Artigo de método

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

DOI:

10.3791/60806

⸱

30 de março de 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imagens multiespectrais de fluorescência em tecidos parafina-fixados em parafina (FFPE) permitem a detecção de múltiplos marcadores em uma única amostra de tecido que pode fornecer informações sobre coexpressão de antígeno e distribuição espacial dos marcadores. No entanto, a falta de anticorpos adequados para tecidos formalin-fixos pode restringir a natureza dos marcadores que podem ser detectados. Além disso, o método de coloração é demorado. Aqui descrevemos um método rápido para realizar imagens de fluorescência multiespectral em tecidos congelados. O método inclui as combinações de fluoróforos utilizadas, etapas detalhadas para a coloração de camundongos e tecidos congelados humanos e os procedimentos de varredura, aquisição e análise. Para análise de coloração, é utilizado um sistema de imagem multiespectral multiespectral semiautomatizado disponível comercialmente. Através deste método, até seis marcadores diferentes foram manchados e detectados em uma única seção de tecido congelado. O software de análise de aprendizado de máquina pode fenótipo células que podem ser usadas para análise quantitativa. O método descrito aqui para tecidos congelados é útil para a detecção de marcadores que não podem ser detectados em tecidos FFPE ou para os quais os anticorpos não estão disponíveis para os tecidos FFPE.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os recentes avanços em técnicas de imagem microscópica melhoraram significativamente nosso conhecimento e compreensão dos processos biológicos e estados de doenças. In situ detecção de proteínas em tecidos via imunohistoquímica cromogênica (IHC) é realizada rotineiramente na patologia. No entanto, a detecção de múltiplos marcadores usando a coloração cromogênica do IHC está desafiando1 e métodos mais novos para usar abordagens de coloração multiplex imunofluorescência (mIF), onde vários marcadores biológicos são rotulados em uma única amostra de tecido, estão sendo desenvolvidos. A detecção de múltiplos marcadores biológicos é útil, pois as informações relacionadas à arquitetura tecidual, distribuição espacial das células e co-expressão de antígenos são capturadas em uma única amostra de tecido2. O uso da tecnologia de imagem de fluorescência multiespectral tornou possível a detecção de múltiplos marcadores biológicos. Nesta tecnologia, utilizando óptica específica, o espectro de fluorescência de cada fluoróforo individual pode ser separado ou "não misturado", permitindo a detecção de múltiplos marcadores sem qualquer crosstalk espectral3. A imagem de fluorescência multiespectral está se tornando uma abordagem crítica na biologia celular, desenvolvimento de fármacos pré-clínicos, patologia clínica e perfil imunológico do tumor4,5,6. É importante ressaltar que a distribuição espaçada das células imunes (especificamente as células CD8 T) pode servir como fator prognóstico para pacientes com tumores existentes7.

Várias abordagens para a coloração de fluorescência multiplex foram desenvolvidas e podem ser realizadas simultaneamente ou sequencialmente. No método de coloração simultânea, todos os anticorpos são adicionados como um coquetel em um único passo para rotular o tecido. A tecnologia UltraPlex usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com hapten seguido de um coquetel de anticorpos secundários anti-hapten conjugados com fluoroforre. A tecnologia InSituPlex8 usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com DNA únicos que são simultaneamente adicionados ao tecido seguido de um passo de amplificação e finalmente sondas conjugadas com fluoroforre que são complementares a cada seqüência de DNA única no anticorpo primário. Ambas as tecnologias permitem a detecção de quatro marcadores mais 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear. Duas outras abordagens para coloração multiplex simultânea são baseadas na espectrometria de massa de íons secundária9. O Sistema de Imagem Hyperion usa citometria de massa de imagem10 para detectar até 37 marcadores. Esta tecnologia usa um coquetel de anticorpos conjugados em metal para manchar os tecidos, e áreas específicas dos tecidos são ablatadas por um laser e transferidas para um citómetro de massa onde os íons metálicos são detectados. Outra tecnologia semelhante é o IONPath, que usa tecnologia de imagem de feixe de íons multiplexados11. Esta tecnologia usa um instrumento de espectrometria de massa modificado e uma fonte de íons de oxigênio em vez de laser para abpartir os anticorpos conjugados com metal. Embora todas essas abordagens simultâneas de coloração multiplex permitam a detecção de múltiplos marcadores, os custos envolvidos para conjugar DNA, haptens ou metais a anticorpos, a perda de tecido devido à ablação e o processamento extensivo de imagem para desmisturanão não podem ser subestimados. Além disso, kits e protocolos de coloração estão atualmente disponíveis apenas para tecidos FFPE e o desenvolvimento de painéis personalizados implica tempo e gastos adicionais.

