Summary
Vários métodos diferentes foram estabelecidos para a imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira. Aqui, descrevemos o uso de anticorpos mediados por micro-ondas e de fluoroforre-tyramida para bloquear a reatividade cruzada de anticorpos durante a imunocoloração multiplex em seções adrenal de camundongos forjadas fixadas em formalina.
Abstract
A imunocoloração é amplamente utilizada em pesquisas biomédicas para mostrar o padrão de expressão celular de uma determinada proteína. A imunocoloração multiplex permite rotular usando múltiplos anticorpos primários. Para minimizar a reatividade cruzada de anticorpos, a imunocoloração multiplex usando manchas indiretas requer anticorpos primários não rotulados de diferentes espécies hospedeiras. No entanto, a combinação apropriada de diferentes anticorpos de espécies nem sempre está disponível. Aqui, descrevemos um método de uso de anticorpos primários não rotulados da mesma espécie hospedeira (por exemplo, neste caso, ambos os anticorpos são de coelho) para imunofluorescência multiplex em seções adrenal de camundongos forfinados fixadas (FFPE). Este método utiliza o mesmo procedimento e reagentes utilizados na etapa de recuperação de antígenos para despir a atividade do complexo de anticorpos primários anteriormente manchado. Slides foram manchados com o primeiro anticorpo primário usando um protocolo geral de imunocoloração seguido de um passo de ligação com um anticorpo secundário biotinylado. Em seguida, um método de desenvolvimento de sinal avidin-biotina-peroxidase foi usado com fluorofide-tyramida como substrato. A imunoatividade do primeiro complexo primário de anticorpos foi despojada através da imersão em uma solução de citrato de sódio fervente micro-ondas por 8 min. O deposição fluorofídeo insolúvel permaneceu na amostra, o que permitiu que o slide fosse manchado com outros anticorpos primários. Embora este método elimine a maioria dos sinais positivos falsos, alguns antecedentes da reatividade cruzada de anticorpos podem permanecer. Se as amostras forem enriquecidas com biotina endógena, um anticorpo secundário conjugado por peroxidase pode ser usado para substituir o anticorpo secundário biotinylado para evitar o falso positivo da biotina endógena recuperada.
Introduction
Na imunocoloração multiplex, a coloração direta usando anticorpos primários conjugados pode fornecer resultados informativos. Sem o uso de anticorpos secundários, o método de coloração direta tem baixo risco de falsos sinais de colocalização da reatividade cruzada de anticorpos. No entanto, os repórteres conjugados (fluorofóbico, enzimas) ou biotina no anticorpo primário limitam seu uso futuro. Alternativamente, a imunocoloração indireta geralmente fornece sinais mais fortes usando um anticorpo primário não conjugado com um anticorpo secundário rotulado. Idealmente, anticorpos primários não conjugados usados na imunocoloração multiplex devem vir de diferentes espécies hospedeiras para evitar a reatividade cruzada de anticorpos. No entanto, a combinação apropriada de anticorpos primários de diferentes espécies hospedeiras nem sempre está disponível.
Vários métodos foram estabelecidos para eliminar o risco do anticorpo secundário reagir com um anticorpo primário indesejado. Um método comum é o uso de um anticorpo monomérico F (ab) para bloquear quaisquer epítopos de ligação restantes no primeiro complexo primário de anticorpos antes de colorir com o segundo anticorpo primário1. A desmontagem de anticorpos, semelhante à tira e resonda de uma folha de manchas ocidentais, remove o complexo de anticorpos manchado anteriormente sem desmontar a deposição de moléculas de repórteres detectáveis, como 3,3'-diaminobenzidina tetracloridride (DAB)2 e a dposição de tyramida fluorescente3. Com este método, moléculas de repórteres em cores diferentes podem mostrar um resultado multiplex no mesmo slide. A coloração multiplex também é alcançável pela remoção completa das camadas anteriormente depositadas de anticorpos e o alinhamento de imagens posteriormente adquiridas de outros anticorpos4,5. Todos esses métodos dão resultados confiáveis, embora cada método tenha suas limitações e exija procedimentos complicados ou um sistema especial de imagem.
O protocolo atual mostra a aplicação de um método de desmontagem de anticorpos com o uso de buffers comumente disponíveis. Este protocolo pode ser usado para realizar manchas imunofluorescentes multiplex em seções adrenal de camundongos fixas de parafina fixas formalinadas (FFPE) com dois anticorpos primários não rotulados da mesma espécie hospedeira.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Colorir com o Primeiro Anticorpo
- Depilação e rehidratação de ffpe slides com 5 min alocados em cada uma das seguintes etapas: xileno ou reagentes equivalentes 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x e água destilada 2x.
