O ensaio opsono-adesão é um método alternativo ao ensaio opsono-fagocítico de matar para avaliar as funções opsônicas dos anticorpos no desenvolvimento de vacinas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Ensaio opsono-adesão para avaliar anticorpos funcionais no desenvolvimento de vacinas contra bacillus anthracis e outros patógenos encapsulados
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ensaio opsono-adesão é um ensaio funcional que enumera o apego de patógenos bacterianos a fagocitos profissionais. Como a adesão é necessária à fagocitose e à matança, o ensaio é um método alternativo para ensaios de morte opsono-fagocítico. Uma vantagem do ensaio de adesão opsono é a opção de usar patógenos inativados e linhas celulares de mamíferos, o que permite a padronização em vários experimentos. O uso de um patógeno inativado no ensaio também facilita o trabalho com agentes infecciosos de nível 3 de biossegurança e outros patógenos virulentos. Em nosso trabalho, o ensaio opsono-adesão foi utilizado para avaliar a capacidade funcional dos anticorpos, desde soro de animais imunizados com uma vacina à base de cápsula de antraz, para induzir a adesão de Anthracis fixas de Bacillus a uma linha de células macrófagos do camundongo, RAW 264.7. A microscopia automatizada de fluorescência foi usada para capturar imagens de bacilos aderindo a macrófagos. O aumento da adesão foi correlacionado com a presença de anticorpos anti-cápsula no soro. Primatas não humanos que exibiam altas concentrações de anticorpos anti-cápsulas de soro foram protegidos do desafio do antraz. Assim, o ensaio opsono-adesão pode ser utilizado para elucidar as funções biológicas de anticorpos específicos de antígeno no Sera, avaliar a eficácia dos candidatos à vacina e outras terapêuticas, e servir como uma possível correlação de imunidade.
Introdução
Reconhecimento, adesão, internalização e degradação de um patógeno são parte integrante da fagocitose1, um caminho saliente na resposta imune inata hospedeira descrita pela primeira vez por Ilya Metchnikoff em 18832,3. Leucócitos fagocíticos, bem como outras células do sistema imunológico, são altamente discriminatórios em sua seleção de alvos; eles são capazes de distinguir entre "não-eu infeccioso" e "eu não infeccioso" através de padrões moleculares associados ao patógeno por seu repertório de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs)4,
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal, a política do Serviço Público de Saúde e outros estatutos e regulamentos federais relativos a animais e experimentos envolvendo animais, a pesquisa aqui descrita foi conduzida sob um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. A instalação onde esta pesquisa foi realizada é credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Laboratoriais de Animais, Internacional e adere aos princípios indicados no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Conselho Nacional de Pesquisa, 201124.
1. Cultura e manutenção da linha celular, ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Esta seção mostra micrografias representativas coletadas durante um experimento OAA, juntamente com resultados mostrando que o OAA pode ser usado para examinar a função biológica dos anticorpos. Aqui, o ensaio foi usado com sucesso para avaliar a eficácia de um candidato à vacina contra antraz. É fundamental verificar o estado de encapsulamento nos bacilos tão pouco ou nenhum encapsulamento faz com que eles aderam às células hospedeiras, produzindo um alto fundo. Figura 1 é uma imagem de
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Vacinas à base de cápsulas têm se mostrado eficazes contra numerosos patógenos bacterianos, e muitas são licenciadas para uso em humanos25,26,27. Essas vacinas funcionam gerando anticorpos voltados para a cápsula e muitos desses estudos utilizam o OPKA para mostrar as funções opsono-fagocíticas dos anticorpos13,14,16,
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não possuem uma associação comercial ou outra que possa representar um conflito de interesses.
Agradecimentos
J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander projetaram os procedimentos descritos no manuscrito. J. Chua e T. Putmon-Taylor realizaram os experimentos. D. Chabot realizou análise de dados. J. Chua escreveu o manuscrito.
Os autores agradecem a Kyle J. Fitts pela excelente assistência técnica.
O trabalho contou com o apoio da Agência de Redução de Ameaças de Defesa da CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plano número 921175.
Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são dos autores e não são necessariamente endossadas pelo Exército dos EUA. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,20 µ m (25mm, celulose regenerada) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL (ponta Luer-Lok) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 placas pretas de poço (placa #1 para imagem) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| Balão tratado com cultura de tecidos de 75 cm Corning | , Corning, NY | 430641 | |
| Ágar (pó) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Complemento de Coelho Bebê | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Extrato de Levedura Bacto | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Infusão de Coração Cerebral (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Placas de ágar sangue (TSA com sangue de ovelha) | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Raspador de células | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Placas de cultura de células de 96 poços Costar (placas # 2 e 3 para diluições) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Vidro de cobertura | Microscopia eletrônica Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Caldo de nutrientes Difco | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glicose alta | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contém 4500 mg/L de glicose, 4 mM de L-glutamina, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (microscópio de fluorescência) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | não irradiado por gama, não inativado |
| por calor Isotiocianato de fluoresceína | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocitômetro (Neubauer aprimorado) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| Solução de tinta da Índia | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L-glutamina (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | meio suplementar com L-glutamina adicional de 2mM |
| Nikon Eclipse TE2000-U (microscópio composto invertido) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS sem cálcio ou magnésio | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Solução de penicilina-estreptomicina, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 placas de | |
| Petri (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | para placas de ágar |
| Linha celular de macrófagos RAW 264.7 (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Solução de azul de tripano (0,4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Microscopia de varredura a laser (microscópio confocal) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
Referências
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoolo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
