Artigo de método

Fabricação da Interface Nervosa Periférica Regenerativa Composta (C-RPNI) no Rato Adulto

DOI:

10.3791/60841

⸱

25 de fevereiro de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

Neste artigo

Resumo

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O manuscrito a seguir descreve um novo método para desenvolver um sistema de feedback neural de loop fechado biológico chamado interface nervosa periférica regenerativa composta (C-RPNI). Esta construção tem a capacidade de se integrar com nervos periféricos para amplificar sinais motores efélios, ao mesmo tempo em que fornece feedback sensorial afável.

Resumo

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Os recentes avanços nas neuropróteses permitiram que aqueles que vivem com perda de extremidade reproduzissem para reproduzir muitas funções nativas da extremidade ausente, e isso é frequentemente realizado através da integração com o sistema nervoso periférico. Infelizmente, os métodos atualmente empregados estão frequentemente associados a danos significativos no tecido que previne o uso prolongado. Além disso, esses dispositivos muitas vezes não possuem qualquer grau significativo de feedback sensorial, pois sua construção complexa amortece quaisquer vibrações ou outras sensações que um usuário pode ter previamente dependido ao usar próteses mais simples. A interface nervosa periférica regenerativa composta (C-RPNI) foi desenvolvida como uma construção estável e biológica com a capacidade de amplificar sinais nervosos motores efíferos, proporcionando feedback sensorial afsidiário. O C-RPNI consiste em um segmento de enxerto dérmico e muscular livre protegido em torno de um nervo sensorial misto, com reinnervação preferencial do nervo motor do enxerto muscular e reineza nervosa sensorial do enxerto dérmico. Em ratos, esta construção demonstrou a geração de potenciais de ação muscular composto (CMAPs), amplificando o sinal do nervo alvo do nível de micro-milivolts, com índices de sinal para ruído em média aproximadamente 30-50. A estimulação do componente dérmico da construção gera potenciais compostos de ação nervosa sensorial (CSNAPs) no nervo proximal. Como tal, essa construção tem utilidade futura promissora para a realização da prótese ideal e intuitiva.

Introdução

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As amputações de extremidade afetam quase 1 em cada 190 americanos1, e sua prevalência deve aumentar de 1,6 milhão hoje para mais de 3,6 milhões até 20502. Apesar do uso documentado há mais de um milênio, a prótese ideal ainda não foi realizada3. Atualmente, existem próteses complexas capazes de múltiplas manipulações articulares com potencial para reproduzir muitas funções motoras da extremidade nativa4,5. No entanto, esses dispositivos não são considerados intuitivos, pois o movimento protético desejado é tipicamente funcionalmente separado do sinal de controle de entrada. Os usuários normalmente consideram essas "próteses avançadas" difíceis de aprender e, portanto, não são adequadas para uso diário1,6. Além disso, próteses complexas atualmente no mercado não fornecem nenhum grau apreciável de feedback sensorial sutil para controle adequado. A sensação de toque e propriocepção são vitais para a realização de tarefas diárias, e sem essas, atos simples como pegar uma xícara de café se tornam pesados, pois depende inteiramente de pistas visuais7,8,9. Por essas razões, próteses avançadas estão associadas a um grau significativo de fadiga mental e muitas vezes são descritas como pesadas e insatisfatórias5,10,11. Para resolver isso, alguns laboratórios de pesquisa desenvolveram próteses capazes de fornecer um grau limitado de feedback sensorial via interação neural direta12,13,14,15, mas o feedback é muitas vezes limitado a pequenas áreas espalhadas nas mãos e dedos12,13, e as sensações foram notadas como dolorosas e não naturais às vezes15. Muitos desses estudos infelizmente não têm qualquer acompanhamento apreciável a longo prazo e histologia nervosa para delinear os efeitos do tecido local, ao mesmo tempo em que notam a falha na interface na escala de semanas a meses16.

