Indução de Morte Cerebral em Camundongos Usando Monitoramento e Ventilação intra-arterial da pressão arterial via traqueostomia

Resumo

Apresentamos um modelo murina de indução de morte cerebral para avaliar a influência de seus efeitos fisiopatológicos nos órgãos, bem como em enxertos consecutivos no contexto do transplante de órgãos sólidos.

Resumo

Embora tanto a doação viva quanto a doação após a morte circulatória forneçam oportunidades alternativas para o transplante de órgãos, a doação após a morte cerebral do doador (DB) ainda representa a principal fonte de transplantes sólidos. Infelizmente, a perda irreversível da função cerebral é conhecida por induzir múltiplas alterações fisiopatológicas, incluindo hemodinâmica, bem como modificações hormonais, finalmente levando a uma resposta inflamatória sistêmica. Modelos que permitem uma investigação sistemática desses efeitos in vivo são escassos. Apresentamos um modelo murina de indução de BD, que poderia auxiliar investigações sobre os efeitos devastadores da BD na qualidade do aloenxerto. Depois de implementar a medição da pressão arterial intra-arterial através da artéria carótida comum e ventilação confiável através de uma traqueostomia, a DB é induzida pelo aumento constante da pressão intracraniana usando um cateter de balão. Quatro horas após a indução da BD, os órgãos podem ser colhidos para análise ou para novos procedimentos de transplante. Nossa estratégia permite a análise abrangente do BD doador em um modelo de murina, permitindo assim uma compreensão aprofundada dos efeitos relacionados ao BD no transplante de órgãos sólidos e potencialmente abrindo caminho para o pré-condicionamento otimizado de órgãos.

Introdução

O transplante é atualmente o único tratamento curativo para falência de órgãos em estágio final. Até agora, os pacientes com morte encefálica (BD) têm sido a principal fonte de doação de órgãos, embora a doação e a doação vivas após a morte circulatória sejam alternativas valiosas¹. A DB é definida por um coma irreversível (com uma causa conhecida), a ausência de reflexos do tronco cerebral e apnéia². Infelizmente, os órgãos bd demonstram resultados inferiores na sobrevivência do enxerto a longo prazo independente do antígeno leucócito humano (HLA)-incompatibilidade e tempo isquêmico frio³. Enquanto isso, pesquisas intensivas sobre este fator de risco independente de antígeno têm sido realizadas resultando em três aspectos principais das alterações fisiopatológicas mediadas em consequência da DB: hemodinâmica, hormonal e inflamatória⁴.

Até o momento, modelos experimentais de BD em roedores têm sido realizados principalmente usando ratos. A fim de obter maior visão sobre as consequências imunológicas sobre órgãos sólidos após a BD, buscou-se estabelecer um modelo murina de BD, uma vez que atualmente apenas modelos de camundongos permitem investigações abrangentes sobre fatores genéticos ou imunológicos. Neste contexto, o sistema do mouse fornece uma variedade maior de ferramentas analíticas.

O princípio da indução de BD como descrito aqui baseia-se em um aumento da pressão intracraniana induzida pela inflação de um cateter de balão inserido sob o crânio. O aumento da pressão intracraniana imita o mecanismo fisiológico da BD bloqueando a perfusão do ceêmto, cerebelo e tronco cerebral^5,6. Para garantir perfusão suficiente de órgãos periféricos, a medição da pressão arterial é obrigatória durante o procedimento. O cateter usado para este fim ao mesmo tempo serve para a administração de soro estona, a fim de estabilizar a pressão arterial por substituição de fluidos. Como a BD é acompanhada pela cessação da respiração espontânea, deve-se garantir ventilação suficiente. Um cobertor elétrico mantém a temperatura fisiológica do corpo do núcleo.

Em resumo, este modelo permitirá estudos aprofundados sobre a influência da lesão induzida pelo BD, sobre a migração de leucócitos⁷, ativação de elogios⁸, lesão de reperfusão isquêmica⁹, e outros fatores.

Protocolo

Os experimentos com animais foram realizados em conformidade com os Princípios de Cuidados Com Animais Laboratoriais formulados pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório elaborado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NI Publication nº 86-23, revisado em 1985). Todos os experimentos foram aprovados pelo Ministério da Educação, Ciência e Cultura da Áustria (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. Cateterismo arterial

1. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina¹⁰ e um analgésico de acordo com a prática local (por exemplo, buprenorfina).  Aperte os membros traseiros com fórceps para confirmar a profundidade correta da anestesia.
   NOTA: Para este estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6N masculinos com idade sofrícia de 8 a 12 semanas (peso 20-25 g). Os autores testaram balb/c masculino da mesma idade sem sucesso, mas não tentaram outras cepas (ver Discussão).
2. Remova o cabelo nas regiões de interesse (cabeça, pescoço) usando uma navalha elétrica. Certifique-se de que não restam pelos soltos para evitar a contaminação da ferida. Posteriormente desinfete o campo cirúrgico com 70% de etanol/clorexidina/betadina e coloque o camundongo supino com a cabeça voltada para o cirurgião.
3. Faça uma incisão cervical da linha média com uma tesoura dissecante.
4. Disseque as glândulas submandibulares e o tecido muscular do pescoço e separe-as para expor a artéria carótida comum. Use dissecção principalmente contundente através de fórceps.
5. Coloque três 8-0 ligaduras de seda sob a artéria carótida comum direita.
6. Coloque um grampo na ligadura proximal e coloque tensão na artéria para que o fluxo seja suspenso.
7. Feche a ligadura mais distal.
8. Insira o cateter arterial através de um pequeno orifício de pele pré-formado no aspecto craniano da incisão. Aperte e deforme o lúmen do cateter se parecer muito grande para reduzir o fluxo sanguíneo. Fixar-se com as três ligaduras.
9. Fixar o cateter na pele para evitar luxação. Faça isso usando uma sutura (por exemplo, monofilamento 5-0, não absorvível) que conecta o cateter à pele na área do orifício de pele pré-formado.

