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Artigo de método

Imagem de lapso de tempo de enxames bacterianos e a resposta ao estresse coletivo

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⸱

DOI:

10.3791/60915

⸱

23 de maio de 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

Neste artigo

Resumo

Detalhamos um método simples para produzir filmes de lapso de tempo de alta resolução de enxames pseudomonas aeruginosa que respondem a bacteriófagos (phage) e estresse antibiótico usando um scanner de documentos de leito. Este procedimento é um método rápido e simples de monitoramento da dinâmica do enxame e pode ser adaptado para estudar a motilidade e o crescimento de outras espécies bacterianas.

Resumo

Swarming é uma forma de motilidade superficial observada em muitas espécies bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli. Aqui, populações densas de bactérias se movem por grandes distâncias em comunidades características em forma de tendril ao longo das horas. O enxame é sensível a vários fatores, incluindo umidade média, umidade e teor de nutrientes. Além disso, a resposta ao estresse coletivo, observada em P. aeruginosa que são estressadas por antibióticos ou bacteriófagos (phage), repele enxames de aproximação da área que contém o estresse. Os métodos descritos aqui abordam como controlar os fatores críticos que afetam o enxame. Introduzimos um método simples para monitorar a dinâmica do enxame e a resposta ao estresse coletivo com alta resolução temporal usando um scanner de documentos de leito, e descrevemos como compilar e realizar uma análise quantitativa de enxames. Este método simples e econômico fornece quantificação precisa e bem controlada do enxame e pode ser estendido a outros tipos de ensaios de crescimento baseados em placas e espécies bacterianas.

Introdução

Swarming é uma forma coletiva de motilidade bacteriana coordenada que aumenta a resistência a antibióticos e a produção de fatores de virulência no hospedeiro1,2,3. Esse comportamento multicelular ocorre em superfícies semi-sólidas que se assemelham às das camadas mucosas que cobrem membranas epiteliais nos pulmões4,5. Os biosurfactantes são comumente produzidos por populações de enxame para superar a tensão superficial nas superfícies e a produção destes é regulada por sistemas complexos de sinalização celular-célula, também conhecidos como detecção de quórum6,7,8. Muitas espécies de bactérias são capazes de enxame, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Escherichia coli9,10,11,12. Os padrões de enxame criados pelas bactérias são diversos e são afetados pelas propriedades físicas e químicas da camada superficial, incluindo composição de nutrientes, porosidade e umidade13,14. Além das propriedades superficiais, a temperatura de crescimento e a umidade ambiente afetam vários aspectos da dinâmica do enxame, incluindo a taxa de enxame e os padrões12,,13,,14,15. As variáveis de crescimento que afetam o enxame criam desafios que impactam a reprodutibilidade experimental e a capacidade de interpretar resultados. Aqui, descrevemos um método padronizado simples para monitorar a dinâmica dos enxames bacterianos através de imagens de lapso de tempo. O método descreve como controlar condições críticas de crescimento que afetam significativamente a progressão do enxame. Comparado com os métodos tradicionais de análise de enxames, este método de imagem de lapso de tempo permite rastrear a motilidade de múltiplos enxames simultaneamente durante longos períodos de tempo e com alta resolução. Esses aspectos melhoram a profundidade dos dados que podem ser obtidos a partir do monitoramento de enxames e facilitam a identificação de fatores que afetam o enxame.