Para essa população, o dispositivo protético ideal forneceria um controle motor de alta fidelidade, juntamente com um feedback somatosensorial significativo do ambiente do indivíduo ao longo de sua vida. Crítico para o design da referida prótese ideal é o desenvolvimento de uma interface estável e confiável que permitiria a transmissão simultânea de informações somatossensoriais afívelmente com sinais motores efferent. As mais promissoras interfaces humanos-máquinas atuais são aquelas que interagem diretamente com o sistema nervoso periférico, e os desenvolvimentos recentes no campo das próteses neurointegradas têm trabalhado para fazer a ponte entre sinais bioelétricos e mecânicos17. As interfaces atuais utilizadas incluem: placas nervosas flexíveis14,15,18, eletrodos de punho extra-neural13,19,20,21,22,23, eletrodos penetrantes de tecido24,25,31,32, e eletrodos intrafasciculares26,27 ,28. No entanto, cada um desses métodos tem demonstrado limitações em relação à especificidade nervosa, lesão tecidual, degeneração axonal, esgotamento da mielina e/ou formação de tecido cicatricial associado à resposta crônica do corpo estranho16,17,18,19. Mais recentemente, foi postulada que um motorista por trás de eventual falha de eletrodo implantado é a diferença significativa no moduli de Young entre material eletrônico e tecido neural nativo. O tecido cerebral está sujeito a micromo significativo diariamente, e tem sido teorizado que o estresse da tesoura induzido por diferenças no moduli de Young causa inflamação e eventual cicatriz permanente30,31,32. Esse efeito é frequentemente agravado nas extremidades, onde os nervos periféricos estão sujeitos tanto ao micromovimento fisiológico quanto ao macromovimento da extremidade intencional. Devido a esse movimento constante, é razoável concluir que a utilização de uma interface nervosa periférica completamente abiótica não é ideal, e uma interface com um componente biológico seria mais adequada.

Para atender a essa necessidade de um componente biológico, nosso laboratório desenvolveu uma interface nervosa biótica denominada Interface Nervosa Periférica Regenerativa (RPNI) para integrar nervos periféricos transseccionados em um membro residual com um dispositivo protético. A fabricação de RPNI envolve implantar cirurgicamente um nervo periférico em um enxerto muscular livre autólogo, que posteriormente revasculariza e reinfeta. Nosso laboratório desenvolveu essa interface nervosa biológica na última década, com sucesso em amplificar e transmitir sinais motores quando combinado com eletrodos implantados em ensaios em animais e humanos, permitindo um controle protético adequado com múltiplos graus de liberdade2,34. Além disso, demonstramos separadamente feedback sensorial através do uso de nervos periféricos embutidos em enxertos dérmicos, denominados Dermal Sensory Interface (DSI)3,35. Em amputações mais distais, usar essas construções simultaneamente é viável, pois os fáscicos motores e sensoriais dentro do nervo periférico alvo podem ser separados cirurgicamente. No entanto, para amputações de nível mais proximômicos, isso não é viável devido à mistura de fibras motoras e sensoriais. A Interface Nervosa Periférica Regenerativa Composta (C-RPNI) foi desenvolvida para amputações mais proximômicas, e envolve implantar um nervo sensorial misto em uma construção composta por enxerto muscular livre fixado a um segmento de enxerto dérmico(Figura 1). Os nervos periféricos demonstram reinnervação preferencial direcionada, assim as fibras sensoriais reinternarão o enxerto dérmico e as fibras motoras, o enxerto muscular. Essa construção tem, assim, a capacidade de amplificar simultaneamente os sinais motores, proporcionando feedback somatosensorial36 (Figura 2),permitindo a realização da prótese ideal, intuitiva e complexa.

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Protocolo

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Todos os experimentos em animais são realizados a aprovação do Comitê de Uso e Cuidado dos Animais da Universidade de Michigan.

