Method Article

Um modelo de mouse de sarcoma de tecido mole incompletamente ressectado para testar (Neo)terapias adjuvantes

DOI:

10.3791/60882

⸱

July 28th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, University of Western Australia, 2Telethon Kids Institute, University of Western Australia, 3College of Science, Health, Engineering and Education, Murdoch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, descrevemos um modelo de camundongo de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole para testar (neo)terapias adjuvantes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cirurgia é frequentemente o primeiro tratamento para muitos tumores sólidos. No entanto, as recaídas locais ocorrem frequentemente após a ressecção do tumor primário, apesar das terapias adjuvantes ou neoadjuvantes. Isso ocorre quando as margens cirúrgicas são insuficientemente livres de tumores, resultando em células cancerígenas residuais. Do ponto de vista biológico e imunológico, a cirurgia não é um evento nulo; o ambiente de cicatrização da ferida é conhecido por induzir vias pró e anti-tumorigênicas. Como consequência, modelos pré-clínicos para o desenvolvimento de medicamentos destinados a prevenir a recaída local devem incorporar a ressecção cirúrgica ao testar novas terapias (neo)adjuvantes, para modelar os cenários clínicos em pacientes tratados com cirurgia.

Aqui, descrevemos um modelo de camundongo de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole WEHI 164 que permite o teste de terapias (neo)adjuvantes no cenário de uma resposta de cicatrização da ferida. Nesse modelo, 50% ou 75% do tumor é removido, deixando para trás algum tecido cancerígeno in situ para modelar doença residual bruta após cirurgia no ambiente clínico. Este modelo permite testar terapias no contexto da cirurgia, ao mesmo tempo em que considera a resposta de cicatrização da ferida, o que pode afetar a eficácia dos tratamentos (neo)adjuvantes. A ressecção cirúrgica incompleta resulta em recrescimento reprodutível do tumor em todos os camundongos na ausência de terapia adjuvante. O tratamento adjuvante com bloqueio de ponto de verificação resulta em redução do recrescimento tumoral. Este modelo é, portanto, apropriado para testar terapias no contexto da cirurgia de debulking e sua resposta associada à cicatrização de feridas e pode ser estendido a outros tipos de câncer sólido.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cirurgia continua sendo a principal opção de tratamento para muitos tumores sólidos1, incluindo sarcoma de tecido mole2,3. Apesar das melhorias nas técnicas de cirurgia oncológica e das combinações com terapias (neo)adjuvantes, ainda há um alto risco de recaída e metástase após a ressecção do tumor primário4,5. No sarcoma de tecido mole, as recaídas ocorrem particularmente locoregionalmente, no local da cirurgia, resultando em aumento da morbidade e mortalidade. No cenário clínico, pode ser difícil obter margens largas o suficiente (por exemplo, devido a restrições anatômicas), resultando em ressecção incompleta e recorrência do tumorsubsequente 6. O estresse cirúrgico e o processo subsequente de cicatrização da ferida são conhecidos por criar um microambiente tumoral imunossupressor favorável à recidiva do tumor7,8. Portanto, a descoberta e o desenvolvimento de novas terapias para sarcoma de tecido mole, particularmente imunoterápicos, devem levar em conta a resposta de cicatrização da ferida cirúrgica.

A maioria dos estudos pré-clínicos para terapias adjuvantes são inicialmente realizados utilizando modelos subcutâneos sintéticos ou xenotransplant mouses, sem incorporar o estresse cirúrgico e a resposta de cicatrização da ferida9,,10. Por isso, desenvolvemos um modelo de sarcoma de tecido mole subcutâneo síndico contendo ressecção cirúrgica incompleta. AS células de fibrosarcoma WEHI 164 são inoculadas subcutâneas, e uma vez estabelecidas as tumores, removemos 50-75% do volume tumoral(Figura 1A-E). Tumores consistentemente re-crescer do tumor restante. Este modelo permite testar terapias adjuvantes, considerando o efeito do estresse cirúrgico e da cicatrização das feridas. Modelos cirúrgicos semelhantes de ressecção incompleta têm sido utilizados em uma série de estudos por diversos grupos e constatados ser reprodutíveis e eficazes11,,12,13. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada deste protocolo.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os animais utilizados nesses experimentos foram obtidos do Centro de Recursos Animais (Perth, Austrália Ocidental). Os animais foram mantidos sob condições padrão sem patógenos no Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Austrália Ocidental). Todos os experimentos foram realizados seguindo o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Harry Perkins de Pesquisa Médica. Foram utilizados camundongos BALB/c de 8 a 12 semanas de idade nesses experimentos. A linha de células fibrossarcoma WEHI 164 foi obtida do CellBank Australia (Westmead, NSW).