O enxame em P. aeruginosa é facilitado através da produção e liberação de rhamnolipids e ácidos alcalinoicos 3-(3-hidroxialnoyloxy)na área circundante6,16. A introdução de estresse a partir de concentrações subletais de antibióticos ou infecção pelo vírus phage impacta a organização de enxames. Em particular, essas tensões induzem p. aeruginosa a liberar a molécula de detecção de quórum 2-heptyl-3-hidroxi-4-quinolone, também conhecida como sinal de quinolone pseudomonas (PQS)17,18. Em ensaios de enxame que contêm duas populações de enxames, o PQS produzido pela população induzida pelo estresse repele enxames não tratados de entrar na área que contém o estresse (Figura 1). Esta resposta coletiva de estresse constitui um sistema de sinalização de comunicação de perigo que alerta P. aeruginosa sobre ameaças próximas18,19. Os efeitos do estresse em P. aeruginosa,a ativação da resposta ao estresse coletivo e a repulsa dos enxames podem ser visualizados usando o método de imagem de lapso de tempo descrito aqui. O protocolo descrito aqui explica como: (1) preparar placas de ágar para enxame, (2) cultura P. aeruginosa para dois tipos de ensaios (ensaios tradicionais de enxame ou ensaios de resposta ao estresse coletivo) (Figura 1), (3) adquirir imagens de lapso de tempo, e (4) usar ImageJ para compilar e analisar as imagens.

Resumidamente, P. aeruginosa de uma cultura noturna é vista no meio de uma placa de ágar, enquanto P. aeruginosa que são infectados com phage ou tratados com antibióticos são vistos nas posições do satélite. A progressão do enxame de P. aeruginosa é monitorada em um scanner de fundo de documento de consumo que é colocado em uma incubadora de 37 °C regulada pela umidade. O scanner é controlado por um software que verifica automaticamente as placas em intervalos regulares durante o período de crescimento do enxame, tipicamente de 16 a 20 h. Este método produz vídeos de lapso de tempo simultâneos de até seis placas de enxame de 10 cm. As imagens são compiladas em filmes e a repulsa de enxames por populações induzidas pelo estresse é quantificada usando o software ImageJ livremente disponível. Considerações especiais são dadas para garantir consistência e reprodutibilidade entre diferentes experimentos de enxame.

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Protocolo

1. Preparando placas de ágar de enxame para P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging

  1. Prepare 1 L de mídia mínima 5x M8 em uma garrafa de vidro adicionando 64 g de Na2HPO4•7H2O, 15 g de KH2PO4, e 2,5 g de NaCl em 500 mL de água dupla destilada (ddH2O). Ajuste o volume final para 1 L com ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar e armazenar mídia líquida à temperatura ambiente.
  2. Prepare 100 mL de 1 M MgSO4 (sulfato de magnésio) em uma garrafa de vidro adicionando 24,6 g de MgSO4•7H2O em 50 mL ddH2O. Ajuste o volume final para 100 mL com ddH adicional2O. Autoclave para esterilizar. Armazene à temperatura ambiente.
  3. Prepare 100 mL de 20% de ácidos casamino em uma garrafa de vidro adicionando 20 g de ácidos casamino em 50 mL ddH2O. Ajuste o volume final para 100 mL com ddH adicional2O. Autoclave para esterilizar. Armazene à temperatura ambiente.
  4. Prepare 100 mL de 20% de glicose em uma garrafa de vidro adicionando 20 g de glicose em 50 mL ddH2O. Ajuste o volume final para 100 mL com ddH adicional2O. Esterilizar por filtração com filtro de 0,22 μm. Armazene à temperatura ambiente.
  5. Para fazer 10 placas de ágar, adicione 1 g de ágar em 100 mL de ddH2O e ajuste o volume final para 160 mL com ddHadicional 2O em um frasco erlenmeyer de 250 mL. Esterilizar por autoclaving.
    1. Imediatamente após a autoclaving, coloque a solução de ágar em um banho de água de 55 °C por 15 min.
    2. Retire a solução ágar do banho de água e adicione 40 mL de 5x M8 de mídia mínima, 200 μL de 1 M MgSO4, 2 mL de 20% de glicose e 5 mL de 20% de casamino ácidos15. Siga para o passo 1.6 imediatamente após a mistura.
      NOTA: As concentrações finais são 0,5% ágar, 1 mM MgSO4, 0,2% glicose e 0,5% ácidos casamino.
  6. Usando uma pipeta de 25 mL para um volume consistente, adicione 20 mL da solução de ágar de enxame por placa de Petri de 10 cm de diâmetro.
    NOTA: Um volume fixo de solução ágar é importante, pois o volume afeta o tempo de secagem e o teor de umidade do ágar. Evite bolhas ao fazer as placas de ágar.
  7. Deixe o ágar solidificar colocando as placas de ágar em uma única pilha com tampas por 1 h no banco à temperatura ambiente. Ligue o desumidificador para diminuir a umidade relativa do quarto para 40-50% 1 h antes do próximo passo.
  8. Seque as placas de ágar enxame por mais 30 min com as tampas desligadas em uma capa de fluxo laminar a 300 pés3/min com 40-50% de umidade relativa a temperatura ambiente. Seque o interior das tampas colocando-as de frente para cima no capô de fluxo laminar. Armazene placas de ágar a 4 °C por até 24 h.
  9. Prepare as tampas da placa de Petri preta de 10 cm para a imagem, alisando o interior da tampa com lixa. Coloque as tampas dentro de uma caixa de embalagem e coloque a caixa de embalagem sob uma capa química. Borrife dentro das tampas usando tinta spray preto. Deixe as tampas secarem.
    NOTA: As tampas pretas podem ser reutilizadas para experimentos adicionais. É importante que as tampas sejam pintadas para que não reflitam a luz durante a varredura.