O método sequencial de coloração multiplex, em contraste, inclui rotular o tecido com um anticorpo para um marcador, descascando para remover o anticorpo, seguido por repetições seqüenciais deste processo para rotular múltiplos marcadores12. A amplificação do sinal de tyramide (TSA) é o método de multiplexação seqüencial mais utilizado. Duas outras tecnologias de multiplexação usam uma combinação de métodos de coloração simultâneas e seqüenciais. A plataforma CODEX13 emprega um coquetel de anticorpos conjugados a sequências únicas de DNA oligonucleotídeo que são eventualmente rotulados com um fluoróforo usando uma etapa de polimerização indexada seguida de imagem, descascamento e repetição do processo para detectar até 50 marcadores. A abordagem de coloração multiplex MultiOmyx14 é uma iteração de coloração com um coquetel de três a quatro anticorpos conjugados com fluoroformes, imagem, saciação dos fluoróforos, e repetindo este ciclo para detectar até 60 marcadores em uma única seção. Semelhante ao método de coloração multiplex simultâneo, enquanto uma ampla gama de marcadores pode ser detectada, o tempo envolvido na coloração, aquisição de imagens, processamento e análise é extenso. A etapa de descascamento/saciedade envolve aquecimento e/ou branqueamento da amostra de tecido e, portanto, a abordagem sequencial de coloração multiplex é comumente realizada em tecidos FFPE que mantêm a integridade do tecido ao aquecer ou branquear.

A fixação da formalina e a incorporação subseqüente de parafina são prontamente realizadas em um ambiente clínico, blocos de tecido são fáceis de armazenar e vários protocolos de coloração multiplex estão disponíveis. No entanto, o processamento, incorporação e deparafinação dos tecidos de FFPE, bem como a recuperação de antígenos15, um processo pelo qual os anticorpos podem acessar melhor os epítopos, é demorado. Além disso, o processamento envolvido nos tecidos ffpe contribui para a autofluorescência16 e mascara epitopes-alvo, resultando na variabilidade e falta de clone de anticorpos disponíveis para detectar antígenos nos tecidos FFPE17,18,19. Um exemplo é o antígeno leucócito humano (HLA) classe I alelos20. Em contraste, o congelamento instantâneo de tecidos não envolve etapas de processamento extensivas antes ou depois da fixação, contornando a necessidade de recuperação de antígenos21,22, e tornando-o benéfico para a detecção de uma gama mais ampla de alvos. Portanto, o uso de tecidos congelados para imagens de fluorescência multiespectrais pode ser valioso para detectar alvos para estudos pré-clínicos e clínicos.

Dadas as limitações acima mencionadas ao usar tecidos FFPE, perguntamos se a imagem de fluorescência multiespectral pode ser realizada em tecidos congelados. Para responder a essa questão, testamos um método de coloração multiplex simultâneo usando um painel de anticorpos conjugados com fluoroforo para detectar múltiplos antígenos e analisamos a coloração usando um sistema de imagem multiespectral semi-automatizado. Conseguimos simultaneamente manchar até seis marcadores em uma única seção de tecido dentro de 90 minutos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os tecidos tumorais de camundongos e hlf1623 foram obtidos em nosso laboratório. O tecido de amígdalas humanas foi comprado de um vendedor comercial. Os detalhes estão fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Incorporação de tecidos

  1. Incorpore tecido fresco na solução OCT (temperatura de corte ideal) e congele o snap usando gelo seco ou nitrogênio líquido.
  2. Armazene tecidos a -80 °C.