NOTA: Os slides devem permanecer úmidos a partir desta etapa de reidratação até a montagem na etapa final. - Para recuperação opcional de antígeno, coloque os slides em 275 mL de solução de citrato de sódio fervente (10 mM, pH = 6,0) por 8 min. Para manter a solução fervendo, coloque os slides lisos na parte inferior de uma caixa de ponta de tubulação de 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) com tampa e micro-ondas a solução em 70% de potência em um forno micro-ondas de 700 W por 8 min. Em seguida, retire a caixa de ponta pipette do forno de micro-ondas, abra a tampa e deixe a solução esfriar à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 20 min.
- Transfira os slides para um frasco coplin contendo PBST (soro fisiológico tampão de fosfato com 0,1% de polisorbato 20/80). Lave com PBST por 5 min 3x. Se não estiver imediatamente se movendo para o próximo passo, armazene os slides nesta etapa com PBST em um frasco coplin na RT por algumas horas ou a 4 °C por 1-2 dias se não se mudar imediatamente para o próximo passo.
- Para preparar a solução de bloqueio use o soro normal das espécies hospedeiras do anticorpo secundário como o reagente de bloqueio. Outros reagentes de bloqueio comercial também podem ser usados. Se utilizar o soro normal empregado para o estudo apresentado neste estudo, adicione 100 μL de soro de burro normal a 4,9 mL de PBST. A solução de bloqueio pode ser armazenada a 4 °C por até 3 dias.
- Para bloquear, afaste o PBST dos slides e cubra-os rapidamente com solução de bloqueio suficiente. Incubar os slides na RT em uma câmara umidificada por 30 min.
- Prepare a solução primária de anticorpos (500 μL para dois slides) usando a solução de bloqueio para diluir o anticorpo primário à concentração desejada. A solução deve ser armazenada no gelo até o uso.
- Para 3βHSD, adicione 2 μL de 3βHSD em 498 μL de solução de bloqueio.
- Para TH, adicione 0,5 μL de anticorpo TH em 499 μL de solução de bloqueio.
- Para β-catenina, adicione 1 μL de anticorpo β-catenin em 499 μL de solução de bloqueio.
- Para 20αHSD, adicione 1 μL de anticorpo 20αHSD em 499 μL de solução de bloqueio.
- Para CYP2F2, adicione 2 μL de anticorpo CYP2F2 em 498 μL de solução de bloqueio.
- Incubar com o anticorpo primário sacudindo a solução de bloqueio dos slides, e cobrindo-os rapidamente com solução de anticorpos primários suficiente. Incubar os slides em uma câmara umidificada durante a noite a 4 °C. Durante a incubação, os slides podem ser cobertos por um pequeno pedaço de película de parafina para evitar a secagem.
- Na manhã seguinte lave os slides com PBST por 5 min 3x.
- Prepare a solução secundária de anticorpos (500 μL para dois slides) usando a solução de bloqueio para diluir o anticorpo secundário biotinylado à concentração desejada (por exemplo, 1 μL de anticorpo anti-rato de burro ou anticorpo anti-coelho burro em 499 μL de bloqueio solução). A solução deve ser armazenada no gelo até o uso.
- Incubacom o segundo anticorpo, sacudindo o PBST dos slides e cobrindo-os rapidamente com solução de anticorpos secundários suficiente. Incubar os slides em uma câmara umidificada por 1 h na RT.
NOTA: Se a biotina endógena é uma preocupação, use um anticorpo secundário conjugado peroxidase em vez do anticorpo secundário biotinylado. Pule para a etapa 1.14 se usar um anticorpo secundário conjugado peroxidase na etapa 1.10. - Lave os slides com PBST por 5 min 3x.
- Prepare a solução de streptavidin conjugada com rabanete (SA-HRP) (500 μL para dois slides) adicionando 0,5 μL de SA-HRP em 499 μL de PBS. A concentração final é de 1 μg/mL.
- Incubar com a solução SA-HRP. Afaste-se do PBST dos slides e cubra rapidamente os slides com solução SA-HRP suficiente. Incubar os slides em uma câmara umidificada por 0,5 h na RT.
- Lave os slides com PBST por 5 min 3x.
- Prepare a solução fluorofórde-tyramida diluindo fluorofóide com seu buffer de diluição de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, 5 μL de fluorofórdio-tyramida em 496 μL de tampão de diluição).
