Artigo de método

Painel LC-MS/MS validado para quantificar 11 medicamentos resistentes a medicamentos para tuberculose em amostras de cabelos pequenos

DOI:

10.3791/60861

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19 de maio de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os métodos atuais de análise da adesão dos pacientes a regimes complexos de tuberculose resistente a medicamentos (DR-TB) podem ser imprecisos e intensivos em recursos. Nosso método analisa o cabelo, uma matriz facilmente coletada e armazenada, para concentrações de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar níveis de drogas de sub-nanogramas que podem ser utilizados para entender melhor a adesão aos medicamentos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A tuberculose resistente a medicamentos (DR-TB) é uma ameaça crescente à saúde pública, e a avaliação dos níveis de medicamentos terapêuticos pode ter importantes benefícios clínicos. Os níveis de drogas plasmáticas são a avaliação padrão-ouro atual, mas requerem flebotomia e uma cadeia fria, e capturam apenas a adesão muito recente. Nosso método utiliza o cabelo, uma matriz que é facilmente coletada e reflexo da adesão a longo prazo, para testar 11 medicamentos anti-TB. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostram que os níveis de drogas antirretrovirais nos cabelos estão associados aos desfechos do HIV. Nosso método para drogas DR-TB utiliza 2 mg de cabelo (3 cm proximal à raiz), que é pulverizado e extraído em metanol. As amostras são analisadas com um único método LC-MS/MS, quantificando 11 medicamentos em um período de 16 minutos. Os limites mais baixos de quantificação (LLOQs) para os 11 fármacos variam de 0,01 ng/mg a 1 ng/mg. A presença de drogas é confirmada comparando-se as razões de duas transições de espectrometria de massa. As amostras são quantificadas usando a proporção da droga para o iotopologue de droga denominado, 15N-, ou 13C-labeled. Utilizou-se uma curva de calibração variando de 0,001-100 ng/mg. A aplicação do método a uma amostra de conveniência de amostras de cabelo coletadas de pacientes com DR-TB em terapia diretamente observada (DOT) indicou níveis de fármacos no cabelo dentro da faixa dinâmica linear de nove das onze drogas (isoniazida, pirazinamida, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimina, bedaquiline, pretomanid). Nenhum paciente estava em prothionamida, e os níveis medidos de ethionamida estavam próximos de seu LLOQ (com trabalho suplementar, examinando a adequação do metabólito da ethionamida para a exposição ao monitoramento). Em resumo, descrevemos o desenvolvimento de um painel multi-anilte para medicamentos DR-TB no cabelo como uma técnica de monitoramento de drogas terapêuticas durante o tratamento de TB resistente a medicamentos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No século XXI, a TB resistente a medicamentos (DR-TB) é uma catástrofe em evolução para programas de controle nacional de TB já fracos, com casos confirmados dobrando apenas nos últimos 5 anos, representando quase um terço de todas as mortes relacionadas à resistência antimicrobiana globalmente1,2. O tratamento bem-sucedido da TB-DR tem exigido convencionalmente regimes de segunda linha mais longos e tóxicos do que o tratamento para a TB sensível a medicamentos. Além disso, os pacientes com TB-DR frequentemente têm desafios pré-existentes significativos para a adesão, o que contribuiu para o surgimento da resistência inicialmente3.

Ao contrário da infecção pelo HIV, onde as cargas virais podem ser usadas para monitorar o tratamento, os pontos finais substitutos da resposta ao tratamento em TB são atrasados e não são confiáveis em um nível individual4. O monitoramento da adesão do paciente, um importante preditor da concentração de medicamentos anti-TB subterapêuticos e falha no tratamento, também é desafiador. A adesão autorreferida sofre de viés de recall e o desejo de agradar aos provedores5,6. A contagem de comprimidos e os sistemas de monitoramento de eventos medicamentosos (MEMS) podem ser mais objetivos7, mas não medem o consumo real de drogas8,,9,10. Os níveis de medicamentos em biomatrices podem fornecer dados de adesão e farmacocinética. Portanto, os níveis de fárres plasmáticos são comumente utilizados no monitoramento de drogas terapêuticas11,12. No contexto do monitoramento da adesão a medicamentos, no entanto, os níveis plasmáticos representam exposição a curto prazo e são limitados por significativa variabilidade intra e interpaciente ao determinar a faixa de referência de adesão adequada. Os efeitos do "jaleco branco", onde a adesão melhora antes das visitas clínicas ou de estudo, complicam ainda mais a capacidade dos níveis plasmáticos de fornecer padrões precisos de adesão a medicamentos13.