2. Criosecção

  1. Corte seções de 8 μm em um criostato com temperaturas fixadas em -25 °C.
    NOTA: A espessura da seção preferida pode ser ajustada para gerar imagens mais nítidas.
  2. Coloque seções em lâminas de vidro carregadas.
  3. Seque as seções por 1 h à temperatura ambiente (RT) antes de fixar em acetona de grau de histologia por 10 min.
    NOTA: A acetona causa coagulação de proteínas solúveis em água e extrai lipídios, mas não afeta componentes que contêm carboidratos. Em contrapartida, a formalina preserva a maioria dos lipídios e tem pouco impacto sobre os carboidratos24. A escolha do fixador é importante dependendo da escolha do marcador ser detectado.
  4. Armazene os slides a -20 °C.

3. Seleção de Anticorpos e Fluoróforos

NOTA: Antes da coloração do tecido, os clones de anticorpos que irão manchar robustamente e especificamente seus antígenos de interesse dentro de seções seqüenciais do tecido fixo de acetona devem ser validados. Alguns anticorpos podem exigir um fixação diferente, e sua compatibilidade com outros anticorpos no painel também terá que ser empiricamente determinada. O objetivo também é identificar fluoróforos com sobreposição mínima que podem ser detectadas com os filtros de epifluorescência para DAPI, FITC, Cy3, Texas Red e Cy5.

  1. Confirme a coloração por iHC convencional ou detecção de imunofluorescência (IF) em seções teciduais com antígeno alvo de expressão conhecido.
  2. Utilizando os conjuntos de filtros de excitação e emissão disponíveis no sistema de imagem semi-automatizado e depois de testar várias combinações de anticorpos primários conjugados com fluoroforre, prepare fluoróforos para serem usados que tenham sobreposição espectral mínima (por exemplo, ver Tabela 1).

4. Coloração

NOTA: A reidratação tecidual e as lavadoras de slides foram realizadas em um frasco de Coplin. As etapas de bloqueio e incubação de anticorpos foram realizadas em uma caixa de slides umidificada.

  1. Deixe os slides aquecerem para RT por 5-10 min.
  2. Reidratar em salina tamponada fosfato (PBS) por 5 min.
  3. Realize um passo de bloqueio antes de colorir tecidos com anticorpos. Para seções de mouse, use solução de bloqueio especializada (ver Tabela de Materiais) por 10 min no RT. Para seções humanas, use 10% de soro humano agrupado normal (NHS) diluído em PBS por 15 min em RT.
    NOTA: Diferentes buffers de bloqueio podem ser testados conforme necessário para preservar as propriedades específicas das seções, dependendo dos procedimentos de seguimento a serem utilizados.
  4. Lave os slides por 5 min na PBS após o bloqueio.
  5. Para coloração multiplex, prepare um coquetel de anticorpos com fluoróforos compatíveis em diluições ideais predeterminadas.
  6. Adicione o coquetel de anticorpos conjugados com fluoroforre aos slides. Para coloração de um único marcador, adicione apenas o anticorpo conjugado primário ao slide.
  7. Inclua um slide não manchado de controle que passa pelo mesmo procedimento de coloração sem a adição de qualquer anticorpo conjugado primário.
  8. Incubar os slides por 1 h no RT no escuro e, em seguida, lavar os slides 2x com PBS por 5 min cada. A partir de agora, o slide resultante é referido como multiplex-manchado.
  9. Para contra-manchar, adicione DAPI ao slide manchado de multiplex, incubar por 7 min no escuro em RT e lavar os slides 2x com PBS por 5 min cada. Não contrariar slides manchados e não manchados.
  10. Para cobrir, adicione uma gota do meio de montagem e coloque suavemente a tampa do vidro sobre o tecido.