NOTA: Os ratos doadores têm acesso gratuito a alimentos e água antes dos procedimentos de doação de pele e músculos. A eutanásia é realizada anestesia profunda seguida de injeção de cloreto de potássio intra-cardíaco com um método secundário de pneumotórax bilateral. Qualquer variedade de rato pode teoricamente ser utilizada com este experimento; no entanto, nosso laboratório alcançou resultados consistentes em ratos Fischer F344 masculino e feminino (~200-250 g) aos dois a quatro meses de idade. Os ratos doadores devem ser isogênicos para os ratos experimentais.

1. Preparação do enxerto dérmico

  1. Anestesia roube rato doador em uma câmara de indução utilizando uma solução de 5% isoflurane em oxigênio a 0,8-1 L/min. Uma vez anestesiado o rato, retire da câmara de indução e coloque em um cone de nariz rerespirando, reduzindo o isoflurano para 2-2,5% para manutenção da anestesia.
  2. Administre uma solução de 0,02-0,03 mL Carprofen (50 mg/mL) em 0,2 mL de salina estéril subcutânea entre as omoplatas para analgesia.
  3. Aplique a pomada artificial às lágrimas em ambos os olhos para evitar úlceras córneas.
  4. Usando cortadores, raspe todo o retromembro inferior, região do tornozelo e laterais de pata.
  5. Limpe o retromembro escolhido e a superfície plantar da pata com álcool, seguida pela solução iodopovida, terminando com uma limpeza final com álcool para remover iodopovida residual.
  6. Usando uma broca de alta velocidade micro motor portátil com uma pedra de polimento de grão fino removível (4000 rpm), rebarba a superfície plantar da pata para remover a epiderme. Ao rebarba, aplique gotas de salino para não queimar a pele. A derme subjacente terá uma aparência brilhante com sangramento.
  7. Aplique um torniquete à extremidade inferior para retardar o fluxo sanguíneo.
  8. Remova a pele plantar bruscamente com um bisturi #15 e coloque em gaze salina-umedecida para evitar a dessecação. Alguns tecidos tendinosos e conjuntivos serão inerentemente removidos com a pele nesta etapa e serão removidos mais tarde.
  9. Aplique o envoltório de gaze no pé sangrando para retardar a hemorragia. Repita os passos 1.5-1.9 se fizer duas construções.
  10. um microscópio (ampliação de 20x), remova o tecido tendinoso e conjuntivo da camada profunda do enxerto de pele usando micro-tesouras. Tome cuidado para não fazer buracos no enxerto. O enxerto dérmico diluído deve ser ligeiramente opaco contendo apenas derme, medindo aproximadamente 0,5 cm x 1,0cm de tamanho.
  11. Coloque em gaze salina-umedecida até estar pronto para a fabricação de construção C-RPNI. Os enxertos devem ser utilizados dentro de 2 horas após a colheita.

2. Preparação do enxerto muscular

  1. Faça uma incisão longitudinal ao longo do aspecto anterior do retromembro inferior de logo acima do tornozelo para logo abaixo do joelho com um bisturi #15. Dissecaatravés através de tecido subcutâneo para expor a musculatura subjacente.
  2. No aspecto distal da incisão, exponha as inserções tendinosas da musculatura dos membros inferiores. Tibialis anterior (TA) é tipicamente o maior e mais anterior dos músculos, e apenas por baixo e posterior a este músculo está o extensor digitorum longus (EDL). Isolar o tendão distal EDL dos outros tendões da área, tomando cuidado para não incisão de sua inserção neste momento.
  3. Certifique-se de isolamento do tendão correto inserindo ambas as estanas de um fórceps o tendão e exercendo pressão ascendente abrindo os fórceps para causar excursão tendinosa. A manipulação desse tendão deve fazer com que todos os dedos se estendam simultaneamente.
  4. Realize uma tenotomia distal com uma tesoura de íris afiada e separe o músculo dos tecidos circundantes sem rodeios com tenotomias (ou outra tesoura de ponta cega) trabalhando proximamente para encontrar a origem tendinosa.
  5. Uma vez que o tendão proximal é visualizado, novamente realize uma tenotomia utilizando tesouras de íris afiadas. Coloque o enxerto muscular em uma gaze salina-umedecida para evitar a dessecação.
  6. Uma vez que todos os enxertos desejados tenham sido removidos de um rato doador, eutanize principalmente por injeção intra-cardíaca de KCl (1-2 mEq K+/kg) seguida de eutanásia secundária com pneumotórax de punção bilateral com uma lâmina #15.