O cabelo é uma biomatriz alternativa que pode medir a exposição a medicamentos a longo prazo14,15. Muitas drogas e metabólitos endógenos incorporam-se à matriz proteica capilar da circulação sistêmica à medida que o cabelo cresce. Como esse processo dinâmico continua durante o crescimento capilar, a quantidade de droga depositada na matriz capilar depende da presença contínua da droga em circulação, tornando o cabelo uma excelente leitura temporal da ingestão de drogas. O cabelo como biomatriz tem a vantagem adicional de ser facilmente coletado sem a necessidade de cadeia fria para armazenamento e expedição em comparação com o sangue. Além disso, o cabelo não é bioperigoso, o que proporciona vantagens adicionais de viabilidade no campo.

Os níveis de drogas capilares têm sido usados há muito tempo em aplicações forenses16. Na última década, os níveis de antirretroviral capilar (ARV) demonstraram utilidade na avaliação da adesão de medicamentos no tratamento e prevenção do HIV, para os quais nosso grupo contribuiu. Os níveis de ARV nos cabelos têm se mostrado os mais fortes preditores independentes dos desfechos de tratamento na infecção pelo HIV17,18,19,20,21. Para determinar se os níveis de cabelo dos pacientes com TB-DR terão a mesma utilidade na previsão do resultado do tratamento, utilizou-se o LC-MS/MS para desenvolver e validar um método para analisar 11 medicamentos DR-TB em pequenas amostras de cabelo. Como avaliação inicial do desempenho do ensaio, medimos os níveis de medicamentos DR-TB em uma amostra de conveniência de pacientes com TB-DR recebendo terapia observada diretamente (DOT) no Cabo Ocidental, África do Sul22.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito antes da coleta de amostras de cabelo. Obtivemos a aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Cidade do Cabo e da Universidade da Califórnia, Em São Francisco.

1. Amostragem de cabelo

  1. Obter consentimento informado por escrito.
  2. Use uma tesoura limpa para cortar aproximadamente 20-30 fios de cabelo do couro cabeludo da região occipital o mais próximo possível do couro cabeludo.
  3. Coloque a fita ao redor do lado distal do cabelo para indicar direcionalidade. Dobre a amostra de cabelo em um quadrado de folha de alumínio e armazene à temperatura ambiente. Rotular a extremidade distal do cabelo para evitar uma possível contaminação devido ao manuseio adicional da extremidade proximal.
  4. Além das amostras dos pacientes, coletar "cabelo em branco": uma amostra de cabelo do couro cabeludo de alguém que não tomou medicação para tuberculose. Coletar uma grande quantidade (>30 mg de cabelo em branco para cada 20 amostras de pacientes).

