Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila

Resumo

Drosophila é um modelo experimental amplamente utilizado adequado para o rastreamento de medicamentos com aplicações potenciais para a terapia do câncer. Aqui, descrevemos o uso de fenótipos de cor dos olhos variegated drosophila como um método para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina.

Resumo

Drosophila é um excelente organismo modelo que pode ser usado para testar compostos que podem ser úteis para a terapia do câncer. O método descrito aqui é um método econômico in vivo para identificar compostos promotores de heterocromatina usando Drosophila. A cepa DX1 da Drosophila, tendo um fenótipo de cor dos olhos variegated que reflete as extensões da formação de heterocromatina, fornecendo assim uma ferramenta para uma tela de drogas promotora de heterocromatina. Neste método de triagem, a variegação ocular é quantificada com base na área superficial da pigmentação vermelha ocupando partes do olho e é pontuada em uma escala de 1 a 5. O método de triagem é simples e sensível e permite testar compostos in vivo. O rastreamento de medicamentos usando este método fornece uma maneira rápida e barata de identificar drogas promotoras de heterocromatina que poderiam ter efeitos benéficos na terapêutica do câncer. Identificar compostos que promovam a formação de heterocromatina também pode levar à descoberta de mecanismos epigenéticos do desenvolvimento do câncer.

Introdução

Heterocromatina é uma forma condensada de DNA que desempenha um papel central na expressão genética, na regulação da segregação do cromossomo durante a divisão celular, e na proteção contra a instabilidade do genoma¹. A heterocromatina tem sido considerada um regulador de repressão genética e para proteger a integridade do cromossomo durante a mitose celular^2,3. Está associada à di e trimetilação da histona H3 lysina 9 (H3K9me) durante o compromisso de linhagem^4,5. Além disso, o recrutamento de proteína heterocromatina 1 (HP1) proteínas de cromodomínio também é considerado associado com heterocromatina e repressão epigenética da expressão genética⁶. Essas proteínas são componentes essenciais e marcadores da formação de heterocromatina.

Uma vez que a instabilidade genômica permite que as células adquiram alterações genéticas que promovam a carcinogênese, a heterocromatina está se tornando mais reconhecida no desenvolvimento do câncer e pode ser direcionada para o tratamento do câncer^7,8. Atualmente, não existem drogas bem estabelecidas para auxiliar a formação de heterocromatina. Aqui, apresentamos um método simples e rápido, mas eficiente, para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina. A triagem é feita tratando Drosophila com uma biblioteca de drogas de pequenas moléculas. Este método aproveita um fenótipo de cor dos olhos variegated na cepa DX1Drosophila que é influenciada pelos níveis de heterocromatina. As moscas DX1 contêm uma matriz tandem de sete transgenes P[lac-w], que têm a expressão variegated/depressão dependendo da heterocromatização, portanto, a extensão da variegação na cor dos olhos reflete o nível de heterocromatina. Especificamente, o aumento da heterocromatina poderia ser detectado pela proporção crescente da cor variegated dos olhos (olho branco). Pelo contrário, a diminuição da heterocromatina seria detectada pela proporção crescente da expressão transgênica P[lac-w] (olho vermelho)^9,,10,,11,12.

Portanto, aproveitamos este sistema transgênico drosophila que produz um fenótipo de cor dos olhos variegated, uma vez que sua expressão está diretamente correlacionada com a quantidade de heterocromatina presente. Após a descoberta de compostos suspeitos de promover a formação de heterocromatina, podemos confirmar essa suspeita usando outros métodos, como a mancha ocidental. Essas substâncias promotoras da heterocromatina podem ser desenvolvidas para ensaios clínicos em pacientes no futuro.

Protocolo

1. Preparação da biblioteca de drogas

1. Identifique e prepare uma biblioteca de medicamentos para ser examinada usando solvente apropriado em uma concentração desejada (por exemplo, 10 mM em DMSO).
   NOTA: Um exemplo específico para uma biblioteca de medicamentos é o Conjunto de Oncologia III do Programa de Terapêutica de Desenvolvimento (DTP) do Instituto Nacional de Câncer (NCI). Os compostos deste conjunto são fornecidos como 20 μL a 10 mM em 100% DMSO em duas placas de fundo de bpp de 96 poços e armazenados a -20 °C. Os mapas nci plate, e os dados químicos básicos de cada droga podem ser encontrados nos seguintes sites:
   Placa NCI número 4740
   Placa NCI número 4741