2. Crescimento das Condições de P. aeruginosa e Revestimento

  1. Prepare 400 mL de caldo de linsogenia (LB) adicionando 10 g de mistura de pó LB-Miller em 400 mL ddH2O. Para 2% de pratos LB-agar Petri, adicione mais 8 g de ágar. Autoclave para esterilizar.
  2. Despeje 20 mL de meio LB-ágar derretido em placas de Petri de 10 cm de diâmetro e permita que elas solidifiquem à temperatura ambiente durante a noite. Armazene a mídia líquida à temperatura ambiente e placas de ágar a 4 °C.
  3. Streak P. aeruginosa em uma placa DE LB-ágar Petri de um estoque congelado armazenado a -80 °C usando laços estéreis ou varas de madeira. Incubar a placa de Petri de cabeça para baixo durante a 37 °C. Armazene a placa LB-ágar a 4 °C por até 1 semana.
  4. Escolha uma única colônia da placa de Petri com um laço estéril ou vara de madeira, inocule-a em meio de 2 mL LB e incuba r$ 100 a 100 rpm.
  5. Pipet 5 μL de cultura noturna a partir do passo 2.4 usando uma tubulação P20 e ponto no centro da placa de ágar de enxame, aproximando-se da ponta da tubulação em um ângulo (10-45°) 2,5 cm acima da área de manchas, pipetando até a primeira parada, e tocando o ágar com apenas a gota de líquido(Figura 1B).
    1. Evite tocar o ágar com a ponta da tubulação, pois danifica o ágar. Use um modelo para posicionar o ponto de forma consistente em diferentes placas de ágar(Figura Suplementar S1).
    2. Para ensaios tradicionais de enxame, use apenas o ponto central e pule para o passo 2.8. Para ensaios de resposta ao estresse coletivo continuam a passo 2.6 (para infecção por phage) ou passo 2.7 (para estresse antibiótico).
  6. Para infecção por phage, misture 30 μL de cultura noturna de P. aeruginosa a partir do passo 2.4 com 6 μL de 1 x 1012 pfu/mL phage DMS3vir20. Vá imediatamente para o próximo passo.
    1. Pipet 6 μL do P. aeruginosa-phage mistura do passo 2.6 usando um tubo P20 e avista em 6 posições de satélite equidistantes em um círculo concêntrico de raio de 2,8 cm que está centrado na placa de Petri, aproximando-se da ponta da tubulação em um ângulo (10 a 45°) 2,5 cm acima da área de manchas, pipetando até a primeira parada, e tocando o ágar com apenas a gota líquida(Figura 1C).
    2. Evite tocar o ágar com a ponta da tubulação, pois danifica o ágar. Use um modelo de chapeamento para obter consistência(Figura Suplementar S1). Prossiga para o passo 2.8.
  7. Para tratamentos antibióticos, misture 30 μL de cultura noturna P. aeruginosa do passo 2.4 com 6 μL de gentamicina de 3 mg/mL, 10 μL de 100 mg/mL de kanamicina, ou 7,5 μL de 100 mg/mL de fosfomicina. Vá imediatamente para o próximo passo.
    1. Pipet 6 μL de antibiótico tratado P. aeruginosa a partir do passo 2.7 usando uma pipeta P20 e avistaem 6 posições de satélite equidistantes em um círculo concêntrico de raio de 2,8 cm sobre o centro do prato,Figure 1Daproximando-se da ponta da tubulação em um ângulo (10 a 45°) 2,5 cm acima da área de manchas, pipetando até a primeira parada, e tocando o ágar com apenas a gota de euro
    2. Evite tocar o ágar com a ponta da tubulação, pois danifica o ágar. Use um modelo de chapeamento para obter consistência(Figura Suplementar S1). Prossiga para o passo 2.8.
  8. Substitua as tampas claras da placa de Petri por tampas pretas feitas na etapa 1.9 (Figura 2A).
  9. Coloque as placas de ágar em um scanner em uma incubadora fixada a 37 °C com um banho de água de 10 L para manter a umidade em 75%(Figura 1E, Figura 2B).
    ATENÇÃO: Não perturbe as células manchadas nas placas de ágar. Mantenha as placas viradas para cima o tempo todo.

