Micropadronização simples de células únicas sem litografia usando estêncil cortado a laser

Soah Lee; Huaxiao Yang; Caressa Chen; Sneha Venkatraman; Adrija Darsha; Sean  M. Wu; Joseph  C. Wu; Timon Seeger

doi:10.3791/60888

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Artigo de método

Micropadronização simples de células únicas sem litografia usando estêncil cortado a laser

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DOI:

10.3791/60888

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3 de abril de 2020

Soah Lee^*¹^,²^,³ , Huaxiao Yang^*¹^,²^,³ , Caressa Chen^*¹^,²^,³ , Sneha Venkatraman¹^,²^,³ , Adrija Darsha¹^,²^,³ , Sean M. Wu¹^,²^,³ , Joseph C. Wu¹^,²^,³ , Timon Seeger¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, ²Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University, ³Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, ⁴Department of Medicine III, University Hospital Heidelberg, ⁵German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Heidelberg/Mannheim

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo introduz um método de micropadronização livre de litografia que é simples e acessível para aqueles com um fundo de bioengenharia limitado. Este método utiliza estêncil personalizado de corte a laser para micropadrão proteínas de matriz extracelular em uma forma de interesse para modulação de morfologias celulares. O procedimento de micropadronização é demonstrado usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

Resumo

As técnicas de micropadronização têm sido amplamente utilizadas na biologia celular para estudar efeitos do controle da forma e do tamanho das células na determinação do destino celular na resolução de uma única célula. As técnicas atuais de micropadronização de células únicas de última geração envolvem litografia suave e impressão de micro-contato, que é uma tecnologia poderosa, mas requer habilidades de engenharia treinadas e certo suporte de instalações na microfabricação. Essas limitações requerem uma técnica mais acessível. Aqui, descrevemos um método alternativo sem litografia: padronização de células simples baseadas em estêncil. Fornecemos procedimentos passo a passo, incluindo design de estêncil, fabricação de hidrogel de poliacrilamida, incorporação de proteína à base de estêncil e revestimento celular e cultura. Este método simples pode ser usado para padronizar uma matriz de até 2.000 células. Demonstramos a padronização de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos únicos (hiPSC) com formas celulares distintas, de um quadrado de 1:1 a um retângulo adulto semelhante a cardiomiócitos de 7:1. Esta padronização de células únicas baseada em estêncil é livre de litografia, tecnicamente robusta, conveniente, barata e, mais importante, acessível àqueles com um fundo de bioengenharia limitado.

Introdução

O advento dos hiPSCs e o subsequente desenvolvimento de protocolos para sua diferenciação direcionada em diferentes tipos celulares permitiram estudar o desenvolvimento e a doença em nível molecular e específico do paciente, especificamente utilizando cardiomiócitos iPSC derivados do paciente (iPSC-CMs) para modelar cardiomiopatias¹^,². No entanto, uma grande limitação ao estudo do desenvolvimento e fisiologia utilizando o sistema iPSC e outros modelos in vitro é a ausência de um microambiente estruturado. In situ, as células são submetidas às restrições da matriz extracelular (ECM), bem como das células vizinh....