Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.
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Artigo de método
Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia intravital do intestino usando imagens confocal permite a observação em tempo real do derramamento de células epiteliais e vazamento de barreira em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal de camundongos anestesiados é topicamente manchada com coloração inespecífica (acriflavine) e um rastreador fluorescente (dextran rhodamine-B), montado em uma placa salina lavada e diretamente imageado usando um microscópio confocal. Esta técnica pode complementar outras técnicas não invasivas para identificar vazamento de permeabilidade intestinal, como a passagem transmucosal de rastreadores administrados oralmente. Além disso, a abordagem aqui apresentada permite a observação direta dos eventos de derramamento de células em tempo real. Em combinação com camundongos repórteres fluorescentes apropriados, esta abordagem é adequada para lançar luz em mecanismos celulares e moleculares que controlam a extrusão de células epiteliais intestinais, bem como para outros processos biológicos. Nas últimas décadas, estudos interessantes utilizando microscopia intravital contribuíram para o conhecimento sobre permeabilidade endotelial, homing intestinal de células imunes, comunicação imuno-epitelial e invasão de componentes luminosos, entre outros. Juntos, o protocolo aqui apresentado não só ajudaria a aumentar a compreensão dos mecanismos que controlam a extrusão de células epiteliais, mas também poderia ser a base para o desenvolvimento de outras abordagens a serem utilizadas como instrumentos para visualizar outros processos celulares altamente dinâmicos, mesmo em outros tecidos. Entre as limitações técnicas, as propriedades ópticas do tecido específico, bem como a configuração selecionada da tecnologia de imagem e microscópio, por sua vez, determinariam a distância de trabalho de imagem e a resolução de imagens adquiridas.
Introdução
O intestino é um órgão altamente especializado com uma função fortemente regulamentada que permite processos conflitantes, ou seja, nutrição e proteção contra substâncias luminais nocivas. Forro entre o corpo humano e o ambiente, o epitélio intestinal atua como uma barreira física e imunológica e contribui para a manutenção da homeostase mucosa no intestino1,,2. A perda de integridade epitelial e o aumento da permeabilidade da junção apertada é bem conhecido por estar associado à Doença Inflamatória Intestinal (DII)3,,4,,5<....
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Protocolo
O seguinte protocolo foi aprovado pelas autoridades locais relevantes em Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemanha). Os camundongos foram alojados em condições específicas sem patógenos.
NOTA: A inibição da prenilação mediada por GGTase dentro dos IECs causa uma alteração severa da permeabilidade intestinal em camundongos Pggt1biΔIEC 24. Portanto, este modelo de mouse foi usado para demonstrar como o protocolo pode ser útil para estudar defeitos de barreira intestinal. No entanto, este protocolo poderia ser usado para o estudo de qualquer outra linha de mouse.
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Resultados
O protocolo aqui apresentado descreve uma abordagem baseada em microscopia intravital para visualizar o vazamento epitelial intestinal e observar o desempenho de derramamento de células no intestino em tempo real. Resumidamente, os camundongos são anestesiados e submetidos à preparação cirúrgica a fim de expor a superfície da mucosa do intestino delgado. Os IECs são então manchados através da aplicação tópica de acriflavina; enquanto a rhodamina luminal B-dextran é usada como rastreadores.......
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Discussão
Embora tecnicamente desafiadora, a metodologia baseada em microscopia intravital representa uma abordagem experimental única para visualizar o processo celular altamente dinâmico em tempo real, como o desempenho de derramamento de células. Até agora, não há uma abordagem experimental alternativa para visualizar a extrusão celular in vivo. Acreditamos que este protocolo pode contribuir para a descrição de diversos processos celulares desempenhando um papel na manutenção da homeostase intestinal.
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Agradecimentos
A pesquisa que levou a esses resultados recebeu financiamento do Programa Pessoas (Ações Marie Curie) sob o acordo de subvenção DA REA nº 302170 do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013); o Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) da Universidade Erlangen-Nuremberg; o Centro de Pesquisa Colaborativa TRR241 e o Grupo de Pesquisa Clínica KFO257 do Conselho Alemão de Pesquisa (DFG); e o DFG.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloridrato de acriflavina | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg / mL solução em |
| almofada isotérmica PBS Deltaphase | BrainTree | B-DP-PAD-Gemini | |
| Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917-Ketamin | |
| WDT | 9089.01.00 | ||
| LAS X | Leica | - | |
| microscópio LSM SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rodamina B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; solução de 2 mg/mL |
| Fórceps padrão (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23-Tesoura | |
| fina reta | Fine Science Tools | 14060-10-Tamoxifeno | |
| Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in etanol | |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
Referências
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T.
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Reimpressões e permissões
