Artigo de método

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

DOI:

10.3791/60774

5 de fevereiro de 2020

Neste artigo

Resumo

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Resumo

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Técnicas químicas e de bioconjugação foram desenvolvidas rapidamente nos últimos anos e permitem a construção de polímeros proteicos. No entanto, um processo controlado de polimerização proteica é sempre um desafio. Aqui, desenvolvemos uma metodologia enzimática para a construção de proteína polimerizada passo a passo em uma sequência racionalmente controlada. Neste método, o C-terminus de um monomer proteico é NGL para conjugação de proteínas usando o oaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) enquanto o N-terminus foi um site de decote tev (vírus etch de tabaco) cleavable mais um L (ENLYFQ/GL) para proteção temporária n-terminal. Consequentemente, o OaAEP1 foi capaz de adicionar apenas um monomer de proteína de cada vez, e então o TEV protease cedeu o N-terminus entre Q e G para expor o NH2-Gly-Leu. Em seguida, a unidade está pronta para a próxima ligadura OaAEP1. A poliproteína projetada é examinada por um uso do domínio proteico individual usando espectroscopia de força única baseada em microscopia atômica (AFM-SMFS). Portanto, este estudo fornece uma estratégia útil para a engenharia de poliproteínas e a imobilização.

Introdução

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em comparação com polímeros sintéticos, proteínas naturais multidomínios têm uma estrutura uniforme com um número bem controlado e tipo de subdomínios1. Esse recurso geralmente leva a uma melhor função biológica e estabilidade2,3. Muitas abordagens, como acoplamento de ligação de dimisina à base de cisínea e tecnologia de DNA recombinante, foram desenvolvidas para a construção de uma proteína polimerizada com múltiplos domínios4,5,6,7. No entanto, o método ant....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produção de proteínas

  1. Clone genético
    1. Compre genes codificando para a proteína de interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxina (RD)51, o módulo de ligação de celulose (CBM), o domínio dockerin-X (XDoc) e coesão de Ruminococcus flavefacience,protease do vírus da gravação de tabaco (TEV), polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs).
    2. Realize a reação da cadeia de polimerase e use o sistema de enzimas de digestão de três restrições BamHI-BglII-KpnI para recombinar o gene de diferentes fragmentos de proteína.
    3. Confirme todos os genes por sequenciamento de DN....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os resíduos ngl introduzidos entre proteínas adjacentes pela ligadura OaAEP1 não afetarão a estabilidade do monômero de proteína sonímero no polímero como a força desdobrada (u>), e o incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>) é comparável com o estudo anterior (Figura 1). O resultado purificatório da proteína rubredoxina é mostrado na Figura 2. Para provar a proteína após o decote TEV ser compatível com a seguinte ligadura OaAEP1 para .......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um protocolo de biossíntese enzimática e imobilização da poliproteína e verificamos o projeto de poliproteína pela SMFS baseada em AFM. Essa metodologia fornece uma nova abordagem para a construção do polímero proteico em uma sequência projetada, que complementa métodos anteriores para engenharia de poliproteína e imobilização4,6,52,53,54,

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant no. 21771103, 21977047), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (Grant No. BK20160639) e Shuangchuang Program of Jiangsu.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cloreto de ferro (III) hexahidratadoEnergia química99%
Cloreto de zincoAlfa Aesar100.00%
cloreto de cálcio hidratoAlfa Aesar99.9965% agregado cristalino
L-Ácido AscórbicoSigma Life ScienceBio Xtra, ≥ 99,0%,
trietoxissilano cristalino (3-aminopropil)Sigma-Aldrich≥ 99%
sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilatoThermo Scientific90%
GlicerolMacklin99%
5,5'-dithiobis (ácido 2-nitrobenzóico)Alfa Aesar
GenesGenscript
Equipamento
Nanowizard 4 AFMJPK Alemanha
MLCT cantileverBruker Corp
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare
AKTA FPLC sistemaGE Healthcare
Glass coverslipSail Marca
Nanodrop 2000Thermo Scientific
Avanti JXN-30 CentrífugaSistema de Imagem em Gel Beckman Coulter
Tanon

Referências

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

S ntese Enzim tica de OaAEP1Polimeriza o de Prote nasMicroscopia de For a At micaClivagem por Protease TEVFuncionaliza o com Sulfo SMCCPareamento Coesina DockerinaCalibra o de Tamp o de AFMEngenharia de Poliprote nasLiga o Enzim tica

Artigos relacionados