2. Extração de drogas

  1. Etiquetar tubos de tala. Cada amostra do paciente requer um tubo. Etiqueta 12 tubos de "C0" a "C11", um para cada um dos 12 pontos de calibração. Rotular um tubo para baixo controle de qualidade, um tubo para controle de qualidade média e um tubo para controle de alta qualidade. Por último, rotule um tubo para Matrix Blank.
  2. Abra o quadrado de folha de alumínio contendo amostra de cabelo. Se a amostra de cabelo for maior que 3 cm, corte o cabelo a 3 cm da extremidade proximal e use essa porção proximal para análise.
  3. Pesar 2 mg da amostra de cabelo em um tubo de conta.
  4. Pesar 2 mg de cabelo em branco em 16 tubos de talva adicionais. Estes serão usados como pontos de calibração, controles de qualidade e matriz em branco. Os tubos seguirão o mesmo procedimento de extração das amostras do paciente, além de serem cravados com padrões de referência de medicamentos nos níveis indicados nas etapas 2.8 e 2.9.
  5. Coloque todos os tubos de contas no homogeneizador. Executar homogeneizador a velocidade de 6,95 m/s. Executar para dois ciclos de 30 s cada, com um período de descanso de 15 s entre os dois ciclos.
  6. Faça uma mistura padrão interna e adicione-a às amostras.
    1. Adicione ~40 mL de metanol a um frasco volumétrica de 50 mL.
    2. Em frascos de vidro âmbar, faça as misturas das normas internas indicadas na Tabela 1, utilizando o metanol como solvente.
      NOTA: O metanol é muito volátil. Deixe todos os frascos tampados durante este processo para evitar perdas devido à evaporação.
    3. A partir dessas misturas, adicione o volume mostrado na Tabela 1 ao frasco volumétrica de 50 mL. Em seguida, encha o frasco a 50 mL com metanol.
    4. Tampe e misture o frasco volumétrica. Adicione 500 μL da mistura a cada um dos tubos de cabelo pulverizados, exceto o tubo em branco da matriz. Adicione 500 μL de metanol ao tubo em branco da matriz.
  7. Faça misturas padrão de referência.
    1. Constituem padrões de referência puros dos seguintes medicamentos com metanol para obter a concentração mostrada na tabela na etapa 2.7.2. Apenas 1 mL das seguintes concentrações é necessário.
    2. Adicione 1768 μL de metanol a um frasco e, em seguida, adicione as quantidades de padrão de referência listadas na Tabela 2 ao mesmo frasco para obter 2 mL volume final. Rotular este frasco "Ref Std Mix 1x". Vórtice.
    3. Espeto 100 μL de "Ref Std Mix 1x" em 900 μL de metanol em um novo frasco. Rotular este frasco "Ref Std Mix 10x". Vórtice.
    4. Espeto 100 μL de "Ref Std Mix 10x" em 900 μL de metanol em um novo frasco. Rotular este frasco "Ref Std Mix 100x". Vórtice.
    5. Espeto 100 μL de "Ref Std Mix 100x" em 900 μL de metanol em um novo frasco. Rotular este frasco "Ref Std Mix 1000x". Vórtice.
  8. Espete os tubos da curva de calibração adicionando a quantidade de Ref Std Mix descrita na Tabela 3.
  9. Crie misturas de QC e espigão tubos de controle de qualidade.
    1. Etiqueta 5 frascos "QC-A" através de "QC-E".
    2. Adicione as seguintes quantidades de metanol aos cinco frascos rotulados:
      QC-A: 990 μL
      QC-B: 940 μL
      QC-C: 950 μL
      QC-D: 980 μL
      QC-E: 950 μL
       
    3. Utilizando os estoques de medicamentos de 1 mg/mL criados na etapa 2.7.1, adicione 10 μL aos frascos específicos listados abaixo. Para as ações BDQ e CLF, que estão a 0,5 mg/mL, adicione 20 μL aos frascos listados abaixo.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      NOTA: Algumas drogas estão presentes em múltiplas misturas.
    4. Rotular um frasco como "QC-A df100". Diluir 10 μL de QC-A em 990 μL de metanol.
    5. Rotular um frasco como "Baixo estoque qc". Adicione 1832 μL de metanol a este frasco. Adicione as quantidades de misturas de QC detalhadas abaixo:
      QC-A df100: 80 μL
      QC-B: 8 μL
      QC-C: 80 μL
       
    6. Rotular um frasco como "Mid QC stock". Adicione 760 μL de metanol a este frasco. Adicione as quantidades de misturas de QC detalhadas abaixo:
      QC-A df100: 800 μL
      QC-B: 40 μL
      QC-C: 400 μL
       
    7. Rotular um frasco como "Alto estoque de QC". Adicione 1376 μL de metanol a este frasco. Adicione as quantidades de misturas de QC detalhadas abaixo:
      QC-D: 160 μL
      QC-E: 320 μL
      MFX, 1mg/mL stock: 16 μL
      INH, 1mg/mL estoque: 32 μL
      LFX, 1mg/mL stock: 32 μL
      LZD, 1mg/mL estoque: 32 μL
      PZA, 1mg/mL estoque: 32 μL
       
    8. Espeto de 10 μL Baixo QC no tubo de conta Low QC.
    9. Espeto de 10 μL Mid QC no tubo de conta do QC médio.
    10. Espeto de 10 μL alto QC no tubo de conta high QC.
  10. Coloque todos os tubos em agitador quente por 2 h a 37 °C. O tremor deve ser lento o suficiente para que a água não espirre nos tubos.
  11. Remova os tubos do agitador. Transfira o líquido dos tubos de esfera saque para novos tubos de microcentrífuga. Rotule esses tubos de microcentrifuge da mesma forma.
  12. Adicione 500 μL de metanol aos tubos antigos. Tampa e vórtice.
  13. Pela segunda vez, transfira o líquido dos tubos de esfera para o tubo de microcentrífuga correspondente. Não há problema em transferir cabelo pulverizado. Isso acabará por ser centrifugado.
  14. Centrifugação dos tubos de microcentrífuga por 10 min a 2.800 x g.
  15. Remova cuidadosamente o líquido e transfira-o para novos tubos de centrífuga com etiquetas correspondentes. Tenha cuidado para não perturbar ou transferir a pelota de cabelo.
  16. Evaporar o líquido nos tubos de centrífuga até secar a 32 °C.
  17. Reconstituir as amostras adicionando 200 μL de fase Móvel A (água de grau HPLC com ácido fórmico de 1%) aos tubos secos. Vórtice.
  18. Transfira o líquido para frascos âmbar com inserções de 250 μL.

