Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

Resumo

Este protocolo apresenta uma maneira simples e coerente de regulamentar transitoriamente um gene de interesse usando modRNA após infarto do miocárdio em camundongos.

Resumo

O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo ocidental. Na última década, a terapia genética tornou-se uma opção promissora de tratamento para doenças cardíacas, devido à sua eficiência e efeitos terapêuticos excepcionais. Em um esforço para reparar o tecido danificado pós-MI, vários estudos têm empregado terapia genética baseada em DNA ou viral, mas enfrentaram obstáculos consideráveis devido à expressão pobre e descontrolada dos genes entregues, edema, arritmia e hipertrofia cardíaca. O mRNA modificado sintético (modRNA) apresenta uma nova abordagem de terapia genética que oferece alta, transitória, segura, não imunomunogênica e entrega mRNA controlada ao tecido cardíaco sem qualquer risco de integração genômica. Devido a essas características notáveis combinadas com sua farmacocinética em forma de sino no coração, o modRNA tornou-se uma abordagem atraente para o tratamento de doenças cardíacas. No entanto, para aumentar sua eficácia in vivo, um método de entrega consistente e confiável precisa ser seguido. Assim, para maximizar a eficiência de entrega do modRNA e a consistência de rendimento no uso de modRNA para aplicações in vivo, é apresentado um método otimizado de preparação e entrega de injeção intracardiac modRNA em um modelo MI de mouse. Este protocolo tornará a entrega de modRNA mais acessível para pesquisas básicas e translacionais.

Introdução

A terapia genética é uma poderosa ferramenta que envolve a entrega de ácidos nucleicos para o tratamento, cura ou prevenção de doenças humanas. Apesar do progresso nas abordagens diagnósticas e terapêuticas para doenças cardíacas, houve sucesso limitado na entrega de genes no infarto do miocárdio (MI) e insuficiência cardíaca (HF). Por mais simples que o processo de terapia genética pareça, é uma abordagem marcadamente complexa considerando os muitos fatores que precisam ser otimizados antes de empregar um determinado veículo de entrega. O vetor de parto correto deve ser não-imunogênico, eficiente e estável dentro do corpo humano. Os esforços nesse campo geraram dois ....

Protocolo

Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no Comitê de Cuidados Institucionais e De Uso do Monte Sinai.

1. Síntese de modRNA

NOTA: Os detalhes da síntese modRNA podem ser encontrados em Kondrat et al.¹³.

1. Peça os modelos plasmídeos(Tabela de Materiais)e gere um produto PCR limpo para usar como modelo mRNA.
2. Prepare os modRNAs por transcrição in vitro com uma mistura de ribonucleosídeo personalizada do seguinte(Tabela de Materiais): Kit de transcrição T7, 6 mM anti-reverso analógico (ARCA) ....

Resultados

Camundongos de oito a dez semanas foram anestesiados com isoflurano e entubados. Após o animal estar sob anestesia, a região torácica esquerda foi raspada e esterilizada com etanol, e o coração foi exposto para ligadura LAD. A artéria coronária esquerda foi ocluída por amarrar firmemente a sutura sob a artéria (representação diagrama Figura 1A). Após um infarto bem sucedido (indicado pela paling da parede livre ventricular esquerda), uma injeção direta de 100 μg de Luc ou Cre modRNA dissolvi.......

Discussão

A terapia genética tem mostrado um enorme potencial para avançar significativamente no tratamento de doenças cardíacas. No entanto, as ferramentas tradicionais empregadas nos ensaios clínicos iniciais para o tratamento de HF têm mostrado sucesso limitado e estão associadas a efeitos colaterais graves. O RNA modificado apresenta uma entrega genética não-viral que está continuamente ganhando popularidade como uma ferramenta de transferência genética no coração. ModRNA não requer localização nuclear de genes para tradução, .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Trifosfato de adenosina	Invitrogen	AMB13345	incluído no kit Megascript
Fosfatase Antártica	New England Biolabs	M0289L
Análogo de tampa anti-reversa, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G	TriLink Biotechnologies	N-7003
Sistema de imagem bioluminescense	Perkin Elmer	124262	IVIS100 sistema de imagem de dispositivo acoplado a carga
Afastadores rombos	FST	18200-09
Tropnina cardíaca I	Abcam	47003
Trifosfato de citidina	Invitrogen	AMB13345	Incluído no kit Megascript
Sistema de Anestesia Dupla	Aparelho Harvard	75-2001
Fórceps- Adson	FST	91106-12
Fórceps- Dumont #7	FST	91197-00
Trifosfato de guanosina	Invitrogen	AMB13345	Incluído no kit Megascript
Kit de transcrição in vitro	Invitrogen	AMB13345	5X MEGAscript T7 Kit
Cânula de intubação	Aparelho Harvard Kit
Megaclear Life	Technologies
Ventilador de rato	Harvard Aparelho	73-4279
N1-metilpseudouridina-5-trifosfato	Espectrômetro NanoDrop TriLink Biotechnologies	N-1081
	Thermo Scientific
Suporte de agulha Olsen hegar com tesoura de sutura	FST	12002-12
Modelos de plasmídeo	GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Tesoura de dissecação de ponta afiada	FST	14200-12
Estereomicroscópio	Zeiss
Suturas	Ethicon	Y433H	5.00
Suturas	Ethicon	Y432H	6.00
Suturas	Ethicon	7733G	7.00
T7 DNase enzima	Invitrogen	AMB13345	Incluído no kit Megascript
Estação de	fitaKit	4200
	Invitrogen	AM1908	Megaclear
Ultra-4 filtros centrífugos 10k	Amicon	UFC801096

de limpeza de transcrição Aligent