Correção de alta precisão de mudanças cromáticas 3D na Era da Super-Resolução Imagem Biológica Usando Chromagnon

Resumo

A correção de mudanças cromáticas em imagens de microscopia de fluorescência multicolorida (3D) é crucial para análises quantitativas de dados. Este protocolo é desenvolvido para medir e corrigir mudanças cromáticas em amostras biológicas através da aquisição de imagens de referência adequadas e processamento com o software de código aberto, Chromagnon.

Resumo

A microscopia de fluorescência multicolorida quantitativa baseia-se na cuidadosa correspondência espacial dos canais de cores adquiridos em diferentes comprimentos de onda. Devido à aberração cromática e ao alinhamento imperfeito das câmeras, as imagens adquiridas em cada canal podem ser deslocadas e ampliadas, bem como rotacionadas em relação umas às outras em qualquer uma das três dimensões. Com o método de calibração clássica, as mudanças cromáticas são medidas por contas multicoloridas anexadas à superfície de um deslizamento de cobertura, e um número de softwares estão disponíveis para medir as mudanças cromáticas de tais amostras de calibração. No entanto, a aberração cromática pode variar de profundidade, alterar com condições de observação e ser induzida pela própria amostra biológica, dificultando assim a determinação da verdadeira quantidade de mudança cromática na amostra de interesse e em todo o volume. Corrigir mudanças cromáticas com maior precisão é particularmente relevante para microscopia de super-resolução, onde apenas pequenas mudanças cromáticas podem afetar análises quantitativas e alterar a interpretação de imagens multicoloridas. Desenvolvemos um software de código aberto Chromagnon e métodos de acompanhamento para medir e corrigir mudanças cromáticas 3D em amostras biológicas. Aqui fornecemos um protocolo de aplicação detalhado que inclui requisitos especiais para preparação de amostras, aquisição de dados e processamento de software para medir mudanças cromáticas em amostras biológicas de interesse.

Introdução

A imagem multicolorida é um dos aspectos fundamentais da microscopia de fluorescência biológica, nos casos em que a relação espacial de diferentes moléculas ou estruturas é de grande interesse. Aberração cromática, uma aberração óptica de luz policromática causada pela dispersão, muda a posição aparente dos objetos coloridos de interesse. Da mesma forma, microscópios equipados com múltiplas câmeras dedicadas à aquisição de cada cor têm mudanças cromáticas mais complexas devido a diferenças de elementos ópticos e alinhamento imperfeito entre os canais. Assim, tais mudanças cromáticas podem levar a uma falsa conclusão, a menos que explicitamente corrigida pelo usuário. Embora as mudanças cromáticas não tenham sido um grande problema, desde que a resolução da microscopia seja limitada pelo limite de resolução clássica, o desenvolvimento recente da microscopia de super resolução¹ levou à necessidade de uma correção mais precisa das mudanças cromáticas.

Tem sido uma prática comum medir mudanças cromáticas de sistemas de microscópio usando um slide de calibração de contas multicolorida². O método de calibração baseado em contas é apropriado para medir mudanças cromáticas de toda a óptica do microscópio em direção à superfície do deslizamento^{de tampas 2}. Este método, no entanto, é incapaz de medir mudanças cromáticas nas amostras biológicas de interesse. É importante notar que muitas amostras biológicas são tridimensionais (3D), e as mudanças cromáticas dessas amostras são diferentes daquelas na superfície do deslizamento de tampas. Além disso, as mudanças cromáticas mudam com as condições de imagem^2,3. Medimos as mudanças cromáticas em amostras biológicas 3D e descobrimos que a incerteza das mudanças cromáticas era de até 350 nm pelo método clássico de calibração multicolorido³. Portanto, as mudanças cromáticas precisam ser medidas em amostras biológicas na profundidade do interesse e sob as condições de imagem que estão sendo utilizadas.

Aqui, descrevemos procedimentos para medir mudanças cromáticas em amostras biológicas e corrigir essas mudanças usando nosso software, Chromagnon³. Para medir mudanças cromáticas em amostras biológicas, nosso método utiliza dois tipos de conjuntos de dados, uma imagem "alvo" e uma imagem de "referência". A imagem "alvo" é uma imagem multicolorida de interesse, por exemplo, imagens manchadas de DNA, envelope nuclear e microtúbulos. Muitas vezes é impossível medir mudanças cromáticas em tal imagem. Portanto, precisamos de uma imagem de "referência" dedicada a medir as mudanças cromáticas na amostra. A única definição de uma imagem de "referência" é uma imagem multicolorida do mesmo objeto. Nesse sentido, uma imagem multicolorida também é um tipo de imagem de referência. Aqui, descrevemos três tipos diferentes de imagem de referência que são usadas para medir mudanças cromáticas nas amostras biológicas: "imagens de referência de crosstalk", "imagens de referência de campo brilhante" e "imagens de referência de calibração biológica". O tipo de imagem de referência depende do tipo de microscópio que está sendo utilizado ou da precisão de correção exigida conforme resumido na Tabela 1.

	Crosstalk	Campo brilhante	Calibração biológica (em um slide diferente)	Calibração biológica (no mesmo slide)
Precisãoum	+++	+	++b	+++
Simplicidade	++	+++	++	++
Microscopia aplicável	Campo largo	Campo largo	Todos	Todos
Disponibilidade de alinhamento local	+	+	-c	-c
a: Número de "+" indica aumento da classificação. O single plus é de cerca de 50 nm e três mais é cerca de 15 nm em 3D. b: A precisão depende do quanto as condições de imagem variáveis são mantidas constantes. c: A calibração local medida por amostras de contas multicoloridas pode ser combinada conforme descrito na seção de protocolo 4.

Tabela 1: Parâmetros ao escolher o tipo de imagens de referência.