3. Preparação lc-MS/MS

  1. Faça um litro de fase Móvel A (água de grau HPLC com 1% de ácido fórmico) adicionando um pouco de água de grau HPLC a um frasco volulítico de um litro. Em seguida, adicione 10 mL de >95% de ácido fórmico a esse frasco e, em seguida, encha a linha com água de grau HPLC.
    1. Faça um litro de fase Móvel B (acetonitrilo com 0,1% de ácido fórmico) adicionando um pouco de acetonitrilo a um frasco volumétrica de um litro. Em seguida, adicione 1 mL de >95% de ácido fórmico a esse frasco e, em seguida, encha a linha com acetonitrilo.
  2. Instale uma coluna de 2 x 100 mm com tamanho de partícula de 2,5 μm e tamanho de poros de 100 Å com contas de fenil com teto polar, ligadas ao éter totalmente feitas de sílica porosa no compartimento da coluna. Certifique-se de que a coluna também tem o cartucho de proteção recomendado pelo fabricante instalado.
  3. Abra o software de aquisição de dados e clique duas vezes em Configuração de hardware. Destaque LCMS e clique em Ativar perfil.
    1. Clique em Novo subprojetoou, se outros subprojetos já existirem, clique em Copiar subprojeto. Nomeie o subprojeto.
    2. Clique em Novo Documento. Duplo clique no método de aquisição. Clique em Especificação de Massa na janela método de aquisição.
    3. Alterar a isto de tipo de varredura para MRM (MRM). Certifique-se de que a Polarity está definida como Positiva.
    4. Clique em Lista de Importação e selecione o método MDR-TB LCMS do arquivo .csv transições.csv que está incluído em Materiais Suplementares.
    5. Role para baixo e defina a duração para 16.751 min. O tempo de ciclo e o número adequados de ciclos serão preenchidos automaticamente.
    6. Na barra lateral esquerda, clique em Válvula Valco Integrada. Certifique-se de que o nome da posição para o passo 0 é A. Na coluna Tempo Total (min), digite 0,4 na primeira linha e 13 na segunda linha.
    7. Na coluna Posição, defina a linha 1 para B e a linha dois para A.
    8. Na barra lateral esquerda, clique em Bomba Binária. Defina a tabela de gradiente e taxa de fluxo de acordo com a Tabela 4.
    9. Na barra lateral esquerda, clique em Autosampler. Alterar o volume da injeção para 10 μL. Clique no controle de temperatura ativado e defina para 4 °C.
    10. Na barra lateral esquerda, clique em Coluna Compartimento. Coloque as temperaturas direita e esquerda para 50 °C.
    11. Feche e salve o método.
  4. Criar lote clicando em Novo Documento e selecionando O Lote de Aquisição. Digite um nome definido e selecione o método recém-criado na barra de isto.
    1. Em uma planilha, crie um lote que segue esta ordem: curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração, controles de qualidade. Adicione injeções em branco solvente no início e no final da corrida, bem como antes e depois da curva de calibração, controles de qualidade e amostras de pacientes. Coloque pelo menos oito injeções em branco solvente após injeções da curva de calibração e frasco de controle de alta qualidade, a fim de reduzir o câmbio de analyte.
      NOTA: Mais injeções em branco de solvente podem precisar ser adicionadas dependendo da idade da coluna.
    2. Na coluna adjacente aos nomes da amostra, digite a posição de amostrador apropriado para o frasco correspondente.
    3. Clique em Adicionar conjunto. Na janela pop-up, digite o número de amostras no lote.
    4. Copie e cole nomes de amostras e locais de frascos da planilha para o lote recém-criado.
    5. Vá para a guia Enviar. Clique em Enviar botão.
  5. Equilibre o sistema inserindo a linha A de solvente na fase Móvel A e na linha B do solvente na fase Móvel B. Abra a válvula de purga na bomba binária.
    1. Coloque a composição do solvente em 50% B a 4 mL/min de fluxo. Ligue a bomba binária.
    2. Após 5 min, diminua o fluxo para 0,3 mL/min. Feche a válvula de purga. Verifique se há vazamentos.
    3. No software, pressione Equilibre na barra de ferramentas superior. Definir o tempo para >5 min, pressione OK.
    4. Depois que o instrumento tiver se equilibrado, os módulos no canto inferior direito da janela aparecerão verdes. Verifique se a pressão estabilizou e, em seguida, inicie o lote clicando em Iniciar amostra.