5. Preparando uma Biblioteca Espectral

  1. Aquisição de imagens
    1. Coloque a potência da lâmpada em 100%. Normalmente, a energia é definida para 10% porque a detecção de fluorescência em tecidos FFPE inclui um passo de amplificação de sinal.
    2. Comece abrindo o software operacional do microscópio (ver Tabela de Materiais).
    3. Selecione Editar protocolo e, em seguida, Novo Protocolo.
    4. Forneça um "Nome de Protocolo", selecione Fluorescência no Modo de Imageme forneça um "Nome de Estudo".
    5. Coloque os slides de uma mancha no palco e examine cada marcador em seu canal de fluorescência correspondente para garantir a coloração. Escolha uma região no tecido expressando o sinal mais forte para o marcador.
    6. Ajuste os tempos de exposição usando as opções Autofocus e Autoexpose.
    7. Adquira instantâneos para os slides manchados e não manchados e salve o protocolo.
      NOTA: As etapas a seguir são realizadas em software de aprendizagem de máquina (ver Tabela de Materiais),usando os slides manchados e não manchados para verificar a coloração específica, bem como para determinar a conversa cruzada de anticorpos.
    8. Na guia Construir bibliotecas no software, carregue cada imagem de slide de mancha única, escolha o Fluor apropriado e clique em Extrair. O software extrairá automaticamente o sinal de fluorescência escolhido no Fluor.
    9. Para salvar a cor extraída, clique em Salvar para armazenar. Um "Novo Grupo" pode ser criado ou a cor extraída pode ser armazenada em um grupo existente.
  2. Verificando a biblioteca espectral
    1. Verifique a janela da curva espectral de emissão, localizada à direita da imagem extraída, para cada conjunto de filtros.
      NOTA: O sinal extraído está correto se a curva espectral for observada apenas nos conjuntos de filtros onde o flúor é detectado. Se uma curva espectral for observada no conjunto de filtros errado, pode significar que o sinal primário esperado no conjunto de filtros não é forte o suficiente, ou o software está detectando outro sinal que é muito alto, possivelmente devido à sobreposição espectral. Neste caso, primeiro tente usar a ferramenta Draw Processing Regions para desenhar regiões ao redor de áreas que expressam o marcador fluorescente e autofluorescência na imagem. Isso treina o software para detectar o sinal verdadeiro e remover quaisquer sinais de interferência. Se isso não funcionar, repita o processo de coloração do slide manchado único para testar diferentes titulações de anticorpos.

6. Imagem multiespectral

NOTA: Uma vez que a biblioteca espectral seja criada e verificada, execute as seguintes etapas para o slide manchado de multiplex.

  1. Varredura de slides inteira
    1. Ajuste os tempos de foco e exposição no slide manchado de multiplex, conforme mencionado na seção 5.1.
    2. Em Scan Slides,crie uma nova tarefa e escolha o protocolo salvo acima.
    3. Faça uma varredura de slides completa no slide manchado de multiplex.
    4. Usando todo o software de varredura de slides, abra toda a imagem de varredura de slides. Esta imagem não foi espectralmente não misturada.
    5. Selecione regiões de interesse (ROI) em toda a imagem de varredura de slides usando a ferramenta Carimbo ou ROI. Estes ROIs serão escaneados usando os tempos de exposição definidos em 6.1.1 para serem utilizados para desmistura e análise espectrais.
    6. Clique em Process Slide para adquirir ROIs em ampliação de 20x
  2. Desmistura espectral
    1. Uma vez que os ROIs tenham sido adquiridos, no software de aprendizagem de máquina, na guia Análise Manual, carregue as imagens manchadas multiplex clicando em Abrir em Arquivo.
    2. No menu suspenso Fonte da Biblioteca Espectral clique em Selecionar Fluors.
    3. Uma nova janela se abrirá. Aqui, escolha a biblioteca espectral ou grupo criado acima.
    4. Carregue a imagem de slides não manchada. Clique no ícone do marcador de tinta AF localizado acima da biblioteca espectral selecionada e desenhe uma linha ou região no slide não manchado para identificar a autofluorescência no tecido.
    5. Na guia Editar marcadores e cores, atribua nomes para cada marcador. Pseudo cores podem ser atribuídas nesta etapa.
      NOTA: A cor da imagem Autofluorescence é padrão para DarkSlateGray. Mude isso para black.
    6. Clique em Preparar tudo.
  3. Verificando imagens espectralmente não misturadas
    NOTA:     Quando a etapa de desmistura espectral é concluída, uma imagem composta composta por todas as cores é criada.
    1. Clique em Editar o ícone 'Exibir olho'. Aqui, cada cor no "Exibição de Componentes" pode ser desligada ou ligada para visualizar a coloração de cada marcador individual.
    2. Inspecione visualmente a coloração e a morfologia das células para garantir que não haja sobreposição de marcadores, a menos que seja biologicamente relevante. Um patologista pode ajudar a verificar a coloração também.
      NOTA: A coloração no slide multiplexado deve ser validada deixando de fora um flúor de cada vez e revendo o padrão de coloração. Além disso, a validação também ajudará a identificar fluoróforos fortes que aparecem em espectros adjacentes devido à conversa cruzada de anticorpos ou sangramento.
    3. Para Visualizações patológicas,que simulam imagens de campo brilhante para cada marcador fluorescente, clique no botão Selecionar uma imagem componente. Aqui, escolha um marcador para visualizar uma imagem de campo brilhante simulada.

