proteínas usando o oaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) enquanto o N-terminus foi um site de decote tev (vírus etch de tabaco) cleavable mais um L (ENLYFQ/GL) para proteção temporária n-terminal. Consequentemente, o OaAEP1 foi capaz de adicionar apenas um monomer de proteína de cada vez, e então o TEV protease cedeu o N-terminus entre Q e G para expor o NH2-Gly-Leu. Em seguida, a unidade está pronta para a próxima ligadura OaAEP1. A poliproteína projetada é examinada por um uso do domínio proteico individual usando espectroscopia de força única baseada em microscopia atômica (AFM-SMFS). Portanto, este estudo fornece uma estratégia útil para a engenharia de poliproteínas e a imobilização.
Introdução
Em comparação com polímeros sintéticos, proteínas naturais multidomínios têm uma estrutura uniforme com um número bem controlado e tipo de subdomínios1. Esse recurso geralmente leva a uma melhor função biológica e estabilidade2,3. Muitas abordagens, como acoplamento de ligação de dimisina à base de cisínea e tecnologia de DNA recombinante, foram desenvolvidas para a construção de uma proteína polimerizada com múltiplos domínios4,5,6,7. No entanto, o método ant....
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Protocolo
1. Produção de proteínas
-
Clone genético
- Compre genes codificando para a proteína de interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxina (RD)51, o módulo de ligação de celulose (CBM), o domínio dockerin-X (XDoc) e coesão de Ruminococcus flavefacience,protease do vírus da gravação de tabaco (TEV), polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs).
- Realize a reação da cadeia de polimerase e use o sistema de enzimas de digestão de três restrições BamHI-BglII-KpnI para recombinar o gene de diferentes fragmentos de proteína.
- Confirme todos os genes por sequenciamento de DN....
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Resultados
Os resíduos ngl introduzidos entre proteínas adjacentes pela ligadura OaAEP1 não afetarão a estabilidade do monômero de proteína sonímero no polímero como a força desdobrada (u>), e o incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>) é comparável com o estudo anterior (Figura 1). O resultado purificatório da proteína rubredoxina é mostrado na Figura 2. Para provar a proteína após o decote TEV ser compatível com a seguinte ligadura OaAEP1 para .......
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Discussão
Descrevemos um protocolo de biossíntese enzimática e imobilização da poliproteína e verificamos o projeto de poliproteína pela SMFS baseada em AFM. Essa metodologia fornece uma nova abordagem para a construção do polímero proteico em uma sequência projetada, que complementa métodos anteriores para engenharia de poliproteína e imobilização4,6,52,53,54,
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant no. 21771103, 21977047), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (Grant No. BK20160639) e Shuangchuang Program of Jiangsu.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| cloreto de ferro (III) hexahidratado | Energia química | 99% | |
| Cloreto de zinco | Alfa Aesar | 100.00% | |
| cloreto de cálcio hidrato | Alfa Aesar | 99.9965% agregado cristalino | |
| L-Ácido Ascórbico | Sigma Life Science | Bio Xtra, ≥ 99,0%, | |
| trietoxissilano cristalino (3-aminopropil) | Sigma-Aldrich | ≥ 99% | |
| sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato | Thermo Scientific | 90% | |
| Glicerol | Macklin | 99% | |
| 5,5'-dithiobis (ácido 2-nitrobenzóico) | Alfa Aesar | ||
| Genes | Genscript | ||
| Equipamento | |||
| Nanowizard 4 AFM | JPK Alemanha | ||
| MLCT cantilever | Bruker Corp | ||
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | ||
| AKTA FPLC sistema | GE Healthcare | ||
| Glass coverslip | Sail Marca | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Avanti JXN-30 Centrífuga | Sistema de Imagem em Gel Beckman Coulter | ||
| Tanon |
Referências
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers.
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Reimpressões e permissões