3. Isolamento e preparação do nervo peroneal comum

  1. Anestesiar e fornecer analgesia ao rato experimental de acordo com o protocolo descrito nas etapas 1.1-1.3.
  2. Raspe a coxa desejada e limpe com álcool, betadine, terminando com álcool para remover vestígios de betadina.
  3. Mova o animal da mesa de preparação cirúrgica para a mesa de microscópio cirúrgico e coloque na plataforma de aquecimento com sonda de temperatura para manutenção da temperatura corporal. Mantenha o isoflurano em 2-2,5% e o oxigênio em 0,8-1 L/min.
  4. Marque a incisão, estendendo-se de apenas distal a entalhe ciático à porção inferior do joelho. Esta marcação deve ser inferior a, e angulou longe do fêmur. Faça a incisão com uma lâmina #15 incisiva através do bíceps femoris fascia subjacente.
  5. Dissecem cuidadosamente através do músculo femoris de femore bíceps com uma micro-tesoura de hemostat ou ponta sem cortes para o espaço subjacente bíceps femoris.
    NOTA: O nervo ciático viaja aproximadamente na mesma direção que a incisão inicial que foi feita. Existem três ramos, tipicamente com nervo sural posterior e nervo peroneal comum e tíbia viajando superficial e profundo para o joelho, respectivamente.
  6. Após a identificação do nervo peroneal comum (CP), usando um par de ceps micro, finos e micro-tesouras, isolar cuidadosamente o nervo CP dos outros ramos ciáticos e remover qualquer tecido conjuntivo persistente distally.
  7. No ponto onde o nervo cruza a superfície do joelho, tranque fortemente o nervo com um par de micro-tesouras.
    NOTA: O uso de tesouras afiadas é extremamente importante nesta etapa, pois causar traumas significativos no nervo poderia aumentar o risco de formação de neuroma.
  8. Liberte cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo restante do nervo CP e trabalhe proximamente para libertar o nervo a um comprimento de aproximadamente 2 cm.

4. Fabricação de construção C-RPNI

  1. Remova o enxerto muscular da gaze salina e remova todo o tecido tendinoso central, bem como um pequeno segmento central de epísio. Deixe as extremidades tendinosas intactas.
  2. Usando um 8-0 Sutura de nylon, proteja o epineúrio da extremidade transseccionada do nervo CP à área do enxerto muscular desprovido de epísium com dois pontos interrompidos em ambos os lados do nervo.
  3. Segure o enxerto muscular no periosteum fêmur com um único ponto de nylon 6-0 interrompido tanto proximal quanto distally com a junção músculo-nervoso voltada para longe do fêmur.
    NOTA: Proteja o músculo para que ele esteja em comprimento relaxado normal. Tente não esticar o músculo significativamente ou deixar muita frouxidão ao garantir.
  4. Coloque um 8-0 Ponto de nylon na margem inferior e central do epísium do enxerto muscular, garantindo-o ao epineúrio nervoso CP de forma a criar frouxidão no nervo dentro do enxerto muscular e ajudar a aliviar qualquer tensão futura a que possa ser exposto com ambulation posterior.
  5. Remova o enxerto de pele da gaze salina e organize-o no enxerto muscular de tal forma a cobrir completamente o nervo e a maioria do músculo. Certifique-se de que a margem profunda da derme está apoiada no músculo. Apare qualquer derme que se estenda além da borda do músculo.
  6. Segure o enxerto de pele ao enxerto muscular circunferentemente usando 8-0 suturas interrompidas de nylon. Normalmente, 4-8 suturas totais são usadas dependendo do tamanho da construção.
  7. Feche o bíceps femoris fascia sobre a construção de forma corrida com sutura cromômica 5-0.
  8. Feche a pele sobreposta com sutura cromômica 4-0 em forma de corrida.
  9. Cotonete a área cirúrgica com uma almofada de álcool e aplique pomada antibiótica.
  10. Cessar anestésico inalational e permitir que os ratos se recuperem com fontes de alimentos e água separadas dos companheiros de gaiola.