4. Análise de dados

  1. Depois que o lote estiver concluído, abra o software de quantificar. Clique no ícone de varinha para criar uma nova tabela resultados.
    1. Clique em Procurar para navegar até a pasta apropriada e, em seguida, destacar o arquivo de dados e clique na seta de apontar para o botão direito do mouse para mover os dados para a área Selecionada. Clique em Next.
    2. Selecione Criar novo método e clique em Novo. Insira o nome do novo método de quantitação e pressione Salvar e, em seguida, Next.
    3. Selecione a primeira injeção do ponto de calibração do meio. Pressione Next.
    4. Marcar todas as transições das normas internas na coluna IS.
    5. Para as transições de quantificador para as normas de referência, selecione o IS correspondente na coluna NOME IS. Clique em Next.
    6. Role as transições para garantir que o tempo de retenção selecionado automaticamente seja preciso. Certifique-se de que a suavização gaussiana está definida como 1,5. Todas as outras configurações padrão podem permanecer como estão (ou seja, Porcentagem de ruído 100%, Sub linha de base. Janela 2.00 min, Pico Dividindo 2 pontos).
      NOTA: Se quiser, modifique os parâmetros de integração automática neste momento. Uma vez que esses parâmetros mudam com base na configuração do instrumento, não incluímos o nosso aqui.
    7. Clique em Concluir para aplicar o método de quantitação ao lote.
  2. Clique no canto superior esquerdo Exibe o botão de revisão de pico para exibir cromatogramas. Navegue pelas transições usando a barra lateral esquerda. Role cada injeção de cada transição de quantificador e integre manualmente o pico correto, se necessário.
    1. Para integrar manualmente um pico, clique no botão Ativar o modo de integração manual, dê zoom no cromatograma clicando e arrastando ao longo do eixo x ou y e, em seguida, desenhe uma linha de uma linha de base para a outra linha de base, definindo o pico. A Figura 3 apresenta dois cromatogramas: um que tem INH e, portanto, foi integrado manualmente, e outro que não possui INH.
      NOTA: Todas as injeções devem ser integradas usando os mesmos parâmetros. A largura máxima pode fornecer uma diretriz para aadesão a esses parâmetros, mas às vezes a largura do pico difere. Para quantificar um pico, o tempo de retenção deve estar dentro de ±0,15 min do tempo de retenção esperado para esse análdio (conforme definido pelos picos padrão de referência), qualitativamente confirmado como tendo a razão de quantificador esperado para o qualificador (como mostrado na Figura 2),e ter uma razão sinal-ruído maior que 10.
  3. Na coluna Tipo de amostra, defina as injeções da curva de calibração (com exceção das injeções da curva de calibração em branco) para Padrão. Defina as injeções de controle de qualidade para controle de qualidade. Deixe as injeções restantes como desconhecidas.
    NOTA: Isso será definido em todas as transições.
  4. Na coluna Concentração Real, digite as concentrações encontradas na Tabela 5 para todas as injeções de curva de calibração e controle de qualidade.
  5. Clique no segundo do canto superior esquerdo Exibe o botão de curva de calibração. Clique no botão Regressão.
  6. Definir tipo de ponderação para 1/x e pressionar OK.
  7. Valide a curva de calibração e as amostras de controle de qualidade para garantir que o lote tenha sido aplicado com sucesso.
    1. Para cada transição de referência de quantificador (não transições padrão internas), veja cada precisão de injeção da curva de calibração (na coluna Precisão). Pelo menos dois terços dos pontos de calibração devem ter uma precisão dentro de 80-120%.
    2. Para pontos de calibração muito fora da precisão esperada, a injeção pode ser um outlier. Exclua os outliers se sua concentração calculada estiver a mais de dois desvios-padrão das outras duas injeções desse frasco. Clicando no" et peak to 'not found button above each chromatogram.
    3. Verifique se o valor R exibido acima da curva de calibração é de >0,975.
    4. Verifique se todas as injeções de controle de qualidade têm uma precisão dentro de 80-120%.
  8. Se todas as condições acima estiverem satisfeitas, o lote passou e as amostras podem ser quantificadas. Clique em Editar na barra de ferramentas e clique em Copiar tabela inteira. Cole a mesa em uma planilha.
  9. Tome-se a média da concentração calculada das duas injeções de amostra para determinar a concentração relatada de cada amostra.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma ilustração de um cromatograma com níveis confirmados de todas as 11 drogas DR-TB é mostrada na Figura 1. O tempo de retenção de cada analizadopode mudar ao usar diferentes instrumentos e colunas, de modo que o tempo exato de retenção deve ser determinado individualmente.