- Execute o desenvolvimento do sinal com fluorofórdio-tyramida sacudindo o PBST dos slides e cobrindo rapidamente os slides com solução fluorofórde-tyramida suficiente. Incubar em uma câmara umidificada por 1 min na RT. O tempo de incubação pode ser ajustado para obter a intensidade de fluorescência desejada. Pare a reação transferindo os slides para um frasco coplin contendo PBST. Lave slides com PBST por 3 min 2x.
- Os sinais podem ser rapidamente verificados um microscópio de fluorescência para confirmar o resultado nesta fase. Se os deslizamentos de cobertura não estiverem sendo utilizados, aplique uma gota de glicerol:PBS (1:1) em cada seção para manter as amostras úmidas. Lave slides com PBST por 3 min 2x. Os slides podem ser armazenados no PBST a 4 °C por alguns dias antes de passar para o próximo passo.
2. Tire o Primeiro Anticorpo
- Coloque os slides em 275 mL de solução de citrato de sódio fervente (10 mM, pH = 6,0) por pelo menos 8 min. Mantenha a solução fervendo colocando os slides planas na parte inferior de uma caixa de ponta de tubulação de 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) com uma tampa e microwaving a solução em 70% de potência em um forno micro-ondas de 700 W para 8 min. Se um tempo mais longo de despição for preferido, pode ser necessário completar o buffer usando uma solução de citrato de sódio fervente para manter os slides imersos na solução tampão o tempo todo. Retire a caixa de ponta da pipeta do forno de micro-ondas, abra a tampa e deixe a solução esfriar na RT por pelo menos 20 min.
- Transfira os slides para um frasco coplin contendo PBST. Lave com PBST por 5 min 3x. Se o próximo passo, se não for realizado imediatamente, armazene os slides em um frasco coplin com PBST na RT por algumas horas ou a 4 °C por 1-2 dias.
3. Mancha com o Segundo Anticorpo
- Comece a partir da etapa de bloqueio e siga os mesmos procedimentos na etapa 1.5 até a etapa 1.14. Nas etapas de desenvolvimento do sinal (passo 1.15 e passo 1.16), use o fluorofórdia-tyramida em um espectro diferente de fluorescência.
NOTA: Os slides podem ser despojados usando este método várias vezes para permitir a coloração multiplex. O último anticorpo não requer fluorofóide-tyramida como repórter. Um anticorpo secundário conjugado com fluorofóforo pode ser usado para mostrar sinais do último anticorpo primário. - Deslizamentos incubados com 2 μg/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou solução hoechst para 1 min na RT se for necessário a coloração de contador nuclear. Em seguida, lave os slides com PBST por 3 min 2x.
4. Imagem usando um microscópio de fluorescência para detectar sinais
- Monte um deslizamento de cobertura com uma gota de montagem média adequada para imunofluorescência.
- Para imagens, use um microscópio de fluorescência para detectar sinais de cada canal de fluorescência. Comece com o canal de coloração nuclear (DAPI) e a lente 4x para localizar o tecido no slide.
- Mude para a lente de 10x para imagem. Ajuste o tempo de exposição (300 ms) e a intensidade da fonte de luz (80% de intensidade). Ajuste essas configurações se o sinal estiver muito brilhante ou muito escuro. Tire fotos de cada canal sem mover o palco. O redirecionamento pode ser necessário para cada canal. Mesclar as imagens de cada canal usando o software do microscópio ou ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os resultados foram obtidos a partir de amostras tratadas com todas as etapas descritas, incluindo a etapa 1.2 de recuperação de antígenos. Todos os anticorpos secundários usados aqui estavam biotinylated. O fluoroforreio-tyramida foi usado para desenvolver sinais do primeiro e segundo anticorpos primários. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência equipado com um cubo FITC (para fluorescência verde), um cubo TxRED (para Cy3) e um cubo DAPI (para DAPI).
A desmontagem mediada por microacenações elimina a reatividade cruzada.