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Resultados

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A fabricação de construção é considerada mal sucedida se os ratos desenvolverem uma infecção ou não sobreviverem à anestesia cirúrgica. Pesquisas anteriores indicaram que essas construções requerem aproximadamente três meses para revascularizar e reinnervate2,3,17,36. Após o período de recuperação de três meses, testes de construção podem ser realizados para exa...

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Discussão

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O C-RPNI é uma nova construção que fornece amplificação simultânea dos sinais aférficos motores de um nervo alvo com o fornecimento de feedback sensorial afável. Em particular, o C-RPNI tem utilidade única para aqueles que vivem com amputações proximal, pois seus fascicles motores e sensoriais não podem ser facilmente separados mecanicamente durante a cirurgia. Em vez disso, o C-RPNI utiliza as propriedades inerentes de reineza preferencial do próprio nervo para incentivar a reinneração de fibras sensoriais a órgãos fina...

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Divulgações

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Os autores não têm divulgações.

Agradecimentos

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Os autores desejam agradecer jana Moon por assistência técnica especializada. Os estudos apresentados neste artigo foram financiados por meio de uma subvenção R21 (R21NS104584) à SK.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#15 BisturiAspen Surgical, IncRef 371115Lâminas Cirúrgicas de Aço Carbono com Costelas (#15)
4-0 Sutura CrômicaEthiconSKU# 1654GP-3 Agulha de Corte Reverso
5-0 Sutura CrômicaEthicon SKU# 687GP-3 Agulha de Corte Reverso
6-0 Sutura deEthilon EthiconSKU# 697GP-1 Agulha de Corte Reverso (Sutura de Nylon)
8-0 Sutura de MonofilamentoAROSurgicalT06A08N14-13Sutura de monofilamento de poliamida preta em uma agulha cônica rosqueada
Ratos ExperimentaisEnvigoF344-NH-sdOs ratos são Fischer F344 Strain
Fluriso (Isofluorano)VetOne13985-528-40Micro Motor Anestésico Inalatório
com StoneMasterMechanic Modelo 151369Ferramenta rotativa portátil; o kit vem com várias pedras de grão fino
Gases criogênicosoxigênioUN1072Latas de oxigênio de grau médico padrão
Cloretode potássio APP Pharmaceuticals63323-965-20Forma injetável, 2 mEq/mL
Iodopovidona USPMediChoice65517-0009-1Solução tópica de 10%, pode usar um frasco para várias preparações cirúrgicas
Pomada Oftálmica Puralube VetDechra17033-211-38Pomada protetora da córnea para uso durante o procedimento
Rimadyl (Caprofeno)Zoetis, Inc.NADA# 141-199Forma injetável, 50 mg/mL
Microscópio EstéreoLeicaModelo M60O usuário pode ajustar a ampliação de acordo com sua preferência
Instrumentos CirúrgicosFerramentas de Ciências FinasVáriosO usuário pode escolher instrumentos de acordo com a preferência pessoal ou do que está atualmente disponível em seu laboratório
Pomada Antibiótica TriplaMediChoice39892-0830-2A pomada vem em pacotes estéreis e descartáveis
VaporStick 3SurgivetV7015Torre de anestesia com espaço para isofluorano e cilindro de oxigênio
Webcol Alcohol PrepCovidenRef 6818Toalhetes de preparação de álcool; use um novo lenço para cada preparação
Broca de Alta Velocidade de

Referências

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