Síntese de Nanopartículas Magnéticas Funcionalizadas, Sua Conjugação com a Feroxamina Siderophore e sua Avaliação para Detecção de Bactérias

Resumo

Este trabalho descreve protocolos para a preparação de nanopartículas magnéticas, seu revestimento com SiO_2,seguido por sua funcionalização de amina com (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) e sua conjugação com deferoxamina usando uma moiety de succinil como linker. Uma descrição profunda da caracterização estrutural e um ensaio de bactérias de captura usando Y. enterocolitica para todas as nanopartículas intermediárias e o conjugado final também são descritos em detalhes.

Resumo

No presente trabalho, a síntese de nanopartículas magnéticas, seu revestimento com SiO_2,seguido de sua funcionalização amina com (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e sua conjugação com deferoxamina, um siderophore reconhecido por Yersinia enterocolitica,usando um moiety de succinyl como linker são descritos.

As nanopartículas magnéticas (MNP) de magnetita (Fe₃O₄) foram preparadas pelo método solvothermal e revestidas com SiO₂ (MNP@SiO₂) utilizando o processo stöber seguido de funcionalização com APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Em seguida, a feroxamina foi conjugada com o MNP@SiO₂@NH₂ por acoplamento de carbodiimídeo para dar MNP@SiO₂@NH₂@Fa. A morfologia e as propriedades dos conjugados e intermediários foram examinadas por oito métodos diferentes, incluindo difração de raios-X em pó (XRD), espectroscopia infravermelha de transformação fourier (FT-IR), espectroscopia de Raman, espectroscopia fotoeletrântrica de raios-X (XPS), microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e mapeamento de raios-X dispersivos de energia (EDX). Essa caracterização exaustiva confirmou a formação do conjugado. Finalmente, para avaliar a capacidade e especificidade das nanopartículas, elas foram testadas em um ensaio de bactérias de captura utilizando Yersinia enterocolitica.

Introdução

Os métodos de detecção de bactérias que utilizam MNP baseiam-se no reconhecimento molecular de anticorpos, aptamers, bioproteínas, carboidratos conjugados ao MNP pela bactéria patogênica¹. Levando-se em conta que os siderophores são reconhecidos por receptores específicos na membrana externa das bactérias, eles também podem estar ligados ao MNP para aumentar sua especificidade². Siderophores são pequenas moléculas orgânicas envolvidas na absorção do Fe³⁺ por bactérias^3,4. A preparação de conjugados entre siderophores e MNP, juntamente com sua avaliação para a captura e isolamento de bactérias ainda não foi relatada.

Um dos passos cruciais na síntese de conjugados de nanopartículas magnéticas com pequenas moléculas é a seleção do tipo de ligação ou interação entre eles para garantir que a pequena molécula seja anexada à superfície do MNP. Por essa razão, o procedimento para preparar o conjugado entre nanopartículas magnéticas e feroxamina — o siderophore reconhecido pela Yersinia enterocolitica— foi focado na geração de uma superfície modificável do MNP para permitir ligá-lo covalentemente ao siderophore pela química de carbodiimídeo. A fim de obter uma nanopartículas magnetita uniforme (MNP) e melhorar a nucleação e controle de tamanho, uma reação de solvolise com álcool benzílico foi transportada em um bloco térmico sem tremer⁵. Em seguida, um revestimento de sílica foi gerado pelo método Stöber para conferir proteção e melhorar a estabilidade da suspensão das nanopartículas na mídia aquosa⁶. Levando-se em conta a estrutura da feroxamina, a introdução de grupos de amina é necessária para produzir nanopartículas adequadas (MNP@SiO₂@NH₂) a serem conjugadas com o siderophore. Isso foi conseguido por condensação de (3-aminopropil)triethoxysilano (APTES) com os grupos de álcool presentes na superfície das nanopartículas modificadas de sílica (MNP@SiO₂) utilizando um método sol-gel⁷.

Paralelamente, o complexo de ferro feroxamina (III) foi preparado pela complexidade da deferoxamina comercialmente disponível com acetonato de acetil de ferro em solução aquosa. N-succinylferoxamina, com grupos de succinil que atuarão como eloers, foi obtido pela reação de feroxamina com anidrido succinico.

