Detalhamos um método simples para produzir filmes de lapso de tempo de alta resolução de enxames pseudomonas aeruginosa que respondem a bacteriófagos (phage) e estresse antibiótico usando um scanner de documentos de leito. Este procedimento é um método rápido e simples de monitoramento da dinâmica do enxame e pode ser adaptado para estudar a motilidade e o crescimento de outras espécies bacterianas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Imagem de lapso de tempo de enxames bacterianos e a resposta ao estresse coletivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Swarming é uma forma de motilidade superficial observada em muitas espécies bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli. Aqui, populações densas de bactérias se movem por grandes distâncias em comunidades características em forma de tendril ao longo das horas. O enxame é sensível a vários fatores, incluindo umidade média, umidade e teor de nutrientes. Além disso, a resposta ao estresse coletivo, observada em P. aeruginosa que são estressadas por antibióticos ou bacteriófagos (phage), repele enxames de aproximação da área que contém o estresse. Os métodos descritos aqui abordam como controlar os fatores críticos que afetam o enxame. Introduzimos um método simples para monitorar a dinâmica do enxame e a resposta ao estresse coletivo com alta resolução temporal usando um scanner de documentos de leito, e descrevemos como compilar e realizar uma análise quantitativa de enxames. Este método simples e econômico fornece quantificação precisa e bem controlada do enxame e pode ser estendido a outros tipos de ensaios de crescimento baseados em placas e espécies bacterianas.
Introdução
Swarming é uma forma coletiva de motilidade bacteriana coordenada que aumenta a resistência a antibióticos e a produção de fatores de virulência no hospedeiro1,2,3. Esse comportamento multicelular ocorre em superfícies semi-sólidas que se assemelham às das camadas mucosas que cobrem membranas epiteliais nos pulmões4,5. Os biosurfactantes são comumente produzidos por populações de enxame para superar a tensão superficial nas superfícies e a produção destes é regulada por sistemas complexos de sinalização celular-célula....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparando placas de ágar de enxame para P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
- Prepare 1 L de mídia mínima 5x M8 em uma garrafa de vidro adicionando 64 g de Na2HPO4•7H2O, 15 g de KH2PO4, e 2,5 g de NaCl em 500 mL de água dupla destilada (ddH2O). Ajuste o volume final para 1 L com ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar e armazenar mídia líquida à temperatura ambiente.
- Prepare 100 mL de 1 M MgSO4 (sulfato de magnésio) em uma garrafa de vidro adicionando 24,6 g de MgSO4•7H2O em 50 mL ddH2O. Ajuste o volume final....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Os passos para o crescimento de P. aeruginosa,estresse as células e imagem as placas de ágar enxame estão representados na Figura 1. Inoculamos uma única colônia de cepa de P. aeruginosa UCBPP-PA14 do tipo LB-ágar em 2 mL de caldo LB durante a noite a 37 °C e avistamos 5 μL no centro da placa de ágar. A imagem de lapso de tempo desta placa revela o crescimento inicial na forma de uma colônia no centro e, em seguida, a propagação de tendões radialmente da colônia(Vídeo 1.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo se concentra em minimizar a variabilidade no enxame de placas de ágar e fornecer um método simples e de baixo custo para adquirir imagens de lapso de tempo de P. aeruginosa e responder ao estresse. Este procedimento pode ser estendido à imagem de outros sistemas bacterianos, adaptando a composição da mídia e as condições de crescimento. Para P. aeruginosa,embora m9 ou fab médio mínimo possa ser usado para induzir o enxame16,21, o .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
J.-L.B., A.S., e N.M.H-K. escreveu e revisou o manuscrito. Todos os autores projetaram os experimentos. J.-L.B. realizou os experimentos e análises. Este trabalho foi apoiado pelo prêmio NIH K22AI112816 e R21AI139968 bolsa para a A.S. e pela Universidade da Califórnia. N.M.H-K. foi apoiado pela Lundbeck Fellowships R220-2016-860 e R251-2017-1070. Os financiadores não tiveram papel na decisão de submeter o trabalho à publicação. Não temos interesses concorrentes para declarar.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| Ágar Bacto, desidratado | BD Difco | 214010 | Para placa de ágar LB e placa de ágar enxame |
| Ácidos Casamino | BD Difco | 223050 | Para meios de enxame |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. Para meios de enxameação |
| Sal dissódico de fosfomicina | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Concentração de estoque: 200 mg / mL. Dissolvido em ddH2O |
| Sulfato de gentamicina | Sigma-Aldrich | G1914 | Concentração de estoque: 3 mg/mL. Dissolvido em ddH2O |
| Sulfato de canamicina | Sigma-Aldrich | 60615 | Concentração de estoque: 100 mg/mL. Dissolvido em ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | Para caldo LB e placas de ágar LB |
| Sulfato de magnésio heptahidratado | Sigma-Aldrich | 230391 | Para meios de enxame |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma-Aldrich | P0662 | Para 5x meios M8 |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S9888 | Para 5x meios |
| M8Fosfato de sódio dibásico heptahidratado | Fisher Chemical | S373 | Para 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 cepa |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| < strong>Suprimentos | |||
| Lixa de óxido de alumínio | 3M | 150 Fine | Para tampas pretas |
| Tecido preto | Joann | PRD7089 | Tecido preto |
| Tinta spray preta | Krylon | 5592 Matte Black | Para tampas pretas |
| Frasco Erlenmeyer | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Garrafas de armazenamento de vidro | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1.000 mL |
| 8 polegadas braçadeiras | Gardner Bender | E173770 | Para fixação de placas de Petri de tecido preto fosco |
| (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm |
| Varetas de madeira | Fisher | 23-400-102 | Para estrias e inoculação de bactérias |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | Para esterilização de reagentes |
| Pipeta de 25 mL | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | Para pipetar 20 mL para placas de ágar enxame |
| Desumidificador | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | Para manter a umidade relativa do ambiente em cerca de 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software para análise de imagem |
| Incubadora | VWR | 89032-092 | Para crescimento de bactérias a 37 &graus; C |
| Isotemp banho-maria | Fisher | 15-462-21Q | Para meios de resfriamento até 55 &graus; C |
| Capa de fluxo laminar | The Baker Company | SG603A | Para placas de secagem |
| P-20 pipeta | Gilson | F123601 | Detecção em placas de ágar enxame |
| Controlador de pipeta | BrandTech | accu-jet | Para pipetar 20 mL para placas de ágar enxame |
| Tambor de rolo | New Brunswick | TC-7 | Para crescimento de bactérias a 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner para placas de imagem |
| Software de automação do scanner | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | Para 30 min de imagem interna |
| Software de aquisição de imagem do scanner | Epson | v9.9.2.5US | Software para placas de imagem |
Referências
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