As "imagens de referência crosstalk" têm a maior precisão de correção e são relativamente simples de realizar^3,4 (Tabela 1). A desvantagem é sua limitação nas aplicações de microscopia devido à sua incapacidade de medir mudanças cromáticas em caminhos de excitação. Além disso, para obter tais imagens, o microscópio deve ser equipado com espelhosdicróicos multiband, e filtros de emissão que são controlados independentemente a partir dos filtros de excitação ou fontes de luz. A microscopia adequada inclui microscopia convencional de campo largo, microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM) como microscopia de localização/microscopia óptica estocástica (PALM/STORM)^5,,6 e microscopia de expansão⁷ observada com microscopia de campo largo. Uma imagem de referência crosstalk é adquirida a partir da própria amostra de destino. É uma imagem de fluorescência de crosstalk (sangria)de um corante obtido em todos os canais necessários. A emissão de fluorescência sempre se expande para os comprimentos de onda mais longos, portanto, corantes com o comprimento de onda de emissão mais curto estão animados para obter fluorescência de crosstalk em canais de comprimentos de onda mais longos. Por exemplo, quando a amostra é manchada com azul, verde e vermelho, apenas o corante azul é animado, e a luz de emissão é obtida nos canais azul, verde e vermelho. Neste protocolo, o DNA manchado com 4′,6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) foi usado para obter fluorescência de crosstalk.

"Imagens de referência de campo brilhante" são uma alternativa mais fácil e menos fototóxica para "imagens de referência de crosstalk", mas são as menos precisas³ (Tabela 1). Estas são imagens de campo brilhante da amostra de destino, adquiridas em todos os canais de cores usados na imagem alvo.

As "imagens de referência de calibração biológica" têm a vantagem de serem aplicáveis a qualquer tipo de microscopia devido à sua capacidade de medir as mudanças cromáticas tanto nos caminhos de excitação quanto de emissão^3,,8 (Tabela 1). A microscopia adequada inclui microscopia de campo largo, microscopia confocal, microscopia de folha de luz, esgotamento estimulado de emissões (STED)^9,microscopia de iluminação estruturada (SIM)^10,Airyscan/SORA^11,,12, SMLM observada com o modo total de fluorescência de reflexão interna (TIRF), Super resolução Olympus (OSR)¹³, e assim por diante. Uma imagem de referência de calibração biológica é adquirida a partir de uma amostra de calibração igualmente preparada como a amostra alvo, mas com a coloração de uma única estrutura com múltiplas cores. A precisão de correção supera a resolução da maioria das microscopias de super-resolução e preparar uma amostra de calibração biológica pode ser relativamente simples. Outra vantagem é a disponibilidade para "média" de múltiplas imagens de referência. Portanto, embora as imagens individuais contenham informações ruins para a medição de turnos cromáticos, o conteúdo da informação pode ser aumentado com a média de múltiplas imagens. A precisão depende do quanto as condições de imagem são mantidas constantes. Nesse sentido, o melhor desempenho é obtido quando ambas as amostras de destino e referência estão no mesmo slide, utilizando, por exemplo, óculos de cobertura de câmara de 8 poços(Tabela 1, à direita-mais). Neste protocolo, a actina manchada com três cores de faloideina foi usada como calibração biológica.

Uma vez que uma imagem de referência é obtida, então a mudança cromática é medida e corrigida pelo nosso software Chromagnon. Não há limitação no número de canais, seções Z e prazos que o Chromagnon pode medir e corrigir as mudanças cromáticas para. Chromagnon mede mudanças cromáticas em duas etapas. O primeiro passo adquire os parâmetros de alinhamento "global" ou "afim" de tradução nos eixos X, Y, Z, ampliação ao longo dos eixos X, Y, Z e rotação ao redor do eixo Z. A precisão de cálculo do alinhamento global é de ~16 nm em 3D e ~8 nm em 2D. O segundo passo é um "alinhamento local" iterativo 2D opcional nas imagens projetadas para obter uma maior precisão. No processo de alinhamento local, as imagens são subdivididas em várias regiões e mudanças cromáticas nessas regiões locais são medidas. Posteriormente, as regiões são ainda mais divididas e as mudanças cromáticas nas sub-regiões são medidas iterativamente até que o número de pixels na região atinja o número mínimo de pixels (geralmente 60 x 60 pixels). O mapa de alinhamento local resultante é combinado com o parâmetro de alinhamento global e é aplicado à imagem alvo por uma transformação elástica. Após esta etapa, a precisão de cálculo é melhorada para ~14 nm em 3D e ~6 nm em 2D. O alinhamento local não é adequado para imagens de referência de calibração biológica porque a estrutura biológica na referência é diferente da do alvo (Tabela 1). Portanto, apenas o alinhamento global é utilizado para imagens de referência de calibração biológica.

As mudanças cromáticas locais são originárias de duas fontes; microscópio instrumental distorção local e inhomogeneidade estrutural biológica. Como a distorção local instrumental do microscópio é constante, isso pode ser medido a partir da amostra de referência multicolorida e corrigido como um parâmetro fixo. Chromagnon pode combinar o mapa de distorção local instrumental do microscópio e os parâmetros de alinhamento global das calibrações biológicas(Tabela 1). Usando este método, espera-se que a precisão média da calibração biológica seja melhorada em um adicional de 1-2 nm.