7. Analisar imagens multiespectrais através de segmentação celular e fenotipagem

NOTA: Após verificar a imagem espectralmente não misturada, a segmentação celular pode ser realizada usando o software de aprendizado de máquina, que fornecerá instruções passo a passo. A segmentação do tecido não foi realizada aqui. Se o painel incluir um ou mais marcadores específicos de tecido e especialmente se o tecido estiver bagunçado, a segmentação tecidual deve ser realizada.

  1. Selecione "Cytoplasm" e "Membrana" na opção "Segment".
    NOTA: "Núcleos" é escolhido por padrão.
  2. Selecione um marcador no painel. Configure o marcador para detectar núcleos, citoplasma ou membrana. Por exemplo, o DAPI pode ser selecionado para detectar núcleos e CD3 para membrana.
  3. Clique no botão ellipsis ('...') para selecionar uma opção em "use este sinal para encontrar". Por exemplo, 'núcleos' para DAPI. Vários marcadores do painel podem ser selecionados para segmentação.
    NOTA: Para marcadores citoplasmáticos ou de membrana, selecione a opção "Use este sinal para auxiliar na segmentação nuclear".
  4. O software detecta e cria automaticamente uma máscara para o núcleo, citoplasma e membrana na imagem.
  5. Certifique-se de que todas as células estão 'mascaradas' para segmentação. Para ajustar, mude para a exibição patológica para o marcador específico escolhido em 7.3. e usar as opções de configuração no software.
  6. Cliqueem "Segmentar tudo"para segmentar células.
  7. Após a segmentação celular, prossiga com células fenotipadas. Nesta etapa, escolha os marcadores necessários para a fenotipagem e selecione manualmente pelo menos cinco células que estejam manchadas com o marcador escolhido. Isso treina o software para detectar automaticamente todas as células manchadas com o marcador escolhido na imagem.
  8. Um mapa fenótipo é criado. Analise para garantir que a célula manchada com o marcador esteja corretamente fenotipo.
    NOTA: Fenotipagem celular pode ser um processo iterativo. Se o software não for capaz de fenótipo corretamente as células, significa que o treinamento é inadequado ou incorreto. Neste caso, o usuário tem que selecionar manualmente mais células e retreinar o software e repetir este passo até que o usuário esteja satisfeito com o treinamento.
  9. Crie um grupo chamado "Outros" e inclua células que não estão manchadas para nenhum dos marcadores.
    NOTA: Esta etapa é importante para treinar o software para excluir todas as células não manchadas da fenotipagem.