A conjugação entre MNP@SiO₂@NH₂ e N-succinylferoxamine para dar MNP@SiO₂@NH_@Fa foi realizada através da química de carbodiícida usando como reagentes de acoplamento benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfônio hexafluorophosphate (BOP) e 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) em uma mídia básica suave para ativar o grupo ácido terminal em N-succinylferoxamina⁸.

Uma vez caracterizados os MNPs, avaliamos as capacidades de nanopartículas magnéticas nuas e funcionalizadas para capturar o tipo selvagem (WC-A) e um mutante de Y. enterocolitica sem receptor de feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). MNPs simples, MNPs funcionalizados e os MNP@SiO_{conjugados 2}@NH_@Fa foram autorizados a interagir com cada cepa Y. enterocolitica. Os agregados de bactérias conjugadas foram separados da suspensão das bactérias pela aplicação de um campo magnético. Os agregados separados foram enxaguados duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), re-suspenso na PBS para preparar diluições seriais e, em seguida, foram banhados para contagem de colônias. Este protocolo demonstra cada passo da síntese de MNP@SiO₂@NH@Fa, a caracterização estrutural de todos os intermediários e do conjugado, e um ensaio de captura de bactérias como uma forma fácil de avaliar a especificidade do conjugado em relação aos intermediários. ⁹

Protocolo

NOTA: Para as reações realizadas em condições de atmosfera inerte, todos os vidros foram previamente secos em um forno a 65 °C, selados com um septo de borracha e purgados com argônio três vezes.