Seções adrenal do Rato FFPE foram manchadas usando dois anticorpos primários de coelho. Sem despir(Figura 1A-C),o anticorpo secundário para TH pegou 3βHSD(+) e deu sinais vermelhos no córtex adrenal(Figura 1B). A falta de despir levou aos falsos sinais de colocalização vistos em amarelo (Figura 1C). Essa reatividade cruzada vem da (1) enzima HRP que catalisou a primeira reação de tyramida e (2) a cruzada das espécies de anticorpos. Para remover a reatividade cruzada do anticorpo e o HRP da primeira imunocoloração, testamos um 1 min (Figura 1D-F) e uma desmontagem mediada por micro-ondas de 8 min(Figura 1G-I). Ambos os tratamentos foram suficientes para eliminar o sinal inespecífico, dando resultados limpos de dupla coloração (Figura 1F,I). O controle negativo seguiu todos os mesmos passos, com exceção da incubação com anticorpos primários (Figura 1J). Nenhum sinal significativo foi captado no controle negativo. Descobrimos que uma desmontagem de 8 min em um tampão de ceita fervente foi suficiente para eliminar a reatividade cruzada de anticorpos para muitos anticorpos comumente usados na glândula suprarrenal(Figura 2).
A limitação — a eficácia da desmontagem mediada por micro-ondas é dependente de anticorpos.
Embora a desmontagem mediada por micro-ondas usada neste protocolo funcione para a maioria dos casos, há limitações para este método. Para alguns anticorpos, um método de desmontagem mediado por micro-ondas com um tampão de citrato pode não remover completamente a reatividade cruzada do anticorpo. Por exemplo, uma desmontagem de 8 minutos removeu a maioria dos sinais não específicos do anticorpo anti-TH do mouse e do anticorpo anti-CYP2F2 do mouse, mas um sinal fraco falso positivo ainda era detectável (a medula na Figura 3E e o córtex interno na Figura 3K). Note-se que um aumento do tempo de micro-ondulação para 20 min ainda não removeu completamente a reatividade cruzada de anticorpos (Figura 3H,K).
Figura 1: Imunocoloração dupla representativa em adrenals de camundongos P1 FFPE. Seções adrenal de camundongos FFPE foram manchadas com dois anticorpos primários de coelhos: anti-3βHSD (verde = córtex), anti-TH (vermelho = medular). Os três grupos de manchas incluem os três diferentes procedimentos de descascamento utilizados: (A-C) sem striping, (D-F) 1 min striping, e (G-I) 8 min striping. Note-se que sem microacenar, o anticorpo secundário com TH ainda captou 3βHSD sinais, enquanto resultados específicos de coloração foram obtidos nos grupos tratados com micro-ondas de 1 min e 8 min. Não há sinal positivo no controle negativo, não incubado com anticorpos primários. Barra de escala = 100 μm. DAPI = núcleos celulares, azul. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Imunocoloração dupla representativa em adrenals de camundongos P21 FFPE. As seções adrenal do camundongo FFPE foram manchadas com dois anticorpos primários de coelhos na seguinte ordem: anti-β-catenina (verde = córtex externo) e, em seguida, anti-20αHSD (vermelho = córtex interno). Um passo de 8 min foi realizado no meio. Barra de escala = 100 μm; DAPI = núcleos celulares, azul. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Alguns anticorpos podem não ser totalmente despojados, o que pode levar a sinais fracos não específicos. As seções adrenal do camundongo FFPE foram manchadas com dois anticorpos primários de camundongos: anti-CYP2F2 (verde = córtex interno) e anti-TH (vermelho = medular). Os resultados do grupo sem desmontagem(A-C)mostraram que as reações para detectar a proteína CYP2F2 ainda mancharam a área TH(+). Uma falsa colocalização foi vista na medula suprarrenal(C). Embora um tratamento de micro-ondas de 8 min e 20 min reduzisse a intensidade de fluorescência verde na medula, um fundo perceptível ainda está presente(D-I). O anticorpo anti-CYP2F2 é outro exemplo que mostra que a reatividade cruzada não pode ser totalmente removida mesmo após 20 min de microwaving(J-L). Note-se que não havia sinal positivo no controle negativo, não incubado com anticorpos primários, indicando que o falso sinal positivo era da reatividade cruzada do anticorpo(M). Barra de escala = 100 μm; DAPI = núcleos celulares, azul. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A imunocoloração multiplex é útil para examinar a colocalização celular de dois ou mais antígenos. Esta técnica amplamente utilizada dá resultados convincentes de colocalização quando os anticorpos primários são conjugados com diferentes repórteres (coloração direta). No entanto, a coloração direta geralmente fornece sinais mais fracos em comparação com a coloração indireta, que envolve anticorpos secundários conjugados para detectar os anticorpos primários. Na coloração indireta, um resultado de imunocoloração multiplex de alta qualidade depende se os anticorpos secundários podem distinguir entre os diferentes anticorpos primários. Devido à possível reatividade cruzada de anticorpos, a coloração multiplex utilizando o método de coloração indireta é vista mais claramente com anticorpos primários de diferentes espécies hospedeiras. Carl e outros desenvolveram um protocolo usando um excesso de fragmento igG F (ab) não conjugado para bloquear a reatividade cruzada de anticorpos1. Uma estratégia semelhante é usada na coloração "mouse-on-mouse" que usa um anticorpo anti-rato monomérico F (ab) para evitar que o anticorpo secundário anti-rato detecte qualquer imunoglobulina do rato endógeno no tecido. No entanto, este método de bloqueio é demorado e pode não bloquear completamente os anticorpos das etapas anteriores, especialmente se os antígenos detectadores forem de alta abundância2.