1. Inoculação de células

  1. Preparação de células e animais
    1. Certifique-se de que a linha celular está mantida na mídia recomendada. Por exemplo, manter a linha celular WEHI 164 no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio suplementado com 2 mM L-glutamina, 10% soro bovino fetal, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoetanol, 100 penicilina U/mL e 100 μg/mL estreptomia.
      NOTA: Células de passagem pelo menos 3 e até 5 vezes após serem removidas do armazenamento criogênico. Para garantir uma viabilidade celular ideal, as células devem ser divididas quando estiverem entre 70-80% confluentes. As linhas de células tumorais devem ser testadas para o micoplasma, pois a infecção pode alterar o crescimento celular e influenciar a resposta imune in vivo.
    2. Um dia antes da inoculação, raspe ratos no flanco inferior direito usando cortadores.
      NOTA: Foram utilizados camundongos BALB/c femininos, com idade entre 8 e 12 semanas, de peso normal (16 -22 gramas) neste experimento.
    3. No dia da inoculação, colher WEHI 164 células quando 70-80% confluentes pela tripoizatização.
      1. Aspire o meio de cultura dos frascos de cultura tecidual e, em seguida, adicione solução tamponada de fosfato estéril (1x PBS), para remover vestígios remanescentes de soro bovino fetal (FBS).
      2. Aspire o PBS dos frascos de cultura tecidual. Adicione 3 mL de trippsina de 0,05% (para um frasco T75) e, em seguida, gire o frasco para que toda a superfície de frasco com células seja coberta por trippsina.
      3. Incubar o frasco a 37 °C, 5% de incubadora de CO2 por 3 min. Verifique as células periodicamente, tocando nas laterais do frasco para ver se as células se desalojaram.
      4. Remova frascos da incubadora de cultura celular e adicione 5 mL de mídia suplementada com FBS para neutralizar a trippsina.
        NOTA: Não deixe as células na trippsina por mais tempo do que o necessário, pois isso pode danificar as células e levar à baixa viabilidade celular.
      5. Suspensão de tubulação várias vezes para obter uma única suspensão celular. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica.
      6. Células de pelota girando a 350 x g por 3 min.
    4. Lave as células três vezes em 1x PBS.
      1. Células resuspendas em 50 mL de PBS 1x estéreis e lavam células por suspensão de células tubulações para cima e para baixo. Células de pelota girando a 350 x g por 3 min.
      2. Aspire as células supernascidas e resuspend em 15 mL de PBS 1x estéril. Lave as células por suspensão de células tubulações para cima e para baixo. Células de pelota girando a 350 x g por 3 min.
      3. Aspire as células supernascidas e resuspend em exatamente 10 mL de PBS 1x estéril. Lave as células como na etapa 1.1.4.2 e transfira uma pequena quantidade (aproximadamente 100 μL) de suspensão celular para um tubo de centrífuga para contagem. Células de pelota girando a 350 x g por 3 min.
    5. Determine o número da célula usando o método de exclusão azul Trypan usando um hemocitómetro ou um contador automatizado de células. Células resuspendas em 1x PBS estéreis a uma concentração de 5 x 106 células/mL. Mantenha a suspensão celular no gelo.
      NOTA: A viabilidade das células tumorais deve ser igual ou superior a 80 % para garantir o crescimento do tumor reprodutível.
  2. Inoculação subcutânea
    1. Misture bem a suspensão celular e encha uma seringa com uma agulha de 26 G com 100 μL de suspensão celular (5 x 105 células) em 1x PBS estéril. Repita a mistura de células antes de carregar a próxima seringa.
      NOTA: Mantenha as células no gelo durante todo o procedimento para manter a viabilidade.
    2. Contenha o mouse adequadamente, garantindo o acesso ao flanco inferior direito. Inocular o rato subcutâneamente no flanco inferior direito raspado.
      NOTA: Certifique-se de que a inoculação não está no peritônio levantando ligeiramente a agulha, que deve ser visível sob a pele. Um nódulo parecido com uma bolha deve se formar sob a pele após a inoculação.
    3. Monitore os camundongos conforme exigido pela aprovação ética aplicável e realize a ressecção cirúrgica quando os tumores crescerem para um tamanho de cerca de 50 mm2.