8. Exportando imagens e tabelas de análise

  1. Clique no botão Exportar para exibir o painel Exportar configurações.
  2. No "Diretório de exportação", clique em Procurar para selecionar um local para exportar as imagens.
  3. Em "Opções de exportação de imagens", escolha o formato de saída de imagem.
  4. Na lista "Imagens para Exportar", selecione as imagens a serem exportadas. "Imagem composta" é a imagem final pseudocolorida e não misturada. "Pathology Views" são as imagens de campo brilhante simuladas individuais e as "Imagens componentes (TIFF multi-imagem)" é um arquivo TIFF de várias imagens de dados componentes que pode ser usado por software de análise de terceiros.
  5. Clique no botão"Exportar para todos"para exportar as imagens.
    NOTA: Tabelas de análise também podem ser selecionadas e exportadas nesta etapa.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Detecção de marcadores manchados únicos em seções congeladas do baço
Como o sistema de imagem semi-automatizado usa um sistema de filtro de cristal líquido (LCTF) que permite uma gama mais ampla de detecção de comprimento de onda25, e como não foram realizadas etapas de amplificação de sinal aqui, primeiro otimizamos a detecção de nossos anticorpos conjugados primários para cada marcador no microscópio. Um exemplo é mostrado na Figura 1,onde cada m...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os tecidos congelados têm sido amplamente utilizados para a imagem mIF para detectar tradicionalmente três a quatro marcadores31 em um tecido usando o método direto e indireto32. No método direto, os anticorpos são conjugados a corantes fluorescativos ou pontos quânticos33 para rotular o tecido, enquanto no método indireto, um anticorpo primário não conjugado é usado para rotular o tecido seguido por um anticorpo secundário conjugado com fluoroforme ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A orientação de imagem e análise foi fornecida pelo Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core da Universidade de Illinois em Chicago, criado com o apoio do escritório do Vice-Chanceler para Pesquisa. O trabalho foi apoiado pelo NIH/NCI RO1CA191317 ao CLP, pelo NIH/NIAMS (subvenção da SBDRC 1P30AR075049-01) ao Dr. A. Paller, e pelo apoio do Centro De Câncer Integral Robert H. Lurie ao Núcleo de Avaliação de Imunoterapia da Universidade Northwestern.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acetona (grau histológico)Fisher ScientificA16F-1GALFixação de tecidos
Alexa Fluor 488 anti-camundongo CD3BioLegend100212Clone - 17A2; anticorpo conjugado primário
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humano CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Clone - L26; anticorpo conjugado primário
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67BD Biosciences558617Anticorpo conjugado primário
Alexa Fluor 594 anti-CD3 humanoBioLegend300446Clone - UCHT1; anticorpo conjugado primário
Alexa Fluor 594 anti-camundongo CD8aBioLegend100758Clone - 53-6.7; anticorpo conjugado primário
Alexa Fluor 647 anti-CD8a humanoBioLegend372906Clone - C8/144B; anticorpo
conjugado primárioAlexa Fluor 647 anti-rato CD206 (MMR)BioLegend141711Clone - C068C2; anticorpo conjugado primário
Alexa Fluor 647 anti-rato CD4BioLegend100426Clone - GK1.5; anticorpo conjugado primário
C57BL/6 MouseCharles River Laboratories27Tecidos congelados de camundongos usados para treinamento multiespectral
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EALâminas de reidratação e lavagem
Solução DAPIBD Biosciences564907Mancha de ácido nucleico
Lâminas carregadas de vidro branco de diamanteDOT ScientificDW7590WSeções de tecido aderentes
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x (sem Ca e Mg)Fisher ScientificMT21031CVLavagem e diluente
Lamínulas de vedação de ouroThermoFisher Scientific3306Protegendo tecidos corados
Amígdala Normal Humana OCT bloco de tecido congeladoAMSBioAMS6023Tecido humano congelado usado para coloração multiespectral
Soro humano 1xGemini Bio-Products100-512Bloqueio e diluente para tecidos humanos
inFormAkoya BiosciencesVersão 2.4.1Software de aprendizado de máquina
PerCP/Cyanine5.5 anti-humano CD4BioLegend300529Clone - RPA-T4; anticorpo conjugado primário
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11bBD Biosciences550993Clone - M1/70; anticorpo conjugado primário
PhenochartAkoya BiosciencesVersão 1.0.8Software de varredura de lâminas inteiras
ProLong Diamond Antifade MountantThermoFisher ScientificP36965Meio
de montagemCriostato de pesquisaLeica BiosystemsCM3050 SSeccionamento de tecidos
Superbloco 1xThermoFisher Scientific37515Bloqueio de tecidos de camundongos
Tissue-Tek O.C.T SolutionSakura Finetek4583Incorporação de tecidos
Vectra 3.0 Sistema automatizado de imagem de patologia quantitativa, 6 SlideAkoya BiosciencesCLS142568Imagem multiespectral semiautomatizada sistema
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesVersão 3.0.5Software para operar microscópio

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752(2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. , Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47(2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479(1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017(2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03(2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652(2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338(2019).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Combina es de Fluor forosCria o de Biblioteca EspectralAn lise por Aprendizado de M quinaSegmenta o CelularProtocolo de Colora o com AnticorposDesmistura EspectralVarredura de L mina InteiraMapeamento de Fen tipos

Artigos relacionados