2. Tela para drogas promotoras de heterocromatina usando Drosophila

1. Drosophila Estratégia de reprodução (Figura 1A)
   1. Dia 1: Cruze três w¹¹¹⁸/Y; DX1/CyO moscas machos e três ou mais fêmeas virgens w¹¹¹⁸ moscas em um frasco alimentar de 25 mm x 95 mm com 9 mL de mídia alimentar drosophila padrão (receita Bloomington). Configure três frascos de réplica para cada droga e um controle para a tela.
      NOTA: As moscas DX1 foram gentilmente fornecidas por James Birchler (Universidade do Missouri)^9,13.
   2. Dia 2 e Dia 3: Deixe as moscas colocarem ovos por 2 dias à temperatura ambiente (22 °C).
   3. Dia 4: Use uma pequena rajada de gás CO₂ para anestesiar as moscas-dos-pais e descartar as moscas-dos-pais em um "necrotério voador" (uma garrafa contendo 70% de álcool).
2. Ração de drogas para Drosophila para triagem.
   1. Diluir cada composto da droga do estoque original (20 μL a 10 mM em 100% DMSO em placas de fundo de 96 poços PP U) para uma concentração final de 10 μM com 33% de DMSO em água. Use 33% de DMSO na água sem qualquer droga como controle.
      NOTA: Algumas drogas são pouco solúveis em água e foram dissolvidas em DMSO. 100% DMSO é tóxico para moscas. 33% é tolerável.
   2. Dia 4: Pipeta 60 μL de uma solução de droga de 10 μM ou controle sobre o topo da comida de mosca. Neste ponto, certifique-se de que as moscas-dos-pais foram removidas e há ovos de mosca e larvas de primeira estrela rastejando na comida.
   3. Dia 6: Repita a pipetação de 60 μL da mesma solução de 10 μM para o frasco de alimentos.
      NOTA: Uma vez que as drogas foram adicionadas ao alimento de mosca, o alimento de superfície superior contém quase 10 μM de concentração e o alimento inferior não poderia ser totalmente penetrado. Todas as moscas colocam ovos na parte superior da comida e comem os alimentos de superfície superior.
3. Observe e marque mudanças na cor dos olhos.
   1. Dois dias após as moscas da F-1 surgirem (aproximadamente no dia 14), examine as moscas. Use uma pequena rajada de CO₂ para anestesiar as moscas de F1 e remover as moscas de seu frasco em uma plataforma de dissecção porosa com CO₂ tomando por baixo de um papel filtro.
   2. Inspecione as moscas nesta almofada um microscópio de dissecção. Examine toda a mosca e identifique todas as w¹¹¹⁸/Y; Machos dX1/+ heterozigosos por não ter o fenótipo de asa encaracolada dominante cyo.
   3. Marcar a cor dos olhos de cada um dos w¹¹¹⁸/Y; DX1/+ heterozigos machos voam em uma escala de 1 a 5(Figura 1B). A porcentagem da cor dos olhos brancos foi classificada da seguinte forma:
      1. <5% de superfície total do olho espalhado vermelho
      2. 6% - 25% manchas vermelhas área total da superfície do olho
      3. 26% - 50% manchas vermelhas área total da superfície do olho
      4. 51% - 75% manchas vermelhas área total da superfície do olho
      5. >75% manchas vermelhas área total da superfície do olho
      NOTA: Alternativamente, homogeneize cabeças de mosca em 100% de metanol e use um espectrômetro para medir a pigmentação dos olhos em 450 nm. Selecione apenas os machos porque o PEV é mais pronoucado em machos DX1. Marque mais de 10 machos em cada frasco.
   4. Calcular o índice médio de cor de todos os machos de cada frasco pontuado. Realizar triplicados para cada composto(Figura 1C).
      NOTA: Uma vez que a cor dos olhos varia com a idade, este é um passo sensível ao tempo. A cor dos olhos deve ser calculada na mesma idade – 2 dias de idade. Normalmente >10 moscas devem ser pontuadas em cada frasco.
   5. Para confirmar que os compostos realmente promovem a formação de heterocromatina, use uma técnica diferente, como a mancha ocidental para validar (Figura 1G).

Resultados

Este protocolo foi usado com sucesso para tela de compostos que promovem a formação de heterocromatina em Drosophila, que é um sistema in vivo eficiente e de baixo custo para o desenvolvimento de medicamentos (Figura 1). Examinamos uma biblioteca de medicamentos de pequenas moléculas, oncology set III, que é composta de 97 medicamentos de oncologia autorizados pela FDA, usando a cepa DX1 de Drosophila melanogaster (Figura 1B

Discussão

Heterocromatina é uma forma condensada de DNA que desempenha um papel central na regulação da expressão genética. Está se tornando cada vez mais reconhecida no câncer e pode servir como um alvo potencial para a terapia do câncer^15,16,17,18. Compostos de pequenas moléculas são comumente usados no desenvolvimento de drogas devido a vantagens na fabricação, preservação e metabolismo em corpos huma...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Drosophila		DX1	DX1 foram gentilmente cedidas por James Birchler (Universidade de Missouri)
Drosophila mídia alimentar	UCSD cozinha de moscas
Metotrexato	NCI biblioteca
de medicamentos Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Etil álcool	Sigma	E7023-500ML

As moscas da cepa