Aqui, descrevemos um protocolo para corrigir as mudanças cromáticas de imagens de fluorescência 3D usando nosso software Chromagnon, da extremidade baixa mais fácil à mais alta precisão. Usamos a imunostaining de células HeLa como exemplo e as observamos usando microscopia de campo largo 3D e 3D-SIM. Na primeira seção, descrevemos como preparar amostras de destino e amostras de calibração biológica. Essa parte do protocolo deve ser otimizada para os alvos específicos da pesquisa. Na segunda seção, descrevemos os métodos de aquisição para três tipos de imagens de referência por microscópios. A suposição era obter canais azuis, verdes e vermelhos, mas a composição do canal deve ser modificada pelos alvos específicos da pesquisa e pelas configurações do microscópio. Não importa se o microscópio está equipado com uma única câmera ou múltiplas câmeras. Na terceira seção, descrevemos como podemos usar nosso software para medir e corrigir mudanças cromáticas da imagem alvo usando imagens de referência. Finalmente, na quarta seção, descrevemos um método para complementar as imagens de referência de calibração biológica usando a calibração local instrumental de um microscópio.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Preparação de uma amostra alvo
   1. Semente 2,5 x 10⁵ células HeLa em um prato de fundo de vidro de 35 mm e plantá-las em 2 mL de meio de crescimento (meio de águia modificada de Dulbecco com L-glutamina e pirudo de sódio suplementado com 10% de soro bovino fetal [FBS]) a 37 °C e uma concentração de CO₂ de 5%. Alternativamente, as células HeLa semente 6 x^{10 4} em uma tampa de 8 poços e plantá-las em 0,5 mL de meio de crescimento a 37 °C e uma concentração de CO₂ de 5%. Use #1,5 óculos de cobertura (com espessura de 0,170 mm) para microscopia de alta resolução.
      NOTA: Utilize 1/4 volumes para o copo de cobertura de 8 poços para outras etapas, exceto as etapas 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 e 1.2.5 onde o volume é de 100 μl, independentemente do tipo de recipiente.
   2. Após cerca de 24 horas de incubação, substitua a solução por 2 mL de formaldeído de 3,7% em salina tamponada com fosfato (PBS). Após uma mistura suave, continue a fixar células por 15 minutos à temperatura ambiente (RT) em uma plataforma de rotação.
      ATENÇÃO: Trabalhe em um capô de fumaça.
   3. Lave as células com 2 mL de PBS, 3x cada por 5-10 min em uma plataforma de rotação.
      NOTA: Siga as normas locais para descartar resíduos de formaldeído.
   4. Células permeabilize com 2 mL de 0,1% Triton X-100 em PBS por 5 min em uma plataforma de rotação, seguidas por três lavagens com 2 mL de PBS, cada uma por 5-10 min em uma plataforma de rotação.
   5. Incubar células em 100 μL de 1% de albumina de soro bovino (BSA) na PBS por 1 h no RT em uma plataforma de rotação.
   6. Substitua a solução por 100 μL de uma mistura de anticorpos primários (anticorpo policlonal anti-emerin¹⁴ e anticorpo monoclonal anti-tubulina¹⁵) em 1% de BSA em PBS em diluições apropriadas (1/500 para anti-emerína e 1/100 para anti-tubulina), e incubar durante a noite a 4 °C.
   7. Lave as células com 2 mL de PBS, 3-5x cada por 10 minutos em uma plataforma de rotação.
   8. Substitua a solução por 100 μL de uma mistura de anticorpos secundários (anti-coelho IgG com Alexa Fluor 488 e anti-mouse IgG por Alexa Fluor 555) em 1% BSA em PBS a 1/500 diluição, e incubar por 3-4 h na RT.
   9. Lave as células com 2 mL de PBS, 3-4x cada por 5 min em uma plataforma de rotação.
   10. Substitua a solução por 2 mL de 0,5 μg/mL DAPI em PBS para colorição de DNA por 30 minutos em RT em uma plataforma de rotação.
       NOTA: Em vez de DAPI, hoechst 33342 na mesma concentração também pode ser usado.
   11. Substitua a solução por ~100 μL de meio de montagem(Tabela de Materiais).
2. Preparação de uma amostra de calibração biológica
   1. Prepare células fixas conforme descrito nas etapas 1.1.1-1.1.4.
      NOTA: De preferência, as amostras são preparadas em um copo de cobertura com câmara para colocar as amostras de destino e referência em câmaras separadas na mesma tampa(Tabela 1, à direita- mais direita). Esta preparação é preferível quando o experimento requer a maior precisão de correção. Quando a amostra precisar ser preparada em uma mancha de cobertura regular, use tampas de precisão com baixa variação de espessura ("Nº 1,5H") para assegurar a reprodutibilidade.
   2. Prepare a solução de estoque de faloideina conjugada por corante fluorescente em 1,5 mL de metanol e armazene a -20 °C. Mix de phalloidin solução de estoque em PBS na seguinte diluição: 1/100 para fhalloidina com Alexa Fluor 405, 1/1.000 para faloideína com Alexa Fluor 488, e 1/200 para fhalloidin com Alexa Fluor 594.
   3. Substitua a solução por 1 mL da mistura de faloides preparada na etapa 1.2.2 e incubar por 30 min na RT em uma plataforma de rotação.
   4. Lave as células com 2 mL de PBS, 3-5x cada por 10 minutos em uma plataforma de rotação.
   5. Substitua a solução por ~100 μL de meio de montagem.
      NOTA: As amostras de calibração podem ser armazenadas a 4 °C ou -20 °C para uso repetido.

2. Aquisição de imagens de referência

1. Imagens de referência crosstalk
   1. Coloque a amostra de destino preparada na etapa 1.1 em um microscópio de campo largo.
   2. Adquira uma imagem de fluorescência do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos.
      NOTA: Para imagens 3D, o tamanho da etapa Z na imagem de referência pode ser diferente do da imagem de destino, desde que o arquivo de imagem contenha informações para o tamanho da etapa. O tamanho da etapa Z para referência e imagens de destino é preferencialmente menos da metade da resolução óptica do eixo Z, que é calculada por uma microscopia limitada por difração, onde λ é o comprimento de onda em nanômetros e NA é a abertura numérica da lente objetiva. Por exemplo, se a resolução axial for de 550 nm, use uma etapa Z menor que 275 nm. Nenhuma série temporal é necessária para a imagem de referência.
   3. Posteriormente, para adquirir uma imagem de fluorescência da referência, selecione a luz de excitação apenas para DAPI e opte por adquirir em canais azul, verde e vermelho. Adquira a imagem de referência exatamente na mesma posição de estágio e altura Z, no caso de uma pilha 3D.
      NOTA: Para comprimentos de onda de emissão mais longos, será necessário maior intensidade de iluminação e tempo de exposição.
2. Imagens de referência de campo brilhante
   1. Coloque a amostra de destino preparada na etapa 1.1 em um microscópio de campo largo.
   2. Adquira uma imagem de fluorescência do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos.
      NOTA: O tamanho da etapa Z atende preferencialmente ao critério nyquist, conforme descrito na etapa 2.1.2.
   3. Adquira uma imagem de campo brilhante do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos exatamente na mesma posição de estágio que em 2.2.2 e na mesma altura Z no caso de uma pilha 3D.
3. Imagens de referência de calibração biológica
   1. Coloque a amostra de destino preparada na etapa 1.1 em um microscópio 3D-SIM.
   2. Adquira uma imagem de fluorescência do alvo nos canais azul, verde e vermelho pelo 3D-SIM. Reconstrua a imagem super resolvida.
      NOTA: O tipo de microscópio pode ser de qualquer tipo, como 3D-SIM, confocal, STED, etc. O tamanho da etapa Z atende preferencialmente ao critério nyquist, conforme descrito na etapa 2.1.2.
   3. Adquira múltiplas imagens de fluorescência da referência preparadas na etapa 1.2 em diferentes posições de estágio semelhantes à imagem alvo (etapa 2.3.2) por 3D-SIM. Reconstrua as imagens super resolvidas.
      NOTA: O número total de pixels em XY deve ser o mesmo em todas as imagens de referência. O tamanho do passo em Z deve ser o mesmo em todas as imagens de referência. O número total de seções Z é preferido para ser o mesmo que na imagem alvo, mas este não é um requisito absoluto. A posição XY no palco para essas imagens de referência não importa porque a posição ou deslizamento de cobertura já é diferente da posição da amostra de destino e, além disso, a diferença no turno cromático em um único deslizamento de cobertura é inferior a 15 nm³. Condições de imagem, incluindo lente objetiva, temperatura de observação, óleo de imersão, tamanho do orifício na microscopia confocal e ângulo de inclinação em microscopia de iluminação altamente inclinada^16,devem corresponder à referência para o melhor desempenho. Se o microscópio equipar várias câmeras para adquirir vários canais simultaneamente, as imagens de referência devem ser adquiridas tão frequentemente quanto semanalmente para corrigir a deriva instrumental.