1. Síntese de nanopartículas magnéticas conjugadas com feroxamina

1. Síntese de Nanopartículas magnéticas Fe₃O₄ (MNPs)
   1. Adicione 0,5 g de Fe(acac)₃ em um frasco de vidro de 20 mL e depois misture com 10 mL de álcool benzílico.
   2. Sonicar esta mistura por 2 minutos, depois transfira para um bloco de aquecimento e aqueça a 180 °C por 72 h.
   3. Depois que a reação for concluída, deixe os frascos esfriarem, enxágue as nanopartículas com 96% de etanol e centrífuga a 4000 x g por 30 minutos. Repita a centrifugação pelo menos duas vezes.
   4. Separe as nanopartículas do supernante por atração magnética usando um ímã de neodímio (NdFeB) e descarte o solvente residual.
   5. Enxágüe com 96% de etanol repetindo passo 1.1.4. e descarte o supernatante alternando com sônica em um banho por 1 min a 40 kHz até que o solvente pareça claro.
2. Revestimento de nanopartículas magnéticas SiO₂ (MNP@SiO₂)
   1. Prepare uma suspensão de 2 g de MNP em 80 mL de isopropanol e, em seguida, adicione 4 mL de amônia de 21%, 7,5 mL de água destilada e 0,56 mL de ortossilicato de tetraetila (TEOS) (nesta ordem) em um frasco de fundo redondo com uma barra de agitação magnética.
   2. Aqueça a mistura a 40 °C por 2h com agitação contínua e depois sonicar por 1h.
   3. Separe o MNP com um ímã, descarte o supernasce e disperse-o em 30 mL de isopropanol.
   4. Repita as etapas 1.2.1. e 1.2.2.
   5. Retire e lave a barra de agitação magnética com 96% de etanol para recuperar todo o material.
   6. Separe as nanopartículas do supernante por atração magnética usando um ímã.
   7. Descarte o supernaspeuta e enxágue as nanopartículas com 96% de etanol três vezes alternadamente com sônica.
   8. Seque as nanopartículas sob vácuo à temperatura ambiente por 12 h.
3. Funcionalização de MNP@SiO₂ com (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES)
   1. Enxágüe 500 mgs do MNP@SiO₂ obtidos da etapa anterior com N-dimetilformamida (DMF) em atmosfera inerte e depois sonicate por 1 min a 40 kHz. Em seguida, descarte o supernaspe e repita esse processo três vezes.
   2. Suspenda as partículas em um frasco fundo redondo, em mexer com uma barra de agitação magnética e adicione 9 mL de APTES.
   3. Mexa a mistura a 60 °C por 12 h.
   4. Descarte o supernaspeuta e enxágue as nanopartículas com 96% de etanol três vezes alternadamente com sônica.
4. Síntese de feroxamina
   1. Dissolver 100 mgs (0,15 mmol) de sal mesilto deferoxamina e 53,0 mgs (0,15 mmol) de Fe(acac)₃ em 5 mL de água destilada e agitar a mistura durante a noite à temperatura ambiente.
   2. Lave o produto resultante três vezes com 20 mL de EtOAc em um funil de separação e, em seguida, remova o solvente orgânico sob vácuo usando um evaporador rotativo.
   3. Congele a fase aquosa para permitir a feroxamina como um sólido vermelho.
5. Síntese de NN-succinylferoxamina
   1. Adicione 350 mg (3,50 mmol) de anidrido succininico a uma solução de 100 mgs (0,17 mmol) de feroxamina em 5 mL de piridina em um frasco redondo de fundo redondo de 50 mL sob atmosfera inerte.
   2. Mexa a mistura resultante à temperatura ambiente por 16 h. Após esse tempo, remova o excesso de piridina sob pressão reduzida em um evaporador rotativo para dar um sólido vermelho escuro.
   3. Dissolva a reação bruta em 3 mL de metanol.
   4. Transfira a solução metodólica em uma coluna Sephadex (20 cm de Sephadex em uma coluna de 20 mm de diâmetro) e elute a 0,5 mL/min.
   5. Colete a fração vermelha e remova o metanol sob vácuo usando um evaporador rotativo.
6. Síntese do conjugado MNP@SiO₂@NH@Fa
   1. Enxágüe 30 mg de MNP@SiO_{seco 2}@NH 2 duas_vezes com DMF e sonicar as nanopartículas em um frasco de 100 mL Erlenmeyer por 30 minutos sob atmosfera inerte.
   2. Prepare uma solução de N-succinylferoxamine (200 mgs, 0,30 mmol), benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfônio hexafluorofosfato (BOP, 173 mgs, 0,45 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 46 mgs, 0,39 mmol) e N,N-diisopropylethylamina (DIPEA, 128,8 mgs, 1,21 mmol) em 10 mL de DMF (Mix A) em um flaskert de fundo redondo de 50 mL sob atmosfera inserção.
   3. Suspenda o MNP@SiO anteriormente enxaguado₂@NH₂ em 3 mL de DMF sob sônica em condições secas sob condições livres de oxigênio usando uma atmosfera de gás argônio (Mix B).
   4. Adicione a mistura A para misturar B dropwise.
   5. Agite a mistura final usando um agitador orbital à temperatura ambiente durante a noite.
   6. Separe o conjugado resultante (MNP@SiO₂@NH@Fa) da suspensão usando um ímã.
   7. Enxágüe o sólido resultante e, em seguida, sonicate-lo cinco vezes com 10 mL de etanol.
   8. Seque o sólido sob vácuo por 24 h.

2. Ensaio bacteriano com cepas enterocoliticas de Y. para quantificar a captura de bactérias patogênicas com nanopartículas