2. Ressecção cirúrgica parcial do tumor

NOTA: Este protocolo requer dois pesquisadores; um para procedimentos cirúrgicos (CIRURGIÃO) e outro para monitoramento de camundongos (ASSISTENTE).

  1. Configuração da cirurgia
    1. No dia 12 pós-inoculação, quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 50 mm2, dose de camundongos com 100 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina s.c. no pescoço, 30 minutos antes da cirurgia.
    2. Configure a área cirúrgica com uma almofada de calor coberta com casaco de banco e configure um cone de nariz para anestesia. Esterilize ferramentas cirúrgicas antes do uso, e entre cada animal usando um esterilizador de contas de calor, permitindo que as ferramentas esfriem antes do uso. Tenha os seguintes equipamentos cirúrgicos limpos e de fácil acesso: clorexidina, cotonete, gaze, gel ocular, dois fórceps curvos, tesoura, aplicador de clipe, removedor de clipe, recargas de clipe(Figura 2A, 2B).
    3. Aqueça a câmara de aquecimento a 37 °C e configure outra almofada de aquecimento para recuperação(Figura 2C). Coloque ferramentas esterilizadas em uma superfície estéril, como almofadas autoclavadas.
  2. Anestesia
    1. Coloque o mouse na câmara de indução e anestesia o mouse com 4% de isoflurane (4% em 100% de oxigênio a uma taxa de fluxo de 1 L/min) até que a taxa de respiração desacelere para aproximadamente 60 respirações por minuto (1 por segundo) (isso geralmente leva <1 min).
      NOTA: Não deixe o rato na câmara por muito tempo, pois isso pode levar à asfixia e à morte. Só tem um rato sob anestesia de cada vez.
    2. Transfira o mouse para a almofada de calor na mesa de cirurgia, coloque o rato com o nariz no cone do nariz e mantenha o estado anestésico com isoflurane de 3-4% em 100% oxigênio a uma taxa de fluxo de 0,5 L/min. Monitore a taxa de respiração para garantir que a profundidade da anestesia seja mantida.
      NOTA: O ASSISTENTE deve monitorar a respiração do camundongo durante toda a cirurgia para garantir que o nível correto de anestesia seja mantido. Abaixe a concentração anestésico se a respiração ficar muito lenta ou aumentar a concentração se a profundidade da anestesia for muito rasa. Se o mouse começar a ofegar, retire o rato do cone do nariz, diminua a concentração anestésico e espere até que a respiração se normaliza antes de colocar no cone do nariz novamente.
    3. Realize um "teste de pinça" e "teste de reflexo córnea"14 para garantir que o rato esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia.
      NOTA: O movimento de qualquer parte do mouse é uma indicação de que o mouse não está totalmente anestesiado. O animal deve receber imediatamente anestésico adicional aumentando a concentração anestéstica.
    4. Cubra os olhos do rato com uma pequena quantidade de gel oftálmico para evitar o ressecamento dos olhos.
  3. Procedimento cirúrgico (CIRURGIÃO)
    1. Limpe a área cirúrgica 3 vezes com clorexidina alcoólica. Usando fórceps e um par de tesouras, faça uma incisão reta de 1 cm ao longo do lado dorsal, 3 mm de distância do tumor(Figura 3A, 3B).
      NOTA: Padronizar a incisão para 1 cm em cada rato (usando uma régua) permite até mesmo a avaliação da cicatrização de feridas entre camundongos. Localizar a incisão a 3 mm do tumor permite a terapia adjuvante intratumoral subsequente sem vazamento da ferida.
    2. Usando pinças, retire a fácia e o tecido gorduroso subcutâneo entre o tumor e o peritônio. O tumor subcutâneo é normalmente ligado ao lado da pele.
    3. Abra a ferida segurando suavemente a pele no lado do rolamento do tumor usando pinças, e "inverta" o tumor para que ele fique visível lá fora(Figura 3C, 3D).
      NOTA: A seção do tumor a ser desprupado deve ser mais próxima da abertura, para ter pele suficiente para fechar a ferida. Tenha cuidado para não cortar a pele ao remover o tumor.
    4. Usando um par de tesouras, corte a cápsula tumoral da metade para remover, começando da base do tumor mais próximo da abertura.