3. Correção de mudança cromática usando software Chromagnon

1. Usando um navegador web, vá para https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases, e baixe a mais nova versão binária de Chromagnon.
   NOTA: As versões binárias estão disponíveis para windows, Mac e algumas versões linux.
2. Extrair o programa e colocar o arquivo executável em um local conveniente. Em um Windows ou Mac clique duas vezes no arquivo para abri-lo, ou então executar o arquivo binário da linha de comando em um sistema Linux.
   NOTA: A interface gráfica do usuário como na Figura 1 será aberta. O programa pode ser impedido de abrir clicando duas vezes pela primeira vez por uma razão de segurança. Neste caso, use o método dependente da plataforma para abrir o programa baixado da internet.

Figura 1: Uma captura de tela da interface gráfica chromagnon do usuário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Arraste e solte os arquivos de referência na "caixa de referência"(Figura 1) ou clique em arquivos de referência (Figura 1A) para abrir uma caixa de diálogo seletor de arquivos. Dependendo dos formatos de arquivo, se o programa pedir para instalar um Java Development Kit (JDK), pressione sim e o usuário será navegado para a página de download. Baixe e instale o JDK para o sistema operacional conforme instruído. Chromagnon deve ser capaz de ler o formato do arquivo de imagem depois de reiniciar o programa.
   NOTA: Chromagnon pode ler a maioria dos formatos de arquivo de imagem (multipage 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', etc.). O formato de imagem original do microscópio é preferido nesta etapa porque os metadados podem ser perdidos quando um formato de imagem é convertido em um arquivo de tif de várias páginas. Se o nome do canal é mostrado como 0, 1, 2, etc. em vez de comprimentos de onda como 528, 609(Figura 2A, caixas verdes), então Chromagnon não sabe a identidade dos canais na imagem. Neste caso, certifique-se de que a ordem dos canais e o tamanho do pixel no arquivo de referência correspondam aos do arquivo de destino. Por exemplo, se a ordem dos canais na referência é verde e vermelha, então a ordem dos canais no alvo também deve ser verde e vermelho, mas não vermelho e verde.