1. Prepare a suspensão de todas as nanopartículas intermediárias e o conjugado final em PBS a 1 mg/mL em tubos estéreis de 2 mL.
2. Prepare uma cultura de Y. enterocolitica em 5 mL de caldo de Luria Bertani (LB) durante a noite incubando a 37 °C.
3. Prepare um caldo de soja tripptic deficiente de ferro (TSB) adicionando 50 μL de 10 mM 2,2′-bipyridyl.
4. Inocular os 5 mL de TSB deficiente de ferro com 50 μL da cultura pernoite de Y. enterocolitica e, em seguida, incubar a 37 °C com agitação até que um OD₆₀₀ = 0,5\u20120.8 seja atingido.
5. Tome 100 μL da cultura obtida na etapa 2.4 e dilua em um tubo de 2,0 mL contendo 900 μL de PBS para obter uma primeira diluição de 1/10. Em seguida, prepare uma diluição de 1/100 da primeira diluição usando o mesmo procedimento para obter uma concentração de células bacterianas em 1 x 10⁶ Unidades de Formação de Colônias (UFC)/mL aproximadamente.
6. Adicione 100 μL de suspensão de nanopartículas a 1 mg/mL a 1 mL da diluição de 1/100 da suspensão bacteriana em um tubo de 2,0 mL e homogeneize com vórtice.
7. Incubar a cultura a 20 °C por 1 h.
8. Separe os agregados MNP/bactéria usando um ímã e descarte cuidadosamente o supernasce.
9. Enxágüe as nanopartículas separadas duas vezes com 1 mL PBS usando um vórtice.
10. Suspenda as nanopartículas em 1 mL de PBS para contar a quantidade de captura bacteriana em UFC/mL.
11. Prepare quatro diluições consecutivas de 1/10 da suspensão anterior até que uma diluição de 1 x^{10 -4} seja alcançada.
12. Placa 10 μL de cada diluição em placas de ágar TS e incuba-as a 37 °C durante a noite.
13. Fotografe a placa com um digitalizador de gel no modo epi branco. Processe a imagem com um software apropriado para amplificar um local para contar o número de colônias individuais.
    NOTA: Cada intermediário MNP foi caracterizado para acompanhar o andamento da síntese. Em primeiro lugar, os MNPs nus foram estudados pela XRD para verificar a estrutura cristalina. Em seguida, o espectro FT-IR de cada intermediário foi executado para verificar as alterações ocorridas na reação correspondente. A análise da espectroscopia de Raman de cada intermediário também foi realizada para confirmar as conclusões deduzidas dos espectros FT-IR. A análise da TGA nos permitiu estimar o peso de perda dos intermediários portadores de material orgânico em sua estrutura. A morfologia e o tamanho de cada intermediário foram estudados pelo TEM. Finalmente, a análise da XPS foi fundamental para determinar os estados de oxidação do átomo em cada superfície intermediária de MNP e confirmar a formação de vínculo covalente no conjugado MNP@SiO₂@NH@Fa.

Resultados

Uma caracterização estrutural exaustiva é realizada a fim de determinar a morfologia e as propriedades de cada intermediário e o conjugado final. Para isso, as técnicas XRD, FT-IR, Raman spectroscopia, TGA, TEM, mapeamento EDX e XPS são utilizadas para demonstrar a formação do conjugado. Os estados de oxidação dos átomos na superfície das nanopartículas adquiridas pela espectroscopia de fotoeletrões de raios-X (XPS) são os dados mais relevantes para confirmar a formação de ligações covalentes entre a nanopartícula e o si...

Discussão

Este protocolo descreve a síntese de um conjugado entre nanopartículas magnéticas e feroxamina siderophore por ligação covalente. A síntese de magnetita foi realizada utilizando-se o protocolo relatado por Pinna et al.⁵ seguido de revestimento de sílica para proteger o núcleo magnético da corrosão em sistemas aquosos, minimizar a agregação e fornecer uma superfície adequada para a funcionalização⁶. O processo de revestimento de sílica foi modificado. Em vez de realizar três...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-Hidroxibenzotriazol hidrato HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipiridil	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropiltrietoxissilano 99%	Acros	151081000
Solução de hidróxido de amônio 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)-fosfônio hexafluorofosfato BOP Reagente	Acros	209800050
Álcool benzílico	Sigma Aldrich	822259
Sal de mesilato de desferroxamina >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Etanol anidro, 96%	Panreac	131085
Acetato de etila, Extra Puro, SLR, Fisher Chemical
Acetilacetonato de ferro (III) 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Caldo (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N, N-Diisopropiletilamina, 99,5 +%, AcroSeal	Acros	459591000
N, N-Dimetilformamida, 99,8%, Extra Seco, AcroSeal	Acros	326871000
Piridina, 99,5%, Extra Seco, AcroSeal	Acros
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Anidrido succínico >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraetila ortossólica >99,0%	Sigma Aldrich	86578