3. Aquisição de imagem com scanner

  1. Diminua a iluminação ambiente das placas de Petri anexando tecido fosco preto a um rack 40-60 cm acima do scanner de documentos. Fixá-lo usando zip ties(Figura 2B).
  2. O scanner será controlado usando um software de digitalização e um software automático de script.
    1. No software de digitalização, selecione Modo Home (Figura 3A). Capturar imagens em cores selecionando Cor em Tipo de Imagem. Para definir a qualidade da imagem, selecione Outros em Destino e ajuste a Resolução para 300 dpi. Mantenha o tamanho padrão das imagens selecionando Original para Tamanho de Destino. Deixe todas as opções em Ajustes de Imagem sem controle para a qualidade padrão da imagem.
      NOTA: O tamanho do destino é definido como Original por padrão. Para selecionar outras opções para Tamanho de destino, clique em Visualizar primeiro.
  3. Defina o caminho de salvamento das imagens clicando no ícone da pasta à direita de Scan para abrir Configurações de salvamento de arquivos(Figura 3A).
    1. Selecione o destino da pasta para salvar imagens selecionando Outros em Localização e clique em Procurar. Escolha uma pasta para salvar as imagens.
    2. Nomeie as imagens na caixa de texto Prefixo. Defina o número de início 001 para iniciar a seqüência de nomeação para as imagens. Defina o formato do arquivo como JPEG escolhendo JPEG (*.jpg) para Tipo em Formato de Imagem e clique em Opções para ajustar para Detalhes. Defina a qualidade do formato de imagem ajustando o nível de compressão para 16, codificando como padrão e verifique O perfil DE Incorporar ICC. Clique em OK para fechar a janela(Figura 3B).
    3. Deixe a primeira opção sem verificação ("Substituir qualquer arquivo com o mesmo nome") e marque as 3 opções seguintes ("Mostrar esta caixa de diálogo antes da próxima digitalização", "Abrir pasta de imagem após a varredura" e "Mostrar caixa de diálogo Adicionar página após a digitalização"). Clique em OK para fechar a janela
    4. Verifique a qualidade da imagem clicando em Visualizar. A janela de visualização aparece e o ícone Scan torna-se funcional(Figura 3C).
  4. Use o software de scriptpara automatizar a aquisição de imagens. O script fornecido clica em Scan na janela Scan e OK na janela Configurações de salvamento de arquivos em intervalos de 30 minutos.
    1. Importe o script clicando em Tarefa | Importe e selecione Single_scan.tsk e Idle_scanning.tsk (arquivos TSK fornecidos como Arquivos Suplementares 1 e 2). Ver Figura 3D.
      NOTA: Single_scan.tsk clica no botão Scan na janela Scan e OK na janela Configurações de salvamento de arquivos. Idle_scanning.tsk ativa Single_scan.tsk a cada 30 min. Pode-se alterar a freqüência de varredura alterando a ativação de Idle_scanning.tsk.
    2. Habilite a digitalização automática em intervalos de 30 minutos selecionando tanto a digitalização ociosa (importada) quanto a digitalização única (importada),clicando com o botão direito do mouse na digitalização ociosa (importada)e clique à esquerda em Ativado (Figura 3D, Figura Suplementar S2).
      NOTA: A varredura automática é executada até que o usuário pare manualmente o script. Para parar o script, selecione Varredura ociosa (importada), clique com o botão direito do mouse Ocioso (importado)e clique com o botão esquerdo em Ativado. A marca de verificação será removida.