A desmontagem mediada pelo calor é outro método para evitar a reatividade cruzada de anticorpos em imunostaining multiplex. O conceito é semelhante ao método de tira e resonda de uma mancha ocidental. O uso de um micro-ondas para ferver os slides em um tampão de citrato teve um efeito positivo acentuado no bloqueio da reatividade cruzada do anticorpo. Dois tratamentos de micro-ondas de 5 min entre rodadas sequenciais de imunocolorimétrica permitem a detecção de múltiplos antígenos no mesmo slide usando anticorpos monoclonais do rato2. Tratamentos de micro-ondas combinados com o método de amplificação de sinal de timramida (TSA), que usa fluorofóide-tyramida como substrato de HRP, também são úteis para imunofluorescência de coloração dupla3,6,7. O tratamento de micro-ondas entre o primeiro e o segundo ciclos de coloração bloqueia a atividade do primeiro complexo imunológico sem lavar sua precipitação de timramida fluorescente. No entanto, um tratamento de micro-ondas pode não ser capaz de evitar totalmente a contaminação na coloração8. Embora alguns métodos que utilizam diferentes tipos de buffers de descascamento possam fornecer uma melhor eficácia de desmontagem, buffers especializados com tempos mais longos de incubação são necessários, ou amostras precisam passar por aquisição de imagem antes que outra mancha seja aplicada4,5,7,9,10,11. Aqui demonstramos um método simples com um procedimento menos complicado e um buffer comum para recuperação de antígenos mediados em micro-ondas em coloração imunofluorescente multiplex. Embora este método elimine a maior parte da reatividade cruzada, os usuários devem estar cientes de uma possível colocalização falsa fraca vista com alguns anticorpos mesmo após um tratamento de micro-ondas de 20 min.
A biotina endógena pode ser usada como marcador de células esteroides no córtex adrenal12. O fluoroforor conjugado por streptavidin sozinho é suficiente para detectar biotina endógena e acende todo o córtex adrenal, especialmente em seções congeladas. Como a biotina endógena geralmente é bloqueada em amostras de FFPE, o procedimento avidin-biotina-peroxidase (ou seja, kit ABC) ainda é amplamente utilizado para amplificar alvos em amostras adrenal FFPE. É importante notar que o passo de recuperação de antígenos também desmascara biotina endógena e induz sua imunoatividade13. Como nosso método combina recuperação de antígeno mediado em micro-ondas e o uso de HRP conjugado por streptavidin, é possível que a biotina endógena leve a falsos sinais positivos, especialmente em tecidos ricos com biotina endógena (por exemplo, fígado, rins e alguns tumores)13. Se o procedimento de avidin-biotina-peroxidase for necessário para amplificar o sinal, uma etapa adicional de bloqueio, como a preincubação com ávida livre e biotina livre pode ajudar a reduzir o sinal de biotina endógeno14. Embora nosso método dê um fundo biotin abitógeno em adrenals de camundongos FFPE, é importante sempre incluir um controle negativo com cada amostra em todos os momentos quando se usa o procedimento avidin-biotina-peroxidase. A abordagem alternativa é usar um anticorpo secundário conjugado peroxidase em vez do anticorpo secundário biotinylado.
Nossos resultados demonstram que o tratamento de micro-ondas com um tampão de citrato é um método útil para a coloração de imunofluorescência multiplex. No entanto, deve-se notar que nem todas as reatividades cruzadas podem ser totalmente bloqueadas. Uma colocalização falsa fraca é possível. Este protocolo pode ser usado como uma abordagem alternativa quando uma combinação apropriada de anticorpos primários de diferentes espécies hospedeiras não está disponível. Os usuários devem estar cientes de possíveis falsos positivos da reatividade cruzada restante, bem como da biotina endógena recuperada. Os controles negativos adequados devem ser incluídos o tempo todo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo NIH R00 HD032636.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 dilution |
| Microwave oven, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz | SC-25269 | 1:1,000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X.
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