Os Cromatogramas de Íon extraídos (EICs) para uma droga específica (isoniazida, INH) em um dos calibradores (amostra de cabelo em branco cravada com padrões de referência de drogas DR-TB) são ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Relatamos aqui o protocolo para o método que desenvolvemos e validamos para quantificar 11 medicamentos anti-TB utilizados no tratamento de DR-TB em pequenas amostras de cabelo utilizando LC-MS/MS. Nenhum outro método para quantificar essas 11 drogas em cabelos foi previamente desenvolvido, validado e publicado. Nosso método pode quantificar os níveis de sub-nanogramas de drogas em apenas 20-30 fios de cabelo de aproximadamente 3 centímetros (cm) de comprimento (~2 mg) e já foi validado22. O baixo...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe e Monica Gandhi).

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer ao professor Keertan Dheda, ao Dr. Ali Esmail e a Marietjie Pretorius, do Instituto de Pulmão da Universidade da Cidade do Cabo, que facilitaram a coleta de amostras de cabelo para o estudo. Os autores reconhecem ainda com gratidão as contribuições dos participantes deste estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frascos de injeção de 2 mLTecnologias Agilent5182-0716
Inserções de frascos de injeção de 250 uLTecnologias Agilent5181-8872
Rompedor de talão 24OMNI International19001
Tubos rompedores de esferas (kit de esferas de 2 mL, cerâmica de 2,8 mm, microtubos de 2 mL)OMNI International19628
BedaquilinaToronto Research ChemicalsB119550
Bedaquilina-d6Toronto Research ChemicalsB119552
ClofaziminaToronto Research ChemicalsC324300
Clofazimina-d7Toronto Research ChemicalsC324302
Tubos descartáveis de cultura de vidro em calVWR60825-425
EthambutolToronto Research ChemicalsE889800
Ethambutol-d4Toronto Research ChemicalsE889802
EthionamideToronto Research ChemicalsE890420
Etionamida-d5ClearSynthCS-O-06597
Ácido fórmicoSigma-AldrichF0507-100mL
Garrafas de vidroCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCTecnologias AgilentInfinity 1260
Acetonitrilo grau HPLCHoneywell015-4
Metanol grau HPLCHoneywell230-1L
Água de qualidade HPLCAqua Solutions IncW1089-4L
IsoniazidaToronto Research ChemicalsI821450
Isoniazid-d4Toronto Research ChemicalsI821452
Coluna LC, Synergi 2,5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mmFenomenônex00D-4371-B0
Cartucho de guarda LCFenomenônexAJ0-8788
Suporte de cartucho de proteção LCFenomenônexAJ0-9000
Software de quantificação LC-MS/MSSciexMultiquant 2.1
LevofloxacinaSigma-Aldrich1362103-200MG
Levofloxacina-d8Toronto Research ChemicalsL360002
LinezolidaToronto Research ChemicalsL466500
Linezolid-d3Toronto Research ChemicalsL466502
Tubos microcentrífugasE& K Scientific695554
MoxifloxacinaToronto Research ChemicalsM745000
Moxifloxacina-13C, d3Toronto Research ChemicalsM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto Research ChemicalsO667600
Pretomanídeo (PA-824)Toronto Research ChemicalsP122500
ProtionamidaToronto Research ChemicalsP839100
Protionamida-d5Toronto Research ChemicalsP839102
PirazinamidaToronto Research ChemicalsP840600
Piraziamida-15N, d3Toronto Research ChemicalsP840602
Tampas de septo para frascos de injeçãoTecnologias Agilent5185-5862
Evaporador LV TurbovapBiotage103198/11

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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