4. Compilando imagens de lapso de tempo e medindo repulsão de enxame

  1. Realize a edição de filmes e a análise de imagens usando imageJ.
  2. Importe todas as imagens digitalizadas para imagej clicando em Arquivo | Importação | Seqüência de imagens e selecione as imagens. Na janela Opções de seqüência, verifique Converter para RGB para manter as imagens coloridas. O número de imagens indica o número de imagens selecionadas.
  3. Mantenha a imagem inicial em 1 para começar a partir da primeira imagem na pasta e Dimensionar imagens em 100% para conservar o tamanho original das imagens. Deixar Usar pilha virtual sem controle. Clique em OK e aguarde a carga das imagens(Figura 4A).
  4. Defina o nível de compactação de vídeo para 100 clicando em Editar | Opções | Entrada/saída... e ajustar a qualidade JPEG para 100.
  5. Salvar o arquivo como um .avi clicando em Arquivo | Salvar como | Avi. Ajuste a compressão para JPEG e taxa de quadros para 5 fps(Figura 4B). Salve o lapso de tempo .avi na pasta desejada.
  6. Para quantificar as distâncias de repulsão do enxame, abra uma imagem perto do final do período de enxame no ImageJ. Clique em Arquivo | Abra e selecione a imagem. Ajuste a escala clicando em Analisar | Definir escala e configuração Distância em pixels para 118, distância conhecida para 1, proporção de Pixel para 1,0 e unidade de comprimento para cm(Figura 4C). Deixe a Global desmarcada. Clique em OK para fechar a janela.
  7. Clique no ícone Straight e meça do centro da colônia na posição do satélite até a borda da população. Selecione Analisar | Medir para fazer aparecer uma nova janela com as medidas (Comprimento) (Figura 4D).
    NOTA: Use "+" para aproximar e "-" para diminuir o zoom.

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Resultados

Os passos para o crescimento de P. aeruginosa,estresse as células e imagem as placas de ágar enxame estão representados na Figura 1. Inoculamos uma única colônia de cepa de P. aeruginosa UCBPP-PA14 do tipo LB-ágar em 2 mL de caldo LB durante a noite a 37 °C e avistamos 5 μL no centro da placa de ágar. A imagem de lapso de tempo desta placa revela o crescimento inicial na forma de uma colônia no centro e, em seguida, a propagação de tendões radialmente da colônia(Vídeo 1...