    5. Para 50% de cirurgia de debulk, corte no meio do tumor. Usando fórceps curvas, colher a seção do tumor a ser removida (50%); colher quaisquer restos da área desbulhada.
    6. Para 75% debulk, realize um debulk tumoral de 50% como na parte 2.3.5 acima. Em seguida, corte pela metade os 50% restantes do tumor e retire 25% do tumor, usando fórceps curvos como descrito acima.
  4. Fechando o local cirúrgico
    1. Coloque o tumor restante de volta sob a pele, e usando fórceps, puxe os retalhos da pele e alinhe a pele ao longo da ferida.
    2. Segure a pele a 5 mm da borda da ferida e use clipes cirúrgicos para fechar a ferida, começando pelo lado mais próximo dos fórceps. Aplique quantos clipes for necessário para garantir que nenhum tecido subjacente seja exposto. Geralmente, três a quatro clipes são aplicados com lacunas de 2 mm entre os clipes.
      NOTA: Se algum clipe não estiver bem aplicado, remova-o usando um removedor de clipe e substitua-se por novos clipes.
  5. Recuperação de ratos (ASSISTENTE)
    1. Deixe que os ratos se recuperem colocando-os na câmara de aquecimento quente (37 °C).
    2. Coloque a gaiola do mouse na almofada de calor. Monitore os ratos na câmara de aquecimento até que eles se recuperem do anestésico (acordado e andando) e, em seguida, coloque os ratos de volta na gaiola. Deixe a gaiola na almofada de calor por mais 10 minutos, até que os ratos se tornem mais ativos.
    3. Dê aos ratos comida molhada e macia. Monitore os camundongos 1 hora após a cirurgia para recuperação e certifique-se de que os clipes permaneçam no local. Certifique-se de que a gaiola está meio on/half fora da almofada de calor para permitir que os animais se autorregularem a temperatura enquanto não estão acompanhados.
    4. Dose de camundongos com 0,1 mg/kg buprenorfina (100 μL subcutâneamente no pescoço), 6-8 horas após a cirurgia (no final do dia). Monitore os camundongos no início da manhã seguinte, e dose novamente os camundongos com 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 μL subcutânea no pescoço). Dê mais comida molhada conforme necessário.
    5. Monitore ratos diariamente pelos próximos sete dias. Os clipes podem ser removidos após sete dias usando o removedor de clipe.
  6. Tratamento adjuvante ou neoadjuvante
    1. Trate camundongos peri-operativamente com (neo)terapia adjuvante a qualquer momento, dependendo do tratamento de interesse.
    2. Por exemplo, trate camundongos com uma dose de 100 μg de anti-CTLA-4 intraperitoneally (i.p.) no dia 15 após a inoculação, ou com três doses de 200 μg anti-PD-1 i.p. nos dias 15, 17 e 19 após a inoculação.
  7. Controles experimentais
    1. Ao utilizar este modelo para avaliar os efeitos da inflamação/cicatrização de feridas, considere usar os seguintes grupos de controle: 1) Controle não cirúrgico (os tratamentos ainda podem ser administrados intratumorally); 2) Controle da cirurgia falsa: Uma incisão cirúrgica é feita na pele; o tumor é manipulado e exposto, mas nenhum tecido tumoral é removido; a ferida está fechada com clipes.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O crescimento do tumor para um tamanho de 50 mm2 é um tamanho ideal para debulk parcial. A ressecção cirúrgica incompleta de 50 mm2 tumores resulta em 100% (n=5) recrescimento reprodutível dos tumores na ausência de imunoterapia adjuvante(Figura 4A). Em seguida, usamos o modelo para testar imunoterápicos adjuvantes usando anticorpos contra moléculas de checkpoint Citotóxica T Linfócito Associado Proteína 4 (CTLA-4) e Rec...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fornecemos um protocolo para um modelo de rato de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole para testar terapias peri-operatórias. Também padronizamos a incisão cirúrgica para permitir a avaliação da cicatrização de feridas entre camundongos após o tratamento.