Figura 2: Exemplo de captura de tela para carregar vários arquivos. (A) Um caso em que todas as imagens de referência possuem as imagens de destino correspondentes. Os nomes dos canais são corretamente identificados por comprimentos de onda (indicados por uma caixa verde) nos arquivos de imagem usados neste exemplo. (B) Um caso em que uma única imagem de referência é usada para corrigir múltiplas imagens de destino. (C) Um caso em que várias imagens de referência (indicadas por uma caixa vermelha) são mediadas, e a imagem de referência resultante após a média é usada para corrigir múltiplas imagens de destino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Arraste e solte os arquivos de destino na "Caixa alvo"(Figura 1) ou clique em arquivos target (Figura 1B) para abrir uma caixa de diálogo seletor de arquivos.
   NOTA: Se houver várias imagens-alvo e cada uma delas tiver imagens de referência correspondentes, a imagem de referência correspondente e a imagem de destino devem estar na mesma linha nas respectivas caixas de referência e destino(Figura 2A). Uma única imagem de referência também pode ser usada para alinhar múltiplas imagens-alvo(Figura 2B).
5. Verifique a caixa de seleção de margens de colheita se não for verificada(Figura 1C).
   NOTA: Se esta caixa de seleção for verificada, as margens resultantes do alinhamento ão cortadas. Verifique esta opção para uso geral, mas desconfirmar se uma comparação em nível de pixel é necessária entre imagens antes e depois do alinhamento.
6. Escolha um formato de imagem de saída na lista de escolha(Figura 1D).
   NOTA: Os formatos disponíveis são 'tif' (formato ImageJ^17), 'dv' e 'ome.tif'; o formato 'ome.tif' só está disponível após a instalação do JDK.
7. Especifique o sufixo para o nome do arquivo de saída (Figura 1E, o valor padrão é '_ALN'), que é adicionado ao nome do arquivo de destino.
8. Para imagens de referência crosstalk com alta relação sinal-ruído, use o alinhamento local da lista de escolha do Local align (Figura 1F),escolha projeção para usar o alinhamento local e Nenhum para desabilitá-lo. Use um tamanho mínimo de janela de 60(Figura 1G).
   NOTA: Ao usar o alinhamento local, todas as imagens-alvo devem ter imagens de referência correspondentes(Figura 2A). O alinhamento local não é recomendado para imagens de referência de calibração biológica, pois as mudanças cromáticas locais variam de uma amostra para outra(Tabela 1). Pela mesma razão, o alinhamento local único não pode ser aplicado a muitas imagens-alvo(Figura 2B). Como exceção, pode ser usado quando a amostra de interesse está apenas na superfície do deslizamento de cobertura, e o campo de visão é preenchido com objetos brilhantes, assim como as amostras de contas fluorescentes multicoloridas.
9. Para várias imagens de referência de calibração biológica, verifique a opção de referência média(Figura 1H) para medir um único parâmetro de alinhamento da imagem média, e o parâmetro de alinhamento único é então aplicado a todas as imagens-alvo(Figura 2C). Escolha Nenhum para alinhar local (Figura 1F).
10. Clique em Executar tudo (Figura 1I) para iniciar as medições; os parâmetros de alinhamento são aplicados às imagens de destino.
    NOTA: Depois de medir mudanças cromáticas dos arquivos de referência, o programa faz arquivos com extensão "chromagnon.csv" ou "chromagnon.tif". O tipo de arquivo de saída depende se o alinhamento local está em vigor(Figura 1F). Se o alinhamento for feito sem alinhamento local, a saída é "chromagnon.csv", enquanto se o alinhamento local estiver sendo usado, a saída é "chromagnon.tif". Os nomes dos arquivos são os mesmos do arquivo de referência, exceto pelo sufixo especificado(Figura 1J, o padrão é sem sufixo) e a extensão ("chromagnon.csv" ou "chromagnon.tif"). Uma descrição detalhada do processo de alinhamento pode ser encontrada no arquivo "Chromagnon.log" criado na mesma pasta.
11. Aguarde até que a imagem corrigida apareça no visualizador(Figura 3).
    NOTA: Arrastar a imagem com o mouse move a imagem e mover a roda do mouse altera o zoom. Mova o controle deslizante(Figura 3A) para alterar a seção Z (e/ou T quando aplicável) para exibição. Se o visualizador estiver muito lento para atualizar uma imagem, clique no botão Carregar dados inteiros no botão de memória(Figura 3B) para impedi-lo de acessar os dados no disco rígido. Arrastar a borda esquerda ou direita das caixas de cor(Figura 3C) pode controlar os valores mínimos ou máximos para exibição. Clicar no botão para cada canal(Figura 3D) alterna entre mostrar ou ocultar o canal selecionado no visualizador. O clique com o botão direito do mouse na caixa de cores (Figura 3D)permite que os usuários escolham as cores para exibição ou alterem as opções de exibição da barra de cores, e também permite que os usuários especifiquem os valores mínimos e máximos exatos para dimensionamento do display, escolhendo "escala para ...". Clicar no botão de exibição Ortogonal (Figura 3E) mostra as imagens das visualizações ZY e XZ. Mover as linhas cruzadas muda a posição para mostrar nas vistas laterais.

Figura 3: Uma captura de tela do visualizador de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

12. Para verificar se a medição foi realizada corretamente, arraste e solte as imagens de referência na "caixa de referência" e "Caixa alvo". Execute o programa e verifique se as imagens estão perfeitamente sobrepostas.
    NOTA: Quando disponíveis, os arquivos "chromagnon.csv" ou "chromagnon.tif" podem ser usados como referências para pular as medidas. Se a mudança cromática na imagem permanecer não corrigida, tente soluções resumidas na Tabela 2.
13. Para acessar os parâmetros de alinhamento na amostra ou quando os parâmetros de alinhamento precisam ser editados manualmente, abra arquivos "chromagnon.csv" diretamente com qualquer editor de texto ou software de planilha. Quando for editado, guarde-o como "csv".
    NOTA: Os valores estão em pixels para "tz", "ty", "tx", e em graus para "r", e em fatores de ampliação para "mz", "meu" e "mx".
    1. Alternativamente, carregue um arquivo "chromagnon.csv" ou "chromagnon.tif" na caixa referência ou alvo de Chromagnon(Figura 1), emseguida, clique duas vezes nele para abrir o editor de alinhamento(Figura 4).
    2. Para ver o quanto um canal é deslocado quando os parâmetros são editados, arraste e solte o arquivo de imagem de referência na área inferior(Figura 4A) para abrir a imagem no editor. Ao editar os valores na tabela (Figura 4B) e bater na tecla enter/return, observe como a imagem do canal correspondente se move à medida que os valores alterados. Após a edição, clique em salvar como... (Figura 4C) para salvar as alterações.

Figura 4: Uma captura de tela de um editor de parâmetros de alinhamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

14. Para verificar o mapa de alinhamento local, carregue o "chromagnon.tif" através da caixa referência ou alvo de Chromagnon(Figura 1),e clique duas vezes nele para abrir o editor de alinhamento(Figura 4). Clique na exibição (Figura 4D) para visualizar a mudança local indicada por linhas cujos comprimentos são ampliados pelo fator especificado na lista de escolha de ampliação (Figura 4E).
    NOTA: Ao especificar o "arquivo de imagem original"(Figura 4F),as mudanças são mapeadas juntamente com a imagem original.