2. Traqueostomia

1. Disseque a musculatura pré-traqueal sem rodeios usando fórceps.
2. Coloque dois 8-0 ligaduras de seda sob a traqueia.
3. Traqueotomizar usando micro tesouras o mais proximamente possível para evitar ventilação unilateral. Use uma linha de corte horizontal entre duas cartilagens traqueais.
4. Insira o tubo de ventilação e fixe-se com ambas as ligaduras preparadas.
   NOTA: A extremidade proximal da traqueia não precisa ser ligada.
5. Feche a pele com uma sutura em execução (por exemplo, 6-0 monofilamento, não absorvível).
6. Ventile o mouse com uma frequência de 150/min e um volume de maré de 200 μL.

3. Indução de morte cerebral

1. Mande o mouse para a posição propensa.
2. Remova a pele do crânio usando tesouras cirúrgicas e fórceps para segurar a pele.
3. Fure um furo de calibre de 1 mm paramedialmente acima do córtex parietal esquerdo. Pare de perfurar antes de romper o osso compacto interno e a dura-máter.
4. Penetre na ponte de tecido final do crânio usando fórceps contundentes, removendo bordas afiadas.
5. Insira o cateter de balão, de modo que esteja inteiramente dentro da cavidade craniana. Certifique-se de que o balão está pré-preenchido com salina e que todo o ar seja evacuado.
6. Inicie a inflação em ~0,1 mL/min durante um período de 10-15 min (volume total de 0,8-1,2 mL) com a ajuda de uma bomba de seringa.
   NOTA: O rato exibirá mioclonus, miríase, atividade de apreensão adicional e suspiros agonais.
7. Pronuncie o cérebro do rato morto uma vez que a cauda do rato ficou dura e erguida.
   NOTA: A DB é confirmada por um pico de pressão arterial inicial característico (reflexo cushing), ausência de reflexos do tronco cerebral e respiração espontânea. Testes regulares de apnéia devem ser evitados durante os experimentos, pois os camundongos podem se tornar inestáveis circulatórios devido à falta de oxigênio.
8. Pare a inflação do cateter de balão.
9. Coloque um cobertor de aquecimento sobre o rato para evitar hipotermia.

4. Durante o período BD

1. Monitore e documente a pressão arterial regularmente. Exclua camundongos com uma fase hipotensiva prolongada (pressão arterial média [MAP] < 50 mmHg para >30 min).
2. Infundir 0,1 mL de salina a cada 30 min para estabilizar a pressão sanguínea do camundongo.
   NOTA: No total, 0,8 mL de salina foi administrado a cada rato neste estudo.
3. Após 4h de duração da BD, colher órgãos/tecidos do camundongo. Exclua o mouse do experimento se o coração do rato não estiver batendo no final do experimento.

5. Procedimento sham

1. Executar as etapas 1.1-3.3.
   NOTA: Não abra o osso compacto interno. Não insira ou infle um cateter de balão.
2. Fique perto do rato e observe continuamente o animal. Belisque repetidamente os membros traseiros com fórceps para confirmar a profundidade correta da anestesia. Aplique anestesia adicional subcutânea (aproximadamente 1/2 da dose inicial) se o mouse mostrar sinais de despertar, o que, para nossa experiência, acontece aproximadamente após 2-3 h pós-anestesia.
3. Aplique a mesma quantidade de salina intravenosa que nos camundongos BD.
   NOTA: O rato falso recuperará a respiração espontânea após a cessação da ventilação. O mouse BD não. O teste de apnéia deve ser feito durante o estabelecimento do modelo, mas durante os experimentos deve ser evitado devido ao estresse fisiológico desnecessário.

Resultados

O modelo murine BD foi realizado com sucesso mais de 100 vezes com uma taxa de sucesso superior a 90%. Além disso, o transplante de órgãos pós-intervencionistas de coração e rim foi realizado com segurança⁷.

A DB induz uma variedade de alterações fisiopatológicas que podem ser investigadas posteriormente usando este modelo. Como mostrado na Figura 1,a pressão arterial mostra ...

Discussão

A DB, fator de risco para a qualidade do aloenxerto em doadores multiórgãos, implica uma infinidade de alterações fisiopatológicas, que só podem ser suficientemente avaliadas utilizando modelos in vivo. Alterações hemodinâmicas, tempestade de citocinas, alterações hormonais e seu impacto final na qualidade e sobrevivência do enxerto de órgãos não podem ser analisados in vitro⁴. A maioria dos transplantes básicos, bem como da pesquisa imunológica, depende de ferramentas de diagnóstico sofisticadas,...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cateter arterial (BD Neoflon 26G)BD		391349
Transdutores de Pressão Arterial (APT300)	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Cateter de Embolectomia Arterial Fogarty N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
Fórceps	FST	11271-30
Sistemas de Manta Homeotérmica com Sonda Flexível	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
Micro scissor	FST	15018-10
Porta-agulhas	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Bomba 11 Elite Infusão Apenas Único	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
Scissor	FST	14075-11
Microscópio estereotáxico	Olympus	SZX7
Transpore Tape	3M	1527-1
Underpads	Molinea.A	274301
Ventilador para camundongos (MiniVent Modelo 845)	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109