A colocação do tumor é uma parte importante deste protocolo. Optamos por um modelo de tumor subcutâneo para permitir fácil acesso cirúrgico ao local do tumor e administração de terapias locais com carga mínima sobre os cam...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sem revelações.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado por subsídios do Sock-lo para Sarcoma! Fundação, Associação Australiana e Neozelandesa de Sarcoma, Fundação de Pesquisa em Leucemia Infantil e Câncer e Filantropia Perpétua. W.J.L é apoiado por uma Bolsa Simon Lee e uma bolsa de pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, e do Cancer Council WA.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Seringa de insulina de calibre 26 0,5 mLBecton Dickinson, Austrália326769Nenhum
2-MercaptoetanolLife Technologies Australia Pty Ltd21985023Nenhum
Máquina de gás anestésicoDarvall Vet, AustráliaSKU: 2848Nenhum
Anti-CTLA-4BioXcell, EUABE0164Nenhum
Anti-PD-1BioXcell, EUABP0273Nenhum
Injeção de cloridrato de buprenorfina, 0,3 mg / mLRB healthcare UK Limited, Reino Unido55175Pedido de prescrição
Esfoliação cirúrgica de clorexidina 4%Perigo Austrália, AustráliaCHL01449F (esfoliaçãoNenhum
Soro fetal bovinoCellSera, AustráliaAU-FBS-PGNenhum
Fórceps fino 10,5 cmCasa cirúrgica, AustráliaOcidentalCC74110Nenhum
Fórceps Fine 12 cm SerrilhadoCasa cirúrgica, Austrália OcidentalCC74212Nenhum
Fórceps Halsted 14 cmCasa cirúrgica, Austrália OcidentalCD01114Nenhum
Câmara de aquecimentoDatesand Ltd, Reino UnidoMini-ThermacageNenhum
HEPES (1M)Life Technologies Australia Pty Ltd15630080Nenhum
IsofluranoHenry Schein Animal Health, AustráliaSKU: 29405Pedido de prescrição
Pomada Lubrificante para os OlhosAlconn/aNenhum
Penicilina/estreptomicina 1000XLife Technologies Australia Pty Ltd15140122Nenhum
Solução Tamponada com Fosfato 10xLife Technologies Australia Pty Ltd70013-032Nenhum
Reflexo 7mm ClipsCapaz científico, AustráliaAS59038Nenhum
Aplicador de clipe de ferida Reflex 7mmCapaz científico, AustráliaAS59036Nenhum
Removedor de clipe de ferida ReflexCapaz científico, AustráliaAS59037Nenhum
Circuito respiratório de anestesia Qube para roedoresDarvall Vet, Austrália#7885Nenhum
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Médio + L-glutaminaLife Technologies Australia Pty Ltd21870092Nenhuma
Tesoura Iris STR 11 cmCasa cirúrgica, Austrália OcidentalKF3211Nenhuma
Tesoura Iris STR 9 cmCasa cirúrgica, Austrália OcidentalJH4209Nenhuma
Câmara de indução pequenaDarvall Vet, AustráliaSKU: 9630Nenhum
TrypLE express 1xLife Technologies Australia Pty Ltd12604-021Nenhum
Germinador 500 Esterilizador de Contas de VidroCellpoint Scientific Inc., EUA5-1460-DK

References

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Soft Tissue SarcomaMouse ModelIncomplete ResectionTumor DebulkingWound HealingAdjuvant TherapyCheckpoint BlockadeAnti CTLA 4Anti PD 1Flow Cytometry

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