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Discussão

Este protocolo se concentra em minimizar a variabilidade no enxame de placas de ágar e fornecer um método simples e de baixo custo para adquirir imagens de lapso de tempo de P. aeruginosa e responder ao estresse. Este procedimento pode ser estendido à imagem de outros sistemas bacterianos, adaptando a composição da mídia e as condições de crescimento. Para P. aeruginosa,embora m9 ou fab médio mínimo possa ser usado para induzir o enxame16,21, o ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

J.-L.B., A.S., e N.M.H-K. escreveu e revisou o manuscrito. Todos os autores projetaram os experimentos. J.-L.B. realizou os experimentos e análises. Este trabalho foi apoiado pelo prêmio NIH K22AI112816 e R21AI139968 bolsa para a A.S. e pela Universidade da Califórnia. N.M.H-K. foi apoiado pela Lundbeck Fellowships R220-2016-860 e R251-2017-1070. Os financiadores não tiveram papel na decisão de submeter o trabalho à publicação. Não temos interesses concorrentes para declarar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes
Ágar Bacto, desidratadoBD Difco214010Para placa de ágar LB e placa de ágar enxame
Ácidos CasaminoBD Difco223050Para meios de enxame
D-GlucoseFisher ChemicalD16500Dextrose. Para meios de enxameação
Sal dissódico de fosfomicinaTokyo Chemical IndustryF0889Concentração de estoque: 200 mg / mL. Dissolvido em ddH2O
Sulfato de gentamicinaSigma-AldrichG1914Concentração de estoque: 3 mg/mL. Dissolvido em ddH2O
Sulfato de canamicinaSigma-Aldrich60615Concentração de estoque: 100 mg/mL. Dissolvido em ddH2O
LB-MillerBD Difco244620Para caldo LB e placas de ágar LB
Sulfato de magnésio heptahidratadoSigma-Aldrich230391Para meios de enxame
Fosfato de potássio monobásicoSigma-AldrichP0662Para 5x meios M8
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9888Para 5x meios
M8Fosfato de sódio dibásico heptahidratadoFisher ChemicalS373Para 5x M8 media
Strains
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn labAFS27E.118PA14 cepa
DMS3virO'Toole labDMS3vir20Bacteriophage
< strong>Suprimentos
Lixa de óxido de alumínio3M150 FinePara tampas pretas
Tecido pretoJoannPRD7089Tecido preto
Tinta spray pretaKrylon5592 Matte BlackPara tampas pretas
Frasco ErlenmeyerKimax26500250 mL
Garrafas de armazenamento de vidroPyrex13951L250 mL, 500 mL, 1.000 mL
8 polegadas braçadeirasGardner BenderE173770Para fixação de placas de Petri de tecido preto fosco
(100 mm x 15 mm)FisherFB0875712100 mm x 15 mm
Varetas de madeiraFisher23-400-102Para estrias e inoculação de bactérias
Equipment
AutoclaveMarket Forge IndustriesSTM-EPara esterilização de reagentes
Pipeta de 25 mLUSA Scientific, Inc.1072-5410Para pipetar 20 mL para placas de ágar enxame
DesumidificadorFrigidaireFAD704DWD 70-pintPara manter a umidade relativa do ambiente em cerca de 45%
ImageJNIHv1.52aSoftware para análise de imagem
IncubadoraVWR89032-092Para crescimento de bactérias a 37 &graus; C
Isotemp banho-mariaFisher15-462-21QPara meios de resfriamento até 55 &graus; C
Capa de fluxo laminarThe Baker CompanySG603APara placas de secagem
P-20 pipetaGilsonF123601Detecção em placas de ágar enxame
Controlador de pipetaBrandTechaccu-jetPara pipetar 20 mL para placas de ágar enxame
Tambor de roloNew BrunswickTC-7Para crescimento de bactérias a 100 rpm
ScannerEpsonEpson Perfection V370 PhotoScanner para placas de imagem
Software de automação do scannerRoboTask Litev7.0.1.932Para 30 min de imagem interna
Software de aquisição de imagem do scannerEpsonv9.9.2.5USSoftware para placas de imagem
Placas de poliestireno

Referências

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