4. Gerando um mapa de alinhamento local específico do microscópio

1. Diluir 2 μL de contas fluorescentes multicoloridas de 200 nm de diâmetro em 18 μL de etanol.
2. Vortex a solução e coloque 10 μL da solução de contas no centro de um prato de fundo de vidro. Certifique-se de usar #1,5 de vidro (com espessura de 0,170 mm) para microscopia de alta resolução.
3. Deixe o prato no RT por 1h para secar completamente.
4. Coloque o prato em um microscópio para ser calibrado e foque nas contas fluorescentes.
5. Obtenha imagens 2D ou 3D com a microscopia a ser calibrada. Obtenha várias imagens alterando a posição do palco.
6. Abra a interface gráfica do usuário Chromagnon.
7. Arraste e solte os arquivos de imagem de contas na "Caixa de referência"(Figura 1) ou clique em arquivos de referência (Figura 1A) para abrir uma caixa de diálogo seletor de arquivos.
8. Verifique a opção média de referências (Figura 1H). Da lista de escolha do Local align (Figura 1F),escolha Projeção. Use um tamanho mínimo de janela de 60(Figura 1G). Clique em Executar tudo (Figura 1I) para iniciar as medições.
   NOTA: É criado um arquivo ".chromagnon.tif", no qual o mapa de alinhamento local do microscópio é armazenado.
9. Após a medição, clique nos parâmetros Extra (Figura 1K). A partir da distorção local da caixa de instrumentos do microscópio, clique na lista de opções e escolha Novo... para abrir um diálogo. Arraste e solte o arquivo "chromagnon.tif" gerado na etapa 4.8 na caixa de nome do arquivo ou clique em escolher o botão de arquivo para abrir uma caixa de diálogo seletor de arquivos. Digite o nome do microscópio e clique em OK.
10. Ao medir mudanças cromáticas de imagens de referência de crosstalk ou calibração biológica, clique em parâmetros Extras (Figura 1K). A partir da distorção local da caixa de instrumentos do microscópio, escolha o nome do microscópio especificado na etapa 4.9. Clique em OK.
    NOTA: A escolha da "distorção local do seu instrumento de microscópio" não é salva após o desligamento do programa.
11. Proceda à correção cromática sem alinhamento local como na seção 3.
    NOTA: Também é possível usar o alinhamento local, além da calibração do microscópio. Neste caso, o alinhamento local começa com a calibração do microscópio.

Resultados

Um exemplo de correção de mudança cromática usando uma imagem de referência crosstalk é mostrado na Figura 5. A imagem foi obtida com um microscópio de campo largo equipado com uma única câmera. A emissão de fluorescência do DAPI foi utilizada como referência (Figura 5A,B) para corrigir os canais azul, verde e vermelho. A imagem é composta por 3 canais de fatias de 60 Z, cada uma composta de 256 x 256 pixels. As imagens foram desconvolvadas antes de medir as mudanças cromáticas. Medindo as mudanças cromáticas locais usando Chromagnon levou 51 s em um Mac com Intel Core i7 (quad core, 8 threads, 2,7 GHz), RAM de 16 GB e armazenamento flash de 1 TB. O parâmetro de alinhamento foi aplicado à imagem alvo (Figura 5C,D), que tem exatamente o mesmo número de voxels que a imagem de referência. Preparar o arquivo alinhado levou 3 s. Como resultado do corte dos pixels de borda durante o processo de alinhamento (caixa deseleção de margens de corte na Figura 1C),o número de voxels foi reduzido após o alinhamento(fatias de Figura 5B,51 Z, 252 x 251 pixels). O DNA na ponte de anáfase (indicada por pontas de flecha) é visto incorretamente fora do envelope nuclear antes do alinhamento(Figura 5C, óbvio no painel inferior mostrando a visão XZ), mas como esperado dentro do envelope após o alinhamento(Figura 5D).

Um exemplo de correção de mudança cromática usando uma imagem de referência de calibração biológica é mostrado na Figura 6. As imagens foram obtidas com um microscópio SIM equipado com três câmeras. Três imagens de células HeLa manchadas com faloides conjugadas a corantes azuis, verdes e vermelhos foram mediadas(Figura 6A). A imagem de referência compreende 3 canais de fatias de 76 Z, cada uma composta de 1.024 x 1.024 pixels. Medir mudanças cromáticas usando Chromagnon sem alinhamento local exigiu 194 s no sistema Mac descrito acima. O parâmetro foi aplicado a uma imagem-alvo composta por 3 canais de fatias de 73 Z, cada uma composta de 1.024 x 1.024 pixels. A geração do arquivo alinhado levou 25 s. A visualização XZ mostra posições incorretas do canal ao longo do Z, e ligeiramente ao longo das direções X(Figura 6A,C), mas este erro de registro foi corrigido após o alinhamento(Figura 6B,D).

Figura 5: Um exemplo de alinhamento com uma imagem de referência crosstalk. As células HeLa foram manchadas com DAPI para DNA (mostrado em magenta), Alexa Fluor 488 (mostrada em amarelo) para envelope nuclear, e Alexa Fluor 555 (mostrada em azul) para microtúbulos. As imagens foram adquiridas por microscopia de campo largo 3D com uma única câmera e desconvolved. (A,B) Uma imagem de referência de crosstalk representativa usando emissão DE DAPI, antes e depois do alinhamento por Chromagnon. Três canais coloridos são mostrados como sobrepostos. (C,D) Uma seção óptica da pilha 3D em três canais antes e depois do alinhamento. A aberração cromática axial é óbvia na ponte de anáfase mostrada por pontas de flecha. A barra de escala no painel A indica 5 μm para todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Um exemplo de alinhamento com uma imagem de referência de calibração biológica As imagens foram adquiridas com 3D-SIM equipado com três câmeras. (A,B) Uma imagem de referência media uma média de três imagens antes (A) e depois(B) alinhamento. As células HeLa foram manchadas com fábula conjugada com Alexa Fluor 405, 488 ou 594. (C,D) A imagem alvo antes(C) e depois(D) alinhamento. As células HeLa foram manchadas com DAPI para DNA (mostrado em magenta), Alexa Fluor 488 (mostrada em amarelo) para envelope nuclear, e Alexa Fluor 594 (mostrada em azul) para microtúbulos. A barra de escala no painel A indica 5 μm para todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O procedimento para correção cromática é uma troca entre precisão e esforço. Para salvar esforços desnecessários, é melhor saber quanta precisão é necessária para o seu estudo. A maior precisão pode não ser necessária para imagens convencionais de campo largo (ao vivo) e, portanto, imagens de referência de campo brilhante são muitas vezes suficientes para corrigir a mudança cromática. Da mesma forma, quando a condição de imagem e o ambiente são constantes, o uso repetido de uma calibração biológica economizará tempo. Por outro lado, se um registro altamente preciso for desejado, imagens de referência de cruzamento de alta qualidade ou de calibração biológica são necessárias. Para o melhor desempenho, as imagens de referência devem ser obtidas com condições e tempos semelhantes quanto possível. Enquanto as imagens de referência e de destino forem obtidas pela mesma microscopia, uma maior resolução espacial melhorará a precisão de correção. Se a desconvolução estiver disponível para imagens de referência e destino, então implementá-lo antes da correção pode melhorar a precisão de correção. Além disso, para o melhor desempenho, o teorema amostral do eixo óptico (Z) deve ser cumprido tanto na referência quanto no arquivo de destino para interpolação de subpixel preciso (etapa de protocolo 2.1.3).

A não correção da mudança cromática leva a conclusões incorretas. Além disso, o uso da calibração errada pode até piorar as mudanças cromáticas em vez de corrigi-las, e isso, portanto, precisa ser evitado. Resumimos as possíveis causas de falhas e suas soluções comuns, na Tabela 2. Para examinar a causa de uma falha, em primeiro lugar, é necessário verificar visualmente se a mudança cromática na imagem de referência está precisamente corrigida (protocolo passo 3.12). A maioria das falhas se deve à qualidade das imagens de referência e são facilmente corrigidas de acordo com as descrições na Tabela 2. Quanto à qualidade das imagens de referência, é importante notar que a precisão do alinhamento global diminui se todo o campo de visão não estiver preenchido com a amostra (Figura 7, Tabela 2). Comparado com o bom exemplo mostrado na Figura 7A,o mau exemplo mostrado na Figura 7B contém apenas três envelopes nucleares na região superior esquerda, e Chromagnon não conseguiu alinhar uma parte desta imagem. Isso porque o método de alinhamento global do Chromagnon divide o campo de visão em quatro regiões (Figura 7C) a fim de medir as diferenças de rotação e ampliação com alta precisão³. Este método, se operado corretamente, é uma ordem mais precisa do que outros métodos lineares, como a transformação polar de tronco e os métodos simplex³. Se alguma das quatro regiões não estiver disponível, então Chromagnon mudará para métodos lineares menos eficazes. Portanto, para o melhor desempenho, os exemplos mostrados na Figura 7B e Figura 7C são indesejáveis, e as quatro regiões devem ser preenchidas com objetos. Os usuários podem verificar se alguma região quadrática do campo de exibição não está disponível para medição olhando para o arquivo de registro ("Chromagnon.log"; veja o protocolo passo 3.10). Felizmente, esse problema pode ser facilmente superado pela média de múltiplas imagens de calibração biológica ou usando alinhamento local para imagens de referência de crosstalk ou campo brilhante(Tabela 2). Ao contrário do caso de falha na correta de imagens de referência, a falha na correção das imagens de destino é mais difícil de identificar. Como tais falhas surgem devido a diferenças nos formatos de arquivo, condições de imagem, tempos de imagem, métodos de imagem/alinhamento entre as imagens de referência e destino(Tabela 2),os usuários devem sempre ter cuidado ao usar imagens de referência obtidas em diferentes condições/tempos das imagens-alvo. Algumas imagens de exemplo estão disponíveis para testes (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) para obter uma ideia concreta das imagens de bom e mau exemplo.

Problema	Causa	Solução
Falha ao corrigir a imagem de referência	Baixo contraste	Adquira uma imagem de contraste maior, se possível. Se uma imagem de referência de campo brilhante for usada, readquiri a imagem em uma solução baseada em água para obter maior contraste da célula. Alternativamente, tente aplicar redução de ruído computacional (por exemplo, filtragem gaussiana). Desligue o alinhamento local, que é mais sensível ao ruído.
	Contaminação de imagens não relacionadas	Remova a fonte das imagens não relacionadas na amostra, se possível. Para obter imagens de referência de crosstalk, verifique os espectros de excitação dos corantes usados para as imagens-alvo. Se os corantes estiverem animados durante a aquisição de uma imagem crosstalk (por exemplo, Alexa Fluor 568 ou 594), considere outros corantes (por exemplo, Alexa Fluor 555). Se o pó no chip da câmera criar uma diferença óbvia de canal, limpe o chip da câmera ou use um método computacional de campo plano.
	Um ponto extremamente brilhante feito por um raio cósmico	Adquira a imagem novamente, se possível. Alternativamente, tente aplicar redução de ruído computacional (por exemplo, filtragem mediana ou gaussiana).
	Artefatos de desconvolução (sinais artificiais nas bordas axial e lateral)	Corte os pixels de borda ou seções Z após a desconvolução. Se um lado for aparado, o outro lado também deve ser aparado para manter o centro de imagem.
	O tamanho do passo Z muito esparso	Uma pilha Z deve ser adquirida para cumprir o critério nyquist, conforme escrito no protocolo 2.1.3.
	Aberração óptica	A aberração esférica é a maior aberração causada pelos usuários. Escolha a lente objetiva certa para a amostra e use uma espessura de deslizamento de tampa de 170 μm. Se a lente objetiva estiver equipada com um anel de correção, ajuste-a para encontrar a posição onde a maior contagem de fluorescência é obtida a partir do foco. No caso de um objetivo de imersão em óleo sem um anel de correção, ajuste o índice de refração do óleo de imersão que aumenta a contagem de fluorescência no foco.
	O campo de visão não é preenchido (Fig. 7)	No caso de imagens de referência de calibração biológica, em média muitas imagens. No caso de imagens de referência de crosstalk ou de campo brilhante, use o alinhamento local.
	Um bug de software não identificado	Informe o problema através do GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
Falha ao corrigir a imagem de destino	Metadados do arquivo de imagem são perdidos	Use o formato original do arquivo do microscópio que contém metadados completos e evite converter-se em um arquivo de tiff de várias páginas antes de processar. Use o mesmo pedido de canais escrito no protocolo 3.3.
	Métodos de alinhamento errados para a microscopia dada	Não aplique o método de alinhamento local ao medir de imagens de referência de calibração biológica para imagens-alvo. Não use imagens de referência crosstalk além de microscopia de campo largo.
	Diferenças nas condições de imagem	Mantenha as condições de imagem constantes entre a referência e as imagens de destino conforme escrito no protocolo 2.3.3.
	Diferenças na amostra (incluindo deslizamento de cobertura)	Use sempre o mesmo meio de montagem, deslizamento de tampa (por exemplo, nº 1,5H) e uma profundidade de foco semelhante.
	Microscópio deriva desde que a calibração foi feita pela última vez	Faça uma calibração tão frequentemente quanto a cada duas semanas. Mantenha a temperatura constante e use uma mesa flutuante para evitar a deriva do hardware do microscópio.

Tabela 2: Solução de problemas para correção cromática.

Figura 7: Exemplos de imagens de referência. Envelope nuclear em células de levedura de fissão rotuladas com GFP e mCherry. As imagens foram adquiridas com microscopia convencional de campo largo. As mudanças cromáticas foram corrigidas usando Chromagnon sem alinhamento local usando as próprias imagens como imagens de referência. As imagens foram então desconvolved para mostrar os detalhes. (A) Um bom exemplo com muitos objetos no campo de visão. (B) Um mau exemplo com objetos apenas no canto superior esquerdo. O desalinhamento é óbvio em uma determinada região da imagem. (C) Um exemplo indesejável onde uma das quadrisseções (separadas por linhas cruzadas pontilhadas) está vazia. A barra de escala no painel A indica 5 μm para a visão completa do campo e 1,25 μm para a visão ampliada e é aplicável a todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste protocolo, descrevemos três tipos de referência diferentes(Tabela 1). Entre elas, imagens de referência de crosstalk e imagens de referência de calibração biológica precisam de uma discussão mais cuidadosa. Para imagens de referência de crosstalk, amostras manchadas com DAPI ou Hoechst 33342, e montadas em glicerol ou mídia de montagem comercial podem ser usadas eficientemente para alinhar os canais azul, verde e vermelho. Da mesma forma, o Alexa Fluor 488 pode ser usado para alinhar os canais verde e vermelho. No entanto, obter fluorescência de crosstalk é muitas vezes difícil, uma vez que muitos corantes azuis, exceto DAPI e Hoechst são mais fracos e decadência mais rápido do que a maioria dos corantes verdes e vermelhos. Além disso, os espectros de emissões de corantes modernos são mais estreitos, o que torna o alinhamento de mais de três canais por esse método desafiador. Atenção também deve ser dada a alguns corantes vermelhos comuns (por exemplo, Alexa Flour 568 e 594, mas não Alexa Fluor 555) que podem ser animados pela luz violeta, que impedem a obtenção de imagens de crosstalk de alto contraste de corantes azuis. Outra desvantagem é que este método não pode medir a aberração cromática dos caminhos de luz de excitação na excitação multicolorida, pois apenas um único comprimento de onda de excitação é usado para excitação(Tabela 1). Como a microscopia mais avançada usa óptica de iluminação alterada, a aplicação deste método é limitada. Ainda assim, sua maior precisão de correção é suficientemente vantajosa para que seja descrita neste protocolo. Em geral, uma imagem de crosstalk deve ser tirada após uma imagem de destino para evitar efeitos branqueamento ou fototóxicos. Para o SMLM observado com o modo de campo largo, uma imagem de referência deve ser adquirida antes de adquirir uma imagem alvo, pois os corantes de fluorescência podem ser branqueados durante a imagem.

As imagens de referência de calibração biológica permitem que os usuários alinhem facilmente qualquer número desejado de canais ao custo de preparação adicional da amostra. Outra vantagem das imagens de referência de calibração biológica é a disponibilidade de "média" de múltiplas referências que ajudam a preencher todos os campos de visão. Este método pode sofrer de diferenças nas condições de imagem se a amostra de calibração for preparada em um slide diferente. A maior parte desse problema pode ser resolvida se ambos os alvos e referências forem preparados no mesmo slide usando óculos de cobertura de câmara comercial(Tabela 1),e outras condições de imagem são mantidas constantes como na etapa 2.3.3 do protocolo. Neste caso, uma precisão de correção semelhante à das imagens de referência crosstalk pode ser esperada³. O protocolo para usar a faloidina como mostrado aqui é uma das maneiras mais fáceis de manchar uma única estrutura celular com múltiplas cores. Existem inúmeros cenários possíveis para preparar amostras de calibração biológica. Para imunostaining, uma amostra pode ser rotulada com um único anticorpo primário seguido de coloração com anticorpos secundários de múltiplas cores. Desta forma, uma única estrutura de destino pode ser rotulada com múltiplas cores. Alternativamente, 5-ethynyl-2'-deoxyuridina, detectado por "clique" rótulos de química recém-sintetizados DNA em múltiplas cores em alta densidade, como descrito em detalhes anteriormente⁸. Para células vivas, é útil preparar uma cepa transgênica abrigando duas cópias de um gene que são fundidas a GFP ou mCherry para rotular a mesma estrutura com duas cores. Se o número de cópia do gene for crítico como frequentemente observado para proteínas de membrana, uma única cópia do gene pode ser fundida em conjunto com GFP e mCherry(Figura 7). Proteínas fluorescentes fotoconvertíveis, como o mEOS2^18,também podem ser usadas iluminando um nível moderado de luz violeta para obter ambas as espécies proteicas com ou sem fotoconversão. Em baixas condições de oxigênio, o GFP também pode ser usado como uma proteína fotoconvertível de verde a vermelho^19,20. A escolha da amostra de calibração certa tornará o experimento mais robusto.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de formaldeído a 16%	Polyscience	18814-10
Prato com fundo de vidro de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A30104
Alexa Fluor 488 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 594 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12381
Soro Bovino	Thermo Fisher Scientific	16170078
Lamínula	Matsunami	No. 1S HT
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dulbecco' s Meio Eagle Modificado com L-Gln e piruvato de sódio	Nacalai Tesque	08458-16
Meio de montagem (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1000
Anticorpo monoclonal anti-tubulina de camundongo (TAT1)			Descrito na Ref 15.
Nunc Lab-Tek II com câmara de lamínula (8 poços)		Thermo Fisher Scientific
Rabbit (ED1)			Um presente de Hiroshi Yorifuji, Universidade de Gunma, Gunma, Japão e Kiichi Arahata, Centro Nacional de Neurologia e Psiquiatria, Tóquio, Japão; falecido.
Anticorpo secundário com Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034
Anticorpo secundário com Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21424
Anticorpo secundário com Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032
TetraSpeck Microspheres, 0.2 µ m	Thermo Fisher